농축 배양: 선택 및 차동 매체에서 호기성 및 혐기성 미생물 배양

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Enrichment Cultures: Culturing Aerobic and Anaerobic Microbes on Selective and Differential Medias

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09:35 min
April 30, 2023

개요

출처: 크리스토퍼 P. 코르보1,조나단 F. 블레이즈1,엘리자베스 수터1
1 생물과학부, 바그너 칼리지, 1 캠퍼스 로드, 스태튼 아일랜드 뉴욕, 10301

대핵 세포는 이 행성의 거의 모든 환경에 거주할 수 있습니다. 왕국으로서, 그들은 에너지 생성 (1)을 위해 분자의 다양한 사용할 수 있도록, 큰 신진 대사 다양성을 가지고. 따라서 실험실에서 이러한 유기체를 재배할 때 에너지를 만드는 데 필요한 모든 필요하고 구체적인 분자가 성장 매체에 제공되어야 합니다. 일부 유기체는 대사적으로 다양하지만, 다른 생물은 고온 또는 저온, 알칼리성 및 산성 pH, 감소 또는 산소 결석 환경 또는 높은 염(2,3,4)을 포함하는 환경과 같은 극단적인 환경에서 살아남을 수 있습니다. “극단적 인”이라고 불리는 이 유기체는 종종 이러한 강렬한 환경이 확산될 것을 요구합니다. 과학자들이 이러한 유기체를 성장시키고자 할 때, 미디어 구성 요소뿐만 아니라 특정 환경 조건은 모두 관심있는 유기체를 성공적으로 육성하기 위해 고려해야합니다.

과학자들은 그 종들이 성장해야 하는 특정 요구 사항을 이해하기 때문에 실험실에서 컬터류 유기체를 키울 수 있습니다. 그러나, 컬터류 유기체는 지구상에 있는 것으로 추정되는 종의 1% 미만을 차지합니다 (5). 유전자 시퀀싱에 의해 검출되었지만 실험실에서 성장할 수 없는 유기체는 헤비울 수 없는 것으로 간주됩니다(6). 이 때, 우리는 실험실에서 그들의 환경을 복제하기 위하여 이 유기체의 물질 대사 그리고 성장 조건에 관하여 충분히 모릅니다.

까다로운 유기체는 이전 둘 사이에 어딘가에 놓여 있습니다. 이 유기체는 culturable, 그러나 특정 성장 매체 분대 및/또는 특정 성장 조건과 같은 아주 특정 성장 조건을 요구합니다. 이러한 제네라의 두 가지 예는 Neisseria sp. 및 혈우병 스프., 둘 다 부분적으로 세분화 된 적혈구 (초콜릿 한천이라고도 함), 특정 성장 인자와 이산화탄소가 풍부한 환경 (7)을 필요로한다. 필요한 특정 구성 요소를 모두 사용하지 않으면 이러한 유기체는 전혀 성장하지 않습니다. 종종, 심지어 그들의 요구 사항의 모든, 이러한 유기체 가난한 성장.

유산소 또는 산소함유 산소에서만 자랄 수 있는 진핵세포와 달리, 환경, 원핵세포는 충분한 에너지를 생성하기 위해 여러 발효 경로를 사용하여 혐기성으로 성장할 수 있다(8). 다른 판핵생물은 마이크로에어로필릭, 또는 감소된 산소 환경, 또는 심지어 카노필릭, 또는 높은 이산화탄소 환경(9)을 선호한다. 이 유기체는 대기를 변경해야 하기 때문에, 풍부하게 하기 위하여 더 도전적입니다. 산소가 있는 환경에 민감한 유기체와 자주 작동하는 과학자들은 일반적으로 혐기성 챔버와 인큐베이터에서 작동하며, 아르곤과 같은 무겁고 불활성 가스가 산소(10)를 대체하기 위해 펌핑됩니다. 다른 사람들은 물을 사용하여 수소와 이산화탄소를 생성하는 기존의 밀봉 가스 패킷 시스템을 사용할 수 있으며 팔라듐과 같은 촉매와 함께 모든 대기 산소를 제거합니다. 이러한 시판되는 키트는 위에서 언급한 대기 조건(10)을 생성할 수 있습니다.

잠재적인 감염을 결정하기 위하여 병원체를 육성하거나 자연 환경에 존재하는 박테리아의 특정 종을 확인하기 위하여 찾고 있든, 1개의 문제가 있습니다. 아무도 세균성 종은 하나의 서식지에 거주하지 않습니다. 박테리아는 인간의 피부에서 지구의 바다에 이르기까지 사방에 다세포 공동체로 살고 있습니다 (11). 박테리아의 한 종을 격리하려고 할 때, 과학자는 또한 고립 된 지역에 살고있는 수많은 다른 유기체를 제외하기 위해 노력해야합니다. 이러한 이유로, 박테리아에 대 한 농축 된 성장 매체는 종종 두 가지 기능을 수행. 첫 번째는 미디어를 선택적으로 만드는 것입니다. 선택적 에이전트는 일부 종 성장 방지 할 것 이다, 억제 하지 않는 동안 종종 성장 하는 다른 사람을 촉진 (12). 미디어 성분의 두 번째 기능은 차동 제로 작용할 수 있다. 이러한 제제는 분리된 유기체의 특정 생화학적 특징을 식별할 수 있도록 허용한다. 몇몇 다른 선택적이고 차동적인 매체를 적당한 성장 조건과 결합해서, 과학자 및 진단자는 특정 격리에서 특정 세균종의 존재를 확인할 수 있습니다.

식별을 돕는 선택적 및 차동 매체의 한 예는 임상적으로 중요한 유기체 황색포도상구균의 경우이다. 이 유기체는 일반적으로 매니톨 소금 한천에 배양된다. 이 매체는 황색포도상구균과같은 일부 그램 양성을 포함하는 높은 소금 환경에서 살 수있는 유기체만을 선택할뿐만 아니라 소금에 민감한 유기체를 억제합니다. 매니톨 설탕은 이 매체의 차동 성분입니다. 모든 임상적으로 중요한 황색포도상구균중, 오직 S. 아우레우스만이 매니톨을 발효시킬 수 있다. 이러한 발효 반응은 매체의 적색 메틸 적색 표시등이 노란색으로 변하는 부산물로 산을 생성합니다. 다른 황색포도상구균 종 (예 : 황색 포도상 구균 표피증)은성장 할 수 있지만, 색상의 미디어를 빨간색으로 남겨 둡니다.

이 실험실 운동은 적절한 무균 기술뿐만 아니라 국물에서 성장 미디어의 적절한 접종을 보여줍니다. 또한 농축 매체에 대한 일반적인 오염 물질의 성장, 혐기성 박테리아에 대한 가스 패키지 혐기성 배양 시스템의 사용, 그리고 그램 양성 및 그람 음성 박테리아의 추정 식별을 위한 다른 선택적 및 차동 매체의 사용을 소개합니다.

Procedure

1. 준비 시작하기 전에 손을 철저히 씻고 적절한 크기의 장갑을 착용하십시오. 5% 나트륨 하이포염(표백제)으로 작업 표면을 살균하고 철저히 건조시다. 작업 하는 동안 벤치 상단을 만지지 않도록 빈 120 mL Erlenmeyer 플라스크에 접종 루프를 배치합니다. 2. 성장 미디어 및 문화 냉장고에서 매니톨 소금 한천(MSA), 에오신 메틸렌 블루 한천(EMB), 8개의 트립틱 두유 한천(TSA)을 냉장고에서 4접시를 모으세요(상업적으로 구입할 수 있음). 청소된 작업 영역에 접시를 놓습니다. 다음 국물 문화를 수집 : 에셀리치아 대장균, 황색 포도상구균, 황색 포도상 구균 표피증, 프로테우스 저속한. 주의: 이 것들은 에어로빅 유기체이기 때문에, 관의 모자는 약간 느슨해야 합니다. 모든 문화를 청소된 작업 표면에 테스트 튜브 랙에 배치합니다. 3. 문화와 배양 의 양도 스탠드 또는 모든 재료가 닿는 벤치에 앉아 있습니다. 무균 기술을 사용하여 박테리아를 접시에 옮기려면 먼저 주황색이 빛질 때까지 루프를 불태우고 공중에서 식힙니다. 루프가 식는 동안, 대장균의국물 문화를 취한 다음 새끼 손가락을 사용하여 캡을 엽니다. 튜브의 개구부를 빠르게 화염으로 만드십시오. 이렇게 하면 오염이 방지됩니다. 루프를 튜브에 담그고 유기체를 EMB 플레이트의 첫 번째 사분면에 줄입니다. 첫 번째 줄무늬가 수행된 후 루프를 불태우고 첫 번째 줄무늬를 한 두 번만 통과하는 두 번째 줄무늬를 수행합니다. 이렇게 하면 단일 식민지 격리가 허용되고 오염이 있는지 확인할 수 있습니다. 판의 네 사분면이 모두 줄무늬가 될 때까지 이것을 반복합니다. 이제, 최종 생성물이 하나의 MSA 플레이트, 1개의 EMB 플레이트 및 유기체 당 2개의 별도 TSA 플레이트가 되도록 동일한 줄무늬 도금 방식으로 4개의 유기체의 나머지 각각을 전송합니다. 모든 유기체가 옮겨지면 루프를 마지막으로 화염에 태우고 버리게 됩니다. 각 유기체와 TSA 플레이트 1개를 가스 패킷에 넣은 다음 가스 봉지를 흔들어 플레이트와 함께 챔버에 넣습니다. 단단히 밀봉하십시오. 모든 플레이트를 하룻밤 사이에 37°C에서 배양합니다. 5% 표백제로 작업 표면을 마지막으로 살균합니다. 4. 결과 읽기 및 기록 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 깨끗한 실험실 벤치에 놓습니다. 실험실 노트북의 각 플레이트의 유기체의 성장에 유의하십시오. 특히 다음 사항에 대한 자세한 내용은 다음과 같은 사항을 자세히 설명합니다. 각 플레이트의 식민지 의 숫자와 크기 (존재하는 경우) 각 도금 변형에 대해 MSA 플레이트에서 자라는 식민지를 둘러싼 한천의 출현 EMB 플레이트에서 자라는 식민지의 출현 외부성장과 가스 패키지 내부의 TSA 플레이트 간의 성장 차이

Results

매니톨 소금 한천 (MSA): 이 매체는 염화 나트륨 6.5%에서 살아남을 수 있는 그램 양성 유기체에 대해 선택적이다. 그람 음성 유기체 인 대장균과 프로테우스 저속한염은 염농도가 높기 때문에 이 매체에서 자랄 수 없어야 합니다. S. 표피미디스와 S. 아우레우스는 성장할 수 있어야 합니다. S. 아우레우스가 매니톨을 발효할 수 ?…

Applications and Summary

다른 세균성 종은 다른 환경에서 성장할 수 있고 에너지를 생성하는 방법으로 다른 탄소 원을 사용할 수 있습니다. 실험실에서 문화로 이러한 작업 할 때, 함께 작업 되는 성장 매체의 구성 요소를 알고 세균 성 종에 성장 매체를 일치 하는 것이 중요 하다. 과학자와 진단은 또한 다른 종에서 다른 종을 격리 하는 방법으로 그리고 혼합 된 환경에서 박테리아를 구별 하 고 식별 하는 방법으로 다양 ?…

References

  1. Fernandez, L. A. Exploring prokaryotic diversity: there are other molecular worlds. Molecular Microbiology, 55 (1), 5-15 (2005).
  2. Grattieri, M., Suvira, M., Hasan, K., & Minteer, S. D. Halotolerant extremophile bacteria from the Great Salt Lake for recycling pollutants in microbial fuel cells. Journal of Power Sources, 356, 310-318 (2017).
  3. Wendt-Potthoff K. & Koschorreck, M. Functional Groups and Activities of Bacteria in a Highly Acidic Volcanic Mountain Stream and Lake in Patagonia, Argentina. Microbial Ecology, 1, 92 (2002).
  4. Lee, L. S., Goh, K. M., Chan, C. S., Annie Tan, G. Y., Yin, W.-F., Chong, C. S., & Chan, K.-G. Microbial diversity of thermophiles with biomass deconstruction potential in a foliage-rich hot spring. Microbiology Open, 7 (6), e00615 (2018)
  5. Ito, T., Sekizuka, T., Kishi, N., Yamashita, A., & Kuroda, M. Conventional culture methods with commercially available media unveil the presence of novel culturable bacteria. Gut Microbes, 10 (1), 77-91. (2019)
  6. Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., & Wade, W. G. Strategies for culture of "unculturable" bacteria. FEMS Microbiology Letters, 309 (1), 1-7. (2010)
  7. Harris, T. M., Rumaseb, A., Beissbarth, J., Barzi, F., Leach, A. J., & Smith-Vaughan, H. C. Culture of non-typeable Haemophilus influenzae from the nasopharynx: Not all media are equal. Journal of Microbiological Methods, 137, 3-5. (2017)
  8. Wang, Y.-Y., Ai, P., Hu, C.-X., & Zhang, Y.-L. Effects of various pretreatment methods of anaerobic mixed microflora on biohydrogen production and the fermentation pathway of glucose. International Journal of Hydrogen Energy, 36 (1), 390-396. (2011)
  9. Pascual, A., Basco, L. K., Baret, E., Amalvict, R., Travers, D., Rogier, C., & Pradines, B. Use of the atmospheric generators for capnophilic bacteria Genbag-CO2 for the evaluation of in vitro Plasmodium falciparum susceptibility to standard anti-malarial drugs. Malaria Journal, 10, 8 (2011).
  10. Summanen, P., McTeague, M., Väisänen, M.-L., Strong, C., & Finegold, S. Comparison of Recovery of Anaerobic Bacteria Using the Anoxomat®, Anaerobic Chamber, and GasPak®Jar Systems. Anaerobe, 5, 5-9. (1999)
  11. de la Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., & Hancock, R. E. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology, 16, 580-589. (2013)
  12. Possé, B., De Zutter, L., Heyndrickx, M., & Herman, L. Novel differential and confirmation plating media for Shiga toxin-producing Escherichia coli serotypes O26, O103, O111, O145 and sorbitol-positive and -negative O157. FEMS Microbiology Letters, 282 (1), 124-131. (2008)

내레이션 대본

1. 준비 시작하기 전에 손을 철저히 씻고 적절한 크기의 장갑을 착용하십시오. 5% 나트륨 하이포염(표백제)으로 작업 표면을 살균하고 철저히 건조시다. 작업 하는 동안 벤치 상단을 만지지 않도록 빈 120 mL Erlenmeyer 플라스크에 접종 루프를 배치합니다. 2. 성장 미디어 및 문화 냉장고에서 매니톨 소금 한천(MSA), 에오신 메틸렌 블루 한천(EMB), 8개의 트립틱 두유 한천(TSA)을 냉장고에서 4접시를 모으세요(상업적으로 구입할 수 있음). 청소된 작업 영역에 접시를 놓습니다. 다음 국물 문화를 수집 : 에셀리치아 대장균, 황색 포도상구균, 황색 포도상 구균 표피증, 프로테우스 저속한. 주의: 이 것들은 에어로빅 유기체이기 때문에, 관의 모자는 약간 느슨해야 합니다. 모든 문화를 청소된 작업 표면에 테스트 튜브 랙에 배치합니다. 3. 문화와 배양 의 양도 스탠드 또는 모든 재료가 닿는 벤치에 앉아 있습니다. 무균 기술을 사용하여 박테리아를 접시에 옮기려면 먼저 주황색이 빛질 때까지 루프를 불태우고 공중에서 식힙니다. 루프가 식는 동안, 대장균의국물 문화를 취한 다음 새끼 손가락을 사용하여 캡을 엽니다. 튜브의 개구부를 빠르게 화염으로 만드십시오. 이렇게 하면 오염이 방지됩니다. 루프를 튜브에 담그고 유기체를 EMB 플레이트의 첫 번째 사분면에 줄입니다. 첫 번째 줄무늬가 수행된 후 루프를 불태우고 첫 번째 줄무늬를 한 두 번만 통과하는 두 번째 줄무늬를 수행합니다. 이렇게 하면 단일 식민지 격리가 허용되고 오염이 있는지 확인할 수 있습니다. 판의 네 사분면이 모두 줄무늬가 될 때까지 이것을 반복합니다. 이제, 최종 생성물이 하나의 MSA 플레이트, 1개의 EMB 플레이트 및 유기체 당 2개의 별도 TSA 플레이트가 되도록 동일한 줄무늬 도금 방식으로 4개의 유기체의 나머지 각각을 전송합니다. 모든 유기체가 옮겨지면 루프를 마지막으로 화염에 태우고 버리게 됩니다. 각 유기체와 TSA 플레이트 1개를 가스 패킷에 넣은 다음 가스 봉지를 흔들어 플레이트와 함께 챔버에 넣습니다. 단단히 밀봉하십시오. 모든 플레이트를 하룻밤 사이에 37°C에서 배양합니다. 5% 표백제로 작업 표면을 마지막으로 살균합니다. 4. 결과 읽기 및 기록 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 깨끗한 실험실 벤치에 놓습니다. 실험실 노트북의 각 플레이트의 유기체의 성장에 유의하십시오. 특히 다음 사항에 대한 자세한 내용은 다음과 같은 사항을 자세히 설명합니다. 각 플레이트의 식민지 의 숫자와 크기 (존재하는 경우) 각 도금 변형에 대해 MSA 플레이트에서 자라는 식민지를 둘러싼 한천의 출현 EMB 플레이트에서 자라는 식민지의 출현 외부성장과 가스 패키지 내부의 TSA 플레이트 간의 성장 차이