Name: 복잡한 생물 학적 샘플에서 선택적으로 - glycosylated 펩티드을 풍요롭게하는 렉틴 HPLC 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: 학습하세요 렉틴 HPLC를 이용해 인간 혈장에서 글리코실화된 펩티드를 선택적으로 풍부하게 하는 방법을. 이 기술은 질병 바이오마커 발견 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 암 대책, 5U24CA126477 - 04에 대한 임상 Proteomic 기술에 의해 지원되었다.

1) 렉틴과 - 복합 POROS 열 준비 <ol><li> 1.2 - 1.1 단계 동안 POROS - AL 비즈의 흡입을 방지하기 위해 마스크를 쓰세요. POROS 비즈의 원하는 금액 (100 MG beads/300 μl 최종 볼륨)을 무게와 깨끗한 eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 1 ML 인산 버퍼 호수 (PBS)의 추가로 구슬을 씻으십시오. 3 분 최대 속도 microcentrifuge에서 원심 분리하여 펠렛 비즈. 뜨는을 제거하고 세척을 반복합니다. </li><li> unconjugated 렉틴과의 원하는 금액 (1-4 MG / 200 μl 구슬)을 무게와 깨끗한 eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다. 5 형태로 PBS를 추가 - 20 MG / ML 솔루션. 이 솔루션의 보호 25 μl. </li><li> POROS 비즈에 남아있는 렉틴 솔루션을 전송합니다. 50 mm의 최종 농도 나트륨 cyanoborohydride를 추가합니다. 락커에 튜브를 삽입하고 실온에서 하룻밤 반응. (참고 :. 나트륨 cyanoborohydride은 독성이며 퓸 후드에서 처리되어야합니다 오염된 폐기물은 적절히 폐기해야합니다.) </li><li> 단계 1.2로 펠렛 POROS 비즈. 뜨는을 제거하고 사후 활용 솔루션으로 저장합니다. </li><li> 1 ML 담금질 버퍼 (1 M 트리스 - CL, 산도 7.4)으로 구슬을 씻으십시오. 단계 1.2에서 안전하게 같은 펠렛 비즈가 뜨는 폐기합니다. </li><li> 1 ML 담금질 버퍼로 POROS 비즈에 남아있는 반응 사이트를 차단합니다. 50 mm의 최종 농도 나트륨 cyanoborohydride를 추가합니다. 락커에 튜브를 삽입하고 30 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 펠렛 단계 1.2로 구슬과 뜨는 폐기. </li><li> 1 ML 1 M NaCl과 구슬을 씻으십시오. 펠렛 비즈와 뜨는 폐기. 오 세척 총 네 번 반복합니다. 구슬 이제 팩을 준비가되었습니다. </li><li> POROS 비즈로 복합했습니다 단백질의 양을 확인하려면 사전 복합 및 사후 복합 렉틴 솔루션에 단백질 농도 분석을 수행합니다. 농도의 차이는 구슬로 복합했습니다 단백질의 금액입니다. 비드 볼륨 당 복합 단백질의 금액은 구슬에 렉틴의 농도 같습니다. 대상 렉틴과의 농도는 2 -20 MG / ML 사이입니다. </li></ol> 2) 피크 칼럼에 렉틴 - 복합 POROS 비즈 포장 <ol><li> 포장 시스템 (설명이 다음)를 조립하고 금속 링 스탠드에 지원합니다. 포장 시스템은 바닥에서 위로, 압력 제한기, 최종 칼럼 커플러 1, 프릿, 열 (2 X 50mm), 최종 열 커플러 2 열 커넥터, 최종 칼럼 커플러 3 열 (4.5 X 50mm)로 구성되어 있습니다 최종 칼럼 커플러 4 및 최종 피팅. 상단 열은 포장의 저수지 역할을합니다. </li><li> 버퍼의 원하는 볼륨의 POROS 비즈를 Resuspend (10 MM 트리스 버퍼, 산도 7.4, 150 MM 나트륨 염화물, 10 MM의 염화칼슘, 10 MM 마그네슘 염화물). 400 μl 버퍼 A.에 resuspend 하나의 열로 표시 (~ 200 μl 침대 볼륨)을 포장하는 경우 </li><li> 상단 열 (저수지)에 복합 POROS 비즈를 전송합니다. 버퍼가 칼럼의 맨 위에 도달 때까지 저수지에 버퍼 추가합니다. 부드럽게 컬럼에서 공기 방울을 피하기 위해 노력하고, 컬럼의 상단에 최종 피팅을 넣으십시오. HPLC 시스템 상단 열의 최종 피팅에 연결합니다. </li><li> 시스템을 통해 버퍼를 흐르는하여 열을 팩. 0.5 ML / 분 유량을 시작합니다. 4 ML / 분 또는 최대 압력 (3000 PSI) 중 하나에 도달할 때까지 0.5 ML / 분 각 분에 의해 유량을 향상시킬 수 있습니다. 버퍼의 적어도 35 ML이가 열이 통과하기 전까지 가능한 최대 유량에서 계속합니다. </li><li> 펌프를 끄고 &lt;20 PSI 드롭으로 컬럼에 압력을 수 있습니다. </li><li> 부드럽게, 상단부터, 포장 시스템을 분해. 최종 칼럼 커플러 2에 도달하면, 조심스럽게 제거합니다. 일부 포장 재료 칼럼의 상단에서 압출해야합니다. 면도날 또는 유사 날카로운 가장자리로 부드럽게 열 상단과 심지어는 구슬 표면을두고, 압출 구슬을 닦아. 이렇게하면서 비즈에 압력을 적용하지 마십시오. </li><li> 반지 스탠드에서 포장 열을 공격 중지. 새로운 최종 커플러에 새 프릿을 놓고 오픈 (이전 TOP) 열 끝에있는 프릿 / 끝 커플러와 이것을 연결하는 포장 컬럼을 넘기다. </li><li> 적절하게 열을 라벨. 이제 사용할 수 있습니다. 최대 6 개월까지 사용하지 않을 때, 컬럼은 4 0.02 % 나트륨 azide ° C로 PBS에 저장되어있을 수 있습니다 때. </li></ol> 3) 프로그램 HPLC 방법 <ol><li> 귀하의 HPLC 프로그래밍의 내용은 제조 업체의 소프트웨어의 구체적인 내용에 따라 달라집니다. 우리는 Michrom 패러다임 MG4 HPLC를 사용합니다. 화면의 상단에이 컴퓨터에, 방법은 건설되고있는 &quot;설정&quot;탭 아래에 액세스할 수. 다음 방법을 프로그램 : <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 시간 </td><td> 흐름 속도 (μl / 분) </td><td> % </td><td> %의 B </td></tr><tr><td> 0시 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 9시 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 9시 1분 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13시 50분 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13시 51분 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19시 50분 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> 10 MM 트리스 버퍼, 산도 7.4, 150 MM 나트륨 염화물, 10 MM의 염화칼슘은 10 MM 마그네슘 염화물 : 버퍼 버퍼 B : 0.5 M 아세트산의 산성 UV 검출기는 0시에서 19시 50분에 280 nm의에서 읽을 프로그래밍해야합니다. . 50 AU - Y 축이 낮은 흡광도 레벨, 예를 들어, 0을 감지하는 조정해야합니다. </li><li> autosampler 사용 가능한, 프로그램 분수 수집에 대해 다음 일정있다면. 크로마 토그래피를 수행할 때 표시 달리, 손으로 분수를 수집합니다. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 분수 </td><td> 시료 주입에서 컬렉션에 지연 </td><td> 수집 기간 (분) </td></tr><tr><td> 흐름 -을 통해 </td><td> 2.8 </td><td> 4.1 </td></tr><tr><td> 바운드 </td><td> 9 </td><td> 2.6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) HPLC에 대한 샘플을 준비 <ol><li> 이 프로토콜에서 사용하기 전에, 인간의 플라즈마는 MARS 칼럼 (; 산타 클라라, CA 애질런트)를 사용하여 14 가장 풍부한 단백질의 소진해야합니다. 소진 플라즈마, 인간 락토페린 및 효모 invertase 개별적으로 트립신 - 소화하고 이전 1 설명된대로 desalted해야합니다. </li><li> 렉틴과 특정 락토페린 표준을 준비하려면, 제 3의 방법을 사용하여 AAL 또는 SNA 열 중 50 개 이상의 UG 트립신 - 소화 락토페린에서 크로마 토그래피를 수행합니다. 바운드 분수는 렉틴 특정 락토페린의 glycopeptides 포함됩니다. 6 부에서와 부품 4.4로 샘플 및 탈염하다를 무력화. 결과 예제를 사용할 준비가 하나 ML 버퍼 A에서 샘플을 Resuspend. </li><li> 세 실험이 수행됩니다 복제합니다. 세 사람 샘플을 준비하려면 복제, 30 μl MARS - 고갈, 트립신 - 소화, 플라즈마 동일한 (PE)에 트립신 - 소화 invertase 3 pmol 및 렉틴 특정 락토페린 (중 AAL - 락 또는 SNA - LAC) 1 μl를 추가합니다. PE는 플라즈마 처리 (MARS -되었고, 트립신 소화)의 주어진 금액이 파생된하는 non-processed/intact/original 플라즈마의 볼륨으로 정의됩니다. 330 μl의 최종 볼륨에 도달하기 위해 샘플을 버퍼에 추가합니다. </li><li> eluate를 수집 샘플 튜브에, 중화 버퍼 (1 M 트리스 산도 8.0)를 추가합니다. 번호와 함께 일하는 튜브의 볼륨은 autosampler의 제약에 따라 달라집니다. MG4 패러다임 들어, 유리병은 흐름을 통해 두가 eluate를 수집 수집합니다. 그것은 약 1.5 ML 트리스 버퍼 eluate 1 ML를 무력화하기 위해 필요합니다. 대상 무력화 산도는 7.0-8.0이며 산도 표시기 용지로 테스트 테스트 최종 산도. </li></ol> 5) 크로마 토그래피를 수행 <ol><li> 에 따라 모든 공백 및 예제 실행은 제 1 부에 설명된 방법을 사용합니다. 열 및 버퍼는 사용하는 동안 실온에서 수 있습니다. 버퍼가 상온에서 저장하는 동안 열이 4 ° C에 저장됩니다. </li><li> HPLC 시스템 중 AAL 또는 SNA의 렉틴 칼럼을 첨부 두 빈 메소드를 (단지 버퍼 주사)를 실행합니다. 렉틴과 열이 렉틴 특정 락토페린 (2 부)에 해당 있는지 확인합니다. </li><li> 7 HPLC의 실행의 총, 각 주입 샘플 사이에 빈 주사, 세 플라즈마 샘플을 크로마토 그래프. 빈 실행에서 분수가 수집 필요가 없습니다. </li></ol> 6) 탈염하다는 분수를 수집 각각의 분율은 다음과 같이 1 1 ML 워터스 오아시스 HLB SPE 카트리지를 사용하는 경우 : <ol><li> 진공 매니폴드에 필요한 카트리지의 개수를 연결합니다. </li><li> 1% 개미 산성 1 ML 80 % ACN (- 20 lnHg를 매니폴드에 진공 게이지 5를 참조한다) 각 카트리지를 젖었어. </li><li> 1.5 ML 0.1 %의 개미의 산성 (- 20 lnHg 매니폴드에서 진공 게이지 5를 참조한다)와 카트리지를 평형 </li><li> 한 카트리지 (. - 2.5 lnHg을하고, 유량이 1 ML / 분 넘지 않아야 매니폴드에서 진공 게이지 2를 참조한다)에 한 샘플의 전체 볼륨을로드 </li><li> 3 X 1 ML 0.1 %의 개미의 산성 (- 20 lnHg 매니폴드에서 진공 게이지 5를 참조한다)와 카트리지를 씻으십시오 </li><li> 로 Elute 펩티드 / glycopeptides은 0.1 % 개미 산성 1 X 1 ML 80 % acetonitrile로 eppendorf 튜브를 표시. 단일 수집 튜브 각 카트리지에 사용해야합니다 - (2.5 lnHg을하고, 유량은 1 ML / 분 넘지 않아야 매니폴드에서 진공 게이지 2를 참조한다.). </li><li> 각 수집 튜브 60 μl 0.5 M의 탄산수 소 암모늄을 추가하여 eluate를 무력화. 대상 neutralized 산도는 7.0-8.0입니다, 산도 표시기 용지와 시험 최종 산도. </li><li> ~ 2 시간 @ 35도 ° C. (예, 써모 사반트 SpeedVac) 진공 원심 분리기에 그들을 실행하여 eluted 펩티드 / ~ 50 μL에 glycopeptides을 집중 </li></ol> 7) PNGase F - 소화 <ol><li> 그것을 보장하기 위해 테스트 샘플 산도 7.0 사이 - 8.0. 필요한 경우 산도를 증가 50 MM의 탄산수 소 암모늄을 추가합니다. 최종 샘플 량은 50-100 μl 사이까지&gt; 100 μl, speedvac 예제입니다.한다면 </li><li> 37 ° C 야간 각 샘플 튜브와 부화 0.5 μl (250 U) 글리세롤 무료 PNGase의 F를 추가합니다. </li></ol> 8) 우편 팁 샘플 <ol><li> PNGase F - 소화 샘플로 시작, 다음과 같이 각각의 하나를 ziptip. </li><li> 10 μl 100 % acetonitrile, 10 μl 80 % acetonitrile, 0.1 % 개미 산성 다음과 젖은 ziptip. </li><li> 20 μl 0.1 %의 개미의 소산과 ziptip을 평형. </li><li> ziptip 매트릭스를 통해 10 번 그것을 pipetting 아래로 ziptip에 샘플을로드합니다. </li><li> 10 μl 0.1 %의 개미의 산, 5 번 pipetting하여 ziptip 씻으십시오. </li><li> 10 μl 80 % acetonitrile, 0.1 % 개미 산성과 깨끗한 eppendorf 튜브에 샘플을 Elute. </li><li> 용리를 반복하고 같은 튜브에 두 번째 10 μl를 추가합니다. </li><li> &lt;2 μl의 볼륨에 샘플을 Speed​​vac. </li><li> 20 μl 0.1 %의 개미의 산이 Resuspend 샘플. 샘플 지금 LC-MS/MS로 분석 준비가되어 있습니다. </li></ol> 9) 대표 검색 결과 : 20 MG / ML - POROS의 활용은 일반적으로 2의 범위에서 - 비드 렉틴 농도를 산출. 이것은 친화도 크로마 토그래피 최적입니다. 트립신 - 소화 MARS - 고갈 인간 플라즈마의 렉틴 크로마 토그래피는 일반적으로 바운드 분수에 glycopeptides을 풍요롭게. glycopeptides가 PNGase 이전 LC-MS/MS에 F - 대우, 그들은 N - 연결 합의 순서와 펩티드로 식별되며, 아스파라긴가로 변환되어있는 NXS / T (여기서 X는 어떤 잔류물하지만 프롤린됩니다) 이러한 특성을 가진 PNGase F.의 펩티드의 작업을 통해 아스파르트산는 deglycosylated 펩티드 (또는 &quot;deglycopeptides&quot;)로 간주됩니다. 바운드 분수에서 가져온 펩티드의 30-50%가 deglycopeptides 반면 평균 흐름을 통해 AAL 또는 SNA 크로마 토그래피에서 (FT) 분수, 2-4 %의 deglycopeptides가 포함되어 있습니다. 일반적으로 QStar 엘리트를 사용하여, 1000-1300 펩티드는 FT 분율에 표시됩니다, 그리고 200-400 펩티드는 바운드 분수에 표시됩니다. 두 개 이상의 서로 다른 Invertase의 deglycopeptides는 FT 분율과 바운드 분율 (표 1)에 두 개 이상의 별개의 락토페린의 deglycopeptides에서 관찰해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="표 1" /> 표 1.

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

이 프로토콜은 glycan 특정 방식으로 glycopeptides를 분리하고 확인하는 빠른 방법을 제공합니다. 글리코 실화 특히 개발과 pathogenesis 동안 생체 내에 광범위하게 다릅니다,이 기술은 질문의 다양한 해결하기 위해 적용할 수 있습니다. 특히, 우리는 선택 biomarker 발견을 향한 첫 단계로서 암 관련 epitopes로 변경되었습니다 glycopeptides을 풍요롭게하는 방법을 사용하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>사람 혈장</td><td></td><td></td><td>자체 제작</td></tr><tr><td>사람 락토페린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>사용 전 트립신 소화 처리</td></tr><tr><td>효모 인버타아제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>사용 전 트립신 소화 처리</td></tr><tr><td>Oass HLB SPE 카트리지</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>1 cc 부피</td></tr><tr><td>ZipTip 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore, 10 ml 피펫용 C18</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99%</td></tr><tr><td>중탄산 암모늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99%</td></tr><tr><td>염화 칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96%</td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98%</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99.7%</td></tr><tr><td>pH 지시지</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>범위 0-14</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99.9%</td></tr><tr><td>포름산</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99%</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>칼슘 및 마그네슘 제외</td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>글리세롤 프리</td></tr><tr><td>진공 여과 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>0.2 mm 기공</td></tr><tr><td>POROS-AL 비드</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt; 렉틴</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt; 응집소</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>시아노붕소수소화 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>5.0 M 용액</td></tr></tbody></table>

복잡한 생물 학적 샘플에서 선택적으로 - glycosylated 펩티드을 풍요롭게하는 렉틴 hplc 방법

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans 게시할 - translational 수정의 중요한 클래스입니다. 일반적으로 분비 및 세포 분자에있는, glycan 구조는 세포의 내부 상태를 신호. 종양 세포에 Glycans 풍부한 sialic 산성 및 fucose의 moieties이 필요한 경우가 많다. 우리는이 암 관련 glycan 변종이 초기 단계 질병을 진단하기위한 biomarker 개발에 이용할 것을 제안합니다. 따라서, 우리는 대량 lectins, 특정 glycan 구조를 바인딩 단백질의 형성 친화 매트릭스에서 크로마 토그래피를 통합 분광 기반의 워크플로우를 개발했습니다. 각각 sialic 산성 및 fucose를 묶어 lectins Sambucus 니그라 (SNA)과 Aleuria aurantia (AAL)는, covalently POROS 비즈 (응용 Biosystems)로 결합하고 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC)에 대한 피크 컬럼으로 포장했다. 간단히, 플라즈마는 여러 친화 제거 시스템 (; 애질런트 MARS - 14)를 사용하여 열네 가장 풍부한 단백질의 고갈되었다. 고갈 플라즈마 트립신 - 소화와 흐름을 통하여 SNA 또는 AAL HPLC에 의해 구속 분수로 분리되었다. 분수는 N - glycans 링크를 제거하는 PNGaseF 취급하고 QStar 엘리트에 LC-MS/MS로 분석되었다. 데이터 마스콧 소프트웨어를 사용하여 분석했다. 실험 설계는 제어 - fucosylated 및 sialylated 긍정을 포함하는 인간 락토페린의 glycopeptides 및 Saccharomyces에서 부정적인 제어 높은 mannose glycopeptides cerevisiae가 - 렉틴 캡처의 특이성을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 이 워크플로의 주요 기능은 당단백질 표준을 사용하여 HPLC 형식들은 deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr 주제에서 캡처 PNGaseF - 처리 glycopeptides의 긍정적인 식별 및 품질 평가에서 파생 재현성을 포함합니다. 프로토콜 최적화는 또한, 열 용량 자료를 시작 가장 효율적인 캡처 및 용출 버퍼를 파악하고, 전체 deglycosylation을 보장하기 위해 PNGaseF - 치료를 모니터링의 적절한 비율을 결정 포함되어 있습니다. 미래의 방향 유방암 환자 및 제어 개인의 플라즈마 질량 분석법에 기반 검색 실험을 수행하기 위해이 워크플로우를 사용하여 포함됩니다.

렉틴 - 복합 POROS 비즈는 HPLC를 위해 고용되었다. 당펩타이드 기준은 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 역임 하였다. MARS - 14 고갈, 트립신 - 소화 인간의 플라즈마는 chromatographed와 흐름 -을 통해 (FT)와 바운드 분수는 ESI-LC-MS/MS 분석을 위해 수집되었다. FT에 비해 Glycopeptides는 바운드 분수에 풍부했다.

복잡한 생물 학적 샘플에서 선택적으로 - glycosylated 펩티드을 풍요롭게하는 렉틴 HPLC 방법

글리칸(Glycans)은 번역 후 변형의 중요한 부류입니다. 주로 분비물 및 세포 외 분자에서 발견되는 글리칸 구조는 ...을 신호로 전달합니다.

본 절차는 인간 혈장으로부터 특정 당화된 당펩타이드를 분리합니다. 혈장을 트립신으로 소화하여 펩타이드와 당펩타이드 표준품의 혼합물을 생성합니다. 렉틴 크로마토그래피를 위한 양성 및 음성 대조군을 혈장에 스파이킹합니다.시료를 렉틴 친화성 크로마토그래피 기반의 고성능 액체 크로마토그래피로 처리합니다. 사용된 렉틴들은 각각 fucose와 sialic acid에 결합하며, 펩타이드 및 관련 없는 당단백질은 flow through 분획으로 컬럼에서 용출됩니다. 컬럼에 결합된 분획을 용출시키기 위해 아세트산을 사용합니다.이는 특이적으로 변형된 당펩타이드(glycopeptides)가 농축된 상태입니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 샌프란시스코(University of California San Francisco) 산부인과 및 생식과학과 Susan Fisher 교수 연구실과 Sandler Moore 질량분석 코어 시설의 Penny Drake입니다. 그리고 저는 마찬가지로 Sandler Moore 질량분석 코어 시설과 Fisher 연구실의 Eric Johansen입니다.오늘은 인간 혈장 및 기타 복합 혼합물에서 글라이코펩타이드를 농축하기 위한 렉틴 크로마토그래피 수행 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 다양한 응용 분야에 활용 가능한 일반적인 도구로 사용하고 있습니다. 예를 들어, 이 방법은 저희의 유방암 바이오마커 발굴 워크플로우에서 중요한 역할을 합니다.그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 비드의 흡입을 방지하도록 마스크를 착용하십시오. 그런 다음 porro 비드 100 milligrams를 정밀하게 측정하여 깨끗한 einor 튜브에 옮깁니다.컬럼 하나를 충전하는 데 약 300 µL의 비드가 필요합니다. 추가로, 결합되지 않은 렉틴을 정량하여 깨끗한 einor 튜브로 옮깁니다. SNA 및 A A L 렉틴이 사용됩니다.PBS를 렉틴에 첨가하여 5~20 mg/mL 용액을 만듭니다. 이렇게 미리 접합된 용액 25 µL를 따로 보관하십시오. 다음으로, 1 mL의 PBS를 첨가하고 마이크로 원심분리기에서 최대 속도로 원심분리하여 poro-beads를 세척합니다.3분 동안 상층액을 제거하고 세척 과정을 반복합니다. 이제 흄 후드 내에서 잔류 렉틴 용액을 세척된 poro beads로 옮깁니다. 그리고 최종 농도가 50 millimolar가 되도록 sodium sano boro hydride를 첨가합니다.sodium sano boro hydride는 독성이 있으므로 폐기물을 적절하게 처리해야 함에 유의하십시오. 닫힌 튜브를 perfil로 밀봉한 후 로커(rocker)에 올려놓고 실온에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. 렉틴이 poro beads에 하룻밤 동안 결합한 후, poro beads를 다시 원심 분리하여 침전시킵니다. 상층액을 제거하고, 이를 비드 상의 남은 반응 부위를 블로킹하기 위한 접합 후 용액(post conjugation solution)으로 보관하십시오.먼저, pH 7.4의 1 M CL로 제조된 퀀칭 버퍼 1 mL를 사용하여 원심분리하여 비드를 세척합니다. 그 다음, 퀀칭 버퍼 1 mL와 최종 농도가 50 mM이 되도록 sodium sano hydride를 첨가합니다. 튜브를 로커(rocker) 위에 놓고 상온에서 30분 동안 배양합니다.이제 퀀칭(Quenching)이 완료되었습니다. 이전과 동일하게 비드를 원심분리하십시오.상층액을 제거하고, 매회 1 mL의 1 M sodium chloride로 비드를 5회 세척하며 상층액을 버립니다. 결합 전후의 렉틴 용액에 대해 단백질 농도 분석을 수행하고, 그 차이를 이용하여 포로 비드에 결합된 단백질의 양을 결정합니다. 목표 렉틴 농도는 비드 부피당 결합된 단백질 양으로 계산하여 2~20 mg/mL 사이로 설정합니다.이제 접합된 porro 비드를 컬럼에 충전할 준비가 되었습니다. 비드를 컬럼에 충전하려면 금속 링 스탠드 위에 지지된 두 개의 컬럼으로 구성된 충전 시스템을 조립하십시오. 상단 컬럼은 충전 물질의 저장조 역할을 합니다.충전 시스템은 아래에서부터 위쪽 방향으로 압력 제한기, 대상 컬럼의 첫 번째 엔드 컬럼 커플러, 엔드 컬럼 커플러, 두 번째 컬럼 커넥터, 세 번째 엔드 컬럼 커플러, 리저버 컬럼, 네 번째 엔드 컬럼 커플러 및 엔드 피팅으로 구성됩니다. 다음으로, 300 µL의 porro speeds를 600에 재현탁합니다.버퍼 A 수 마이크로리터. 컬럼 하나를 충전하려면 비즈를 컬럼의 상단 저장소로 옮깁니다. 버퍼 A를 컬럼 상단까지 닿을 때까지 추가합니다. 끝단 피팅을 컬럼 상단에 조심스럽게 배치합니다.컬럼 내에 공기 방울이 생기지 않도록 주의하십시오. 상단 컬럼의 끝단 피팅을 HPLC 시스템에 연결합니다. 시스템을 통해 버퍼 A 또는 PBS를 흘려보내 컬럼을 충전합니다.유속을 0.5 milliliters per minute로 시작하십시오. 4 milliliters per minute에 도달하거나 최대 압력에 도달할 때까지 매분 유속을 0.5 milliliters per minute씩 증가시키십시오. 최소 35 milliliters의 버퍼가 컬럼을 통과할 때까지 가능한 최대 유속으로 계속 유지하십시오.완료되면 펌프 전원을 끄고 컬럼의 압력이 20 PSI 미만으로 떨어질 때까지 기다립니다. 컬럼 충전이 완료되었으므로, 상단부터 충전 시스템을 조심스럽게 분해합니다. 끝단 컬럼 커플러 2에 도달하면 주의해서 제거합니다.면도날을 사용하여 컬럼 상단으로 돌출된 충진물을 조심스럽게 닦아냅니다. 이때 비드에 압력을 가하지 마십시오. 링 스탠드에서 충진된 컬럼을 분리합니다.새 프릿을 새 엔드 커플러에 넣고 충전된 컬럼을 뒤집어 개방된 컬럼 끝부분에 FR 플러스 엔드 커플러와 연결합니다. 이제 컬럼이 HPLC 분석을 위한 준비가 되었습니다. 사용하지 않을 때 컬럼은 0.5% sodium azide가 포함된 PBS 내에서 4 °C로 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.HPLC 프로그래밍의 세부 사항은 사용자의 설정 및 제조업체 소프트웨어의 특성에 따라 달라질 수 있습니다. 본 과정에서는 이 장비에서 microme paradigm MG four HPLC를 사용합니다. 분석법(Method)은 화면 상단 프로그램의 설정(setup) 탭에서 구축 및 접근할 수 있습니다.제시된 방법은 함께 제공되는 서면 프로토콜에 상세히 설명되어 있습니다. 자동 시료 주입기 프로그램을 사용하는 경우에도 서면 프로토콜을 따르십시오. 이전과 동일하게 버퍼 A를 사용하고, HPLC 분석 및 버퍼와 컬럼을 상온으로 유지하기 위해 버퍼 B를 사용하십시오.UV 검출기가 0분부터 19분 50초까지 280 nm에서 측정하도록 설정하십시오. Y축은 0에서 50 흡광도 단위 범위의 낮은 흡광도 수준을 감지할 수 있도록 조정하십시오. 그런 다음, 시료를 준비하십시오.테스트 샘플은 Mars 컬럼을 사용하여 가장 풍부한 14가지 단백질을 제거한 인간 혈장에서 얻었습니다. 단백질이 제거된 혈장 샘플과 두 가지 표준 물질을 준비합니다. 인간 lactoferrin과 효모 invertase를 각각 개별적으로 trypsin으로 소화시킨 후, 이전에 설명한 대로 탈염 처리합니다.샘플을 중화시키기 위해, MG 4 패러다임에서 EIT를 수집할 샘플 바이알에 중화 버퍼를 미리 준비해 둡니다. 바이알 하나에는 통과액(flow through)을 수집하고, 나머지 세 개에는 용출액(eluate)을 수집합니다. 1 mL의 EIT를 중화하는 데는 약 1.5 mL의 버퍼가 필요합니다. 목표 중화 pH는 7.0에서 8.0 사이입니다.최종 pH를 pH 지시지(pH indicator paper)로 반드시 확인하십시오. 본 프로토콜의 후반부에 설명된 대로 샘플을 탈염하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 샘플을 1 mL의 buffer A에 재현탁하십시오.데이터를 비교하고 결합할 수 있도록 세 번의 실험 반복구를 수행합니다. 세 번의 반복구용 샘플을 준비하려면, 30 µL의 Mars depleted trypsin digested plasma equivalents(PE)에 3 pM의 trypsin digested invertase와 1 µL의 HPLC 정제 lactoferrin 특이적 lectin을 첨가합니다. 이는 반복구당 약 50 µg의 혈장 단백질을 사용하는 양에 해당합니다. 샘플에 버퍼 A를 추가하여 최종 부피를 330 µL(실험 반복구당 110 µL)로 맞춥니다. AAL 또는 SNA lectin 컬럼 중 하나를 사용하여, 먼저 버퍼 A만 주입하여 두 번의 공시험(blank method)을 실행합니다. lectin 컬럼이 표준물질 및 이전에 정제된 크로마토그래프에 사용된 lactoferrin 특이적 lectin과 일치하는지 확인하십시오.각 시료 주입 사이에 공시료(blank)를 주입하여 총 7회의 HPLC 분석을 수행하며, 세 개의 혈장 시료를 분석합니다. 공시료 분석에서 얻은 분획은 수집할 필요가 없습니다. 다시 한번, 탈염 및 P-N-G-A-F 소화 후 용출액을 수집하는 시료 바이알에 중화 완충액을 넣어 시료를 중화시켜야 하며, 이렇게 하면 시료가 질량 분석 분석 준비가 완료됩니다.락토페린 표준물질 및 실험 시료의 각 HPLC 분획을 탈염하기 위해 1 mL Waters Oasis HLB SPE 카트리지를 하나씩 사용하십시오. 먼저 필요한 수의 카트리지를 진공 매니폴드에 장착합니다. 각 카트리지를 1% formic acid가 포함된 80% acetonitrile 1 mL로 적십니다.매니폴드의 진공 게이지 수치가 5~20 inches Mercury가 되어야 합니다. 0.1% formic acid 1.5 milliliters로 카트리지를 평형화합니다. 다시 한번, 매니폴드의 진공 게이지 수치가 5~20 inches Mercury가 되어야 합니다.하나의 카트리지에 샘플의 전체 부피를 로딩합니다. 이때 매니폴드의 진공 게이지는 2~2.5인치를 가리켜야 합니다. 유량은 1 mL/min을 초과해서는 안 됩니다.각 카트리지당 라벨이 부착된 단일 수집 튜브를 사용하여 1 mL의 0.1% formic acid로 카트리지를 3회 세척합니다. 0.1% Formic acid에 포함된 1 mL의 80% Acetonitrile로 당단백질 펩타이드를 용출시키고, 각 수집 튜브에 60 µL의 0.5 M ammonium bicarbonate를 첨가하여 EIT를 중화합니다. 목표 중화 pH는 7.0에서 8.0 사이입니다.pH 지시지를 사용하여 최종 pH를 반드시 확인하십시오. Thermo Savant SpeedVac과 같은 진공 원심분리기를 사용하여 35 °C에서 약 2시간 동안 용출된 펩타이드를 약 50 µL로 농축합니다. 농축 후 샘플의 pH가 7.0에서 8.0 사이인지 다시 확인하십시오. 필요한 경우, pH를 높이기 위해 50 mM 중탄산암모늄을 첨가하십시오.최종 샘플 부피가 100 microliters보다 크면, 진공 원심분리를 통해 샘플을 50 to 100 microliters 사이가 되도록 농축하십시오. 마지막으로, 각 샘플 튜브에 250 units의 glycerol free peptide n glycosate F 또는 P-N-G-A-F를 첨가하고 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양하여 펩타이드로부터 N-결합 당쇄를 제거합니다. P-N-G-S-F를 이용한 하룻밤 배양 후, 실험을 시작하기 전에 역상 C 18 매트릭스가 포함된 zip tip 피펫 팁을 사용하여 샘플의 염을 제거합니다.세척 및 용출을 위해 파라폼 위에 0.1% formic acid 한 방울과 0.1% formic acid가 첨가된 80% acetonitrile 한 방울을 각각 만듭니다. 방울 형태의 용액을 사용하는 것은 시료 간 펩타이드의 교차 오염을 방지하기 위함이며, 각 zip tip 시료마다 새로운 방울을 준비합니다. 먼저 acetonitrile 용액으로 zip tip을 적십니다. 0.1% formic acid 10 µL를 이용하여 zip tip 내에서 세 번 피펫팅하여 평형을 맞춥니다.피펫팅을 10회 반복하여 샘플을 로딩합니다. 그런 다음 0.1% formic acid 10 µL로 팁을 5회 세척합니다. 마지막으로 1% Formic acid에 포함된 80% acetonide trial로 샘플을 2회 용리하고, 용리된 펩타이드를 einor 튜브에 수집합니다.진공 원심분리기를 이용해 시료를 농축하여 부피를 2 µL 미만으로 줄인 후, 0.1% formic acid 20 µL에 시료를 재현탁하여 마무리합니다. 이제 시료를 L-C-M-S-M-S로 분석할 준비가 되었습니다. 일반적으로 porro 접합을 통해 비드당 렉틴 농도가 2~20 mg/mL 범위로 생성되며, 이는 친화성 크로마토그래피에 최적입니다.trypsin으로 소화시킨 Mars 결핍 인간 혈장의 렉틴 크로마토그래피는 일반적으로 결합 분획에서 당글리코펩타이드를 농축합니다. 본 워크플로우는 글라이칸이 결합되지 않은 consensus sequence NXS 또는 NXT(X는 프롤린을 제외한 모든 잔기)를 포함하는 N-결합 당글리코펩타이드를 식별합니다. PNGase F 처리는 결합되지 않은 글라이칸을 제거하고 글라이칸이 부착되어 있던 아스파라긴 잔기를 탈아미노화합니다.탈아미드화는 탈당쇄화된 펩타이드 또는 탈당단백질 펩타이드에서 변형되지 않은 펩타이드 대비 1 Dalton의 질량 이동을 유발합니다. 따라서 DEG 당단백질 펩타이드는 N-결합 공통 서열을 포함하는 펩타이드로 식별되며, 이때 공통 서열 내의 아스파라긴 잔기가 탈아미드화되어 변형되지 않은 아스파라긴 잔기와 비교해 +1의 질량 차이로 관찰됩니다. 여기 두 가지 예시 스펙트럼이 이 개념을 설명합니다.상단 스펙트럼은 EnLink 합의 서열을 포함하는 비수식 펩타이드의 단편화를 보여줍니다. 하단 스펙트럼은 EnLink 합의 서열 내의 아스파라긴 잔기가 탈아미드화된 동일한 펩타이드의 단편화를 보여줍니다. 탈아미드화된 펩타이드의 Y7, Y8 및 B3 단편에서 원으로 표시된 분자 이온들은 비수식 펩타이드의 대응 성분들과 비교하여 질량이 1 Dalton 증가하였습니다.이러한 질량 변화는 아래쪽 스펙트럼의 펩타이드에 탈아미드화된 아스파라긴 잔기가 포함되어 있음을 나타냅니다. 일반적으로 QStar elite를 사용하면 통과 분획(flow through fraction)에서 1000~1300개의 총 펩타이드가 식별되며, 결합 분획(bound fraction)에서 200~400개의 펩타이드가 식별됩니다. 평균적으로 a l 또는 SNA 크로마토그래피의 통과 분획에는 2~4%의 탈당쇄 펩타이드가 포함되어 있는 반면, 결합 분획에서 회수된 펩타이드의 30~50%는 탈당쇄 펩타이드입니다.질량 분석 과정에서 탈당쇄화된 탈아미드화 분자들이 관찰되므로, 당펩타이드(glycopeptides) 대신 탈당쇄 당펩타이드(deg glycopeptides)라는 용어를 사용합니다. 하지만 저희는 샘플 내 DEG 당펩타이드의 대부분이 PN GF 처리로 인해 탈당쇄화 및 탈아미드화된, 이전에 결합되어 있던 당펩타이드였을 것으로 제안합니다. 결합 샘플에서 탈당쇄 당펩타이드가 농축되었다는 점이 이 가설을 뒷받침하며, 이를 통해 탈당쇄 당펩타이드의 검출을 렉틴 친화성 크로마토그래피 프로토콜로 포획된 당펩타이드의 대리 지표로 사용할 수 있습니다.flow-through 분획에서는 두 개 이상의 서로 다른 invertase d 당단백질 펩타이드가 관찰되어야 하며, bound 분획에서는 두 개 이상의 서로 다른 lactoferrin de 당단백질 펩타이드가 관찰되어야 합니다. 지금까지 렉틴 컬럼을 준비하고 HPLC 형식으로 렉틴 친화성 크로마토그래피를 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 고품질의 당단백질 펩타이드 샘플로 시작하고, 실험 전반에 걸쳐 샘플의 pH를 모니터링하며, 당단백질 펩타이드 표준품을 사용하여 크로마토그래피의 품질을 확인하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

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완전 자동화된 시스템을 사용한 재조합 단백질의 신속한 Glyco-Qualitative Assessment of recombinant proteins with a fully automated system (완전 자동화된 시스템을 사용한 재조합 단백질의 신속한 Glyco-Qualitative Assessment of recombinant proteins using a fully automated system)

이 프로토콜은 암의 당생물학을 더 잘 이해하는 데 필요한 복잡한 종양 미세환경에서 이질적인 당단백질체에 대한 포괄적인 통찰력을 제공하는 통합 오믹스 기술인 당체학 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics method)에 대해 자세히 설명합니다.

Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다. 

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복잡한 생물 학적 샘플에서 선택적으로 - glycosylated 펩티드을 풍요롭게하는 렉틴 HPLC 방법

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