개인 Presynaptic 터미널에서 도파민 릴리스 FFNs와 시각

형광 가성 신경전달물질. FFN 511은 뇌 절편에 적용했을 때 시냅스 물리적 모노아민 운반체의 기질로 작용할 수 있는 형광 모노아민입니다. FFN 511은 모노아민 운반체를 통해 도파민성 시냅스 소포로 흡수되며, S stratum에 있는 것과 같은 모노아민 뉴런의 시냅스 전 말단에서 신경전달물질의 방출을 직접 시각화하는 데 사용될 수 있습니다. 말단에서의 전달물질 방출은 절편 내 점상 형광 신호의 감소로 관찰됩니다.

본 영상에서는 FFN 511로 염색된 250 µm 두께의 관상 돌기 뇌절편을 진동 절편기로 제작하고 다광자 레이저 현미경으로 이미징하는 과정을 보여줍니다. iCal 방출의 주파수 의존적 불균질성을 밝히는 디테이닝 실험이 제시됩니다. 안녕하세요, 컬럼비아 대학교 신경과 David s 연구실의 HU입니다.

안녕하세요, Soldier Lab의 Minerva입니다. 오늘은 형광 가성 신경전달물질을 사용하여 뇌 절편 내의 도파민 말단을 표지하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 도파민 방출을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 급성 뇌 절편을 준비하기 전, 인공 뇌척수액(A CSF)에 산소를 공급하고 뇌 추출 전 최소 15분 동안 얼음으로 냉각시켜야 합니다. 해부 과정 동안 A CSF를 차갑게 유지하고 산소를 계속 공급하십시오. 생쥐의 뇌 전체를 추출하여 vibram 트레이에 올린 후, crazy glue를 사용하여 vibram 위에 고정합니다. 뇌 추출과 고정 작업은 2분 이내에 완료되어야 합니다.

냉각된 산소 공급 A CSF가 담긴 트레이에 +1.54에서 +0.623 사이의 250 µm 두께로 절단된 관상면 직선 뇌 절편 또는 뇌 절편을 채웁니다. 3개의 전체 절편을 얻게 되며, 이는 바늘을 사용하여 6개의 반절편으로 자를 수 있습니다. 뇌 절편이 배양되는 동안 상온의 산소 공급 A CSF에서 최소 1시간 동안 배양합니다.

산소화된 A CSF에 10 millimolar FFN 511 스톡 솔루션을 첨가하여 10 micromolar FFN 511 로딩 솔루션을 준비합니다. 그 다음, A CSF로 100 micromolar A-D-V-A-S-E-P 7 솔루션을 준비합니다. 두 솔루션을 각각 슬라이스에 로딩하기 전 최소 15분 동안 산소화합니다. 각 뇌 슬라이스를 FFN 511 로딩 솔루션과 함께 실온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 로딩된 슬라이스를 산소 공급된 100 µM advers, seven A CSF에 실온에서 30분 동안 배양하여 세포 외 조직에 결합된 di를 제거합니다. 이제 슬라이스를 이미징할 준비가 되었습니다. FFN 511 염색은 prairie Ultima Multiphoton 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 슬라이스 내에서 이미징합니다. FFN 511이 로딩된 슬라이스를 기록 챔버에 넣고 산소 공급된 A CSF를 분당 1~2 mL의 유속으로 투여합니다. 그런 다음 슬라이스 위에 나일론 줄이 달린 백금 하프를 배치하여 움직임을 최소화합니다.

움직임을 더욱 최소화하기 위해, 이미징 전 챔버 내에서 슬라이스가 최소 10분 동안 안정화되도록 합니다. 10배수 수침 렌즈(water immersion objective) 하에서 명시야 발광(brightfield luminescence)을 통해 dorsal stri AUM을 시각화하고 위치를 확인한 후, 자극 실험을 수행하기 위해 이 영역에 양극 꼬임 텅스텐 전극(bipolar twisted tungsten electrodes)을 배치하고 고정합니다. 유휴 이미징 영역은 300 micrometers 이내에 위치합니다.

자극용 바이폴라 전극의 두 팁 사이에 Spectral Physics사의 MiTai 레이저를 사용하여 760 nm에서 FFN 511로 표지된 SAL 말단 부위가 시야 중심에 오도록 63배 수침 자외선 대물렌즈 아래에 배치합니다. SAL 말단의 최적 형광은 밴드패스 필터를 통해 관찰됩니다. 512 x 512 픽셀 해상도로 75 x 75 µm의 관심 영역을 설정하여 12비트 형식으로 이미지를 캡처합니다. FFN 511로 표지된 Sal 도파민 말단의 예시 이미지가 여기에 제시되어 있습니다.

FFN 511 표지는 고농도의 염화칼륨 암페타민 황산염 또는 염화칼륨 탈염 실험에서의 전기 자극으로 제거될 수 있으며, 뇌 절편에 고농도 칼륨 A CSF 용액을 처리하면 4분 이내에 FFN 511 표지가 제거됩니다. 전기 자극에 의한 FFN 511 탈염 과정을 시간에 따라 추적하기 위해 XYZT 이미지를 기록하십시오. 자극 전 최소 5분 동안 Zack의 대조군 시계열 이미지를 획득하여 절편의 움직임을 최소화하고, 이미지 획득 후 레이저에 의한 광탈색이 일어나지 않음을 확인하십시오.

양극 전극을 사용하고 마스터 8 펄스 발생기에 의해 트리거되는 isof lex 자극 절연기를 통해 선조체에 국소적으로 1, 4 또는 20 Hz 빈도의 자극을 가하면서 XYZT 이미징을 계속합니다. 이 영상은 쥐 뇌 절편의 엑소사이토시스(exocytosis) 동안 FFN 511의 쇠퇴를 보여줍니다. FFN 511의 SAL 로딩이 완료된 준비 단계에서 선조체에서는 풍부한 표지가, 피질에서는 희소한 표지가 관찰되며 뇌량에서는 표지가 관찰되지 않습니다.

도파민 말단의 선택적 표지는 고농도의 염화칼륨으로 제거될 수 있으며, 이는 염화칼륨 처리 전과 70 millimolar 염화칼륨 처리 2분 후의 대표 이미지에서 확인할 수 있습니다. FFN 511 표지의 CSF 제거는 암페타민으로도 수행할 수 있습니다. 그리고 이 이미지는 암페타민 처리 전 선조체에서의 FFN 511 표지를 보여줍니다.

이 이미지는 20 µM 암페타민으로 처리한 20분 후의 선조체를 보여줍니다. 국소 전기 자극에 의한 FFN 511 표지의 제거는 자극 전, 그리고 4 Hz 자극 시작 후 217초 및 514초 시점의 선조체 내 FFN 511 표지를 보여주는 이 이미지들에 예시되어 있습니다. 시간에 따른 정규화된 형광 강도를 나타낸 이 그래프는 FFN 511의 제거가 칼슘 및 주파수 의존적임을 보여주며, 빈 삼각형으로 표시된 대조군은 자극을 받지 않았습니다. 빈 원으로 표시된 염화 카드뮴 처리군은 자극을 받지 않은 대조군과 동일했습니다.

색상 원으로 표시된 각 자극 주파수에 대한 감쇠 곡선은 단일 지수 감쇠 함수로 피팅되었으며, 반감기 값은 tau에 0.693을 곱하여 계산하였습니다. 지금까지 급성 슬라이스의 도파민 말단에 형광 힘 신경전달물질 FFN five 11을 로딩하는 방법과 고농도 칼륨 및 자극 유도를 통해 이를 방출시키는 방법을 보여드렸습니다. 이는 개별 시냅스 말단 수준에서 신경전달물질의 방출을 광학적으로 조사하기 위해 개발된 최초의 방법입니다.

본 절차를 수행할 때, 슬라이스의 상태를 매우 건강하게 유지하는 것이 중요하며 로딩 시간, 배경 표백 및 움직임 아티팩트에 유의해야 합니다. 슬라이스는 슬라이스 준비 후 최대 4시간까지 양호한 FFN five 11 로딩 및 이미징 상태를 나타냅니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.