Name: 개인 Presynaptic 터미널에서 도파민 릴리스 FFNs와 시각 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 학습하세요 FFN 511 형광 거짓 신경전달물질을 이용하여 뇌 조각에서 개별 도파민 시냅스 전말단에서 신경전달물질 방출을 실시간으로 시각화하고 정량화하는 방법을. 이 기법은 도파민성 신호전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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D. 세임스는 G. 해롤드 &amp; 라일라 Y. 자선 재단과 과학의 컬럼비아 대학의 이니셔티브를 매더 감사드립니다. D. 세임스 및 D. Sulzer는 신경 과학 수상의 맥나이트 기술 혁신에 대한 맥나이트 재단 감사 D. Sulzer이니다, NIMH, 그리고 Picower과 파킨슨병의 기초를 주셔서 감사합니다. H. 장 감사는 NARSAD. RH 에드워즈는 마이클 J. 폭스 재단, 국립 파킨슨병 재단니다 그리고 NIMH 감사합니다. 우리는 TIRF 현미경 설치와 기술 지원 6 OHDA 주사와 조언, 유용한 토론, 영상 분석 프로그램에 대한 Merek 시우에 대한 표시 Sonders 및 월 Schmoranzer에 대한 로버트 버크 감사합니다.

이 방법에 보고된 연구에 사용된 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">Gubernator 외., 과학 324 (5933)가. 1441년부터 1444년까지 (2009)</a> . 1. 급성 striatal 조각 준비 <ol><li> 급성 striatal 조각을 준비하기 전에, 하나는 산소 인공 뇌척수 (ASCF) 사전 뇌 추출에 적어도 15 분 동안 얼음으로 진정해야합니다. ACSF의 얼음 추위를 유지하고 해부하는 동안 산소. ACSF (MM 년) : NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2.4, MgSO4 1.3, KH 2 PO 4 0.3, 포도당 10, HEPES 5; 산도 7.3-7.4, 290-295 mOsm. </li><li> 마취없이 남성 마우스 목을 벨. </li><li> 마우스의 전체 두뇌를 추출하고, Krazy ® 접착제를 사용하여 vibratome에 게재 vibratome 트레이에 탑재합니다. 브레인 추출 및 설치 2 분 이내에 이루어져야합니다. 이 시간 동안 ACSF 얼음 추위를 유지하고 조직의 건강을 유지하기 위해 산소를해야합니다. </li><li> bregma 1.54 사이에 0.62 1 250μm 두께 코로나 striatal 뇌의 슬라이스 컷. 세 전체 조각은 다음 바늘 6 개 반 조각으로자를 수있는 얻을 것입니다. </li><li> 프로브 로딩하기 전에 최소한 1 시간 동안 실온에서 산소 ACSF의 뇌 조각 품어. 조각은 좋은 FFN511 로딩 표시하고 슬라이스 준비 후 최대 4 시간까지 이미징 대해서는 운영중 상태로 유지됩니다. </li></ol> 2. FFN511를 로딩 <ol><li> FFN511 로딩 솔루션 (ACSF에 10μM FFN511) 준비, 또한 ACSF에 ADVASEP - 7 100μM 준비합니다. 모든 솔루션은 신선한 사전 자른에 로딩하기 위해 적어도 15 분 산소해야합니다. </li><li> 개별적으로 실온에서 30 분 FFN511 로딩 솔루션 슬라이스를 품어. </li><li> 그런 다음 실온 2 30 분 산소 100μM ADVASEP - 7 ACSF에 로드된 슬라이스를 잠복기에 의해 세포 조직 바운드 염료를 제거합니다. 조각은 이제 영상에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 3. 뇌 조각의 영상 FFN511 조각에 FFN511의 영상은 multiphoton 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수행됩니다. 우리는 (우리는 이전 자이스 혈구 LSM 510 NLO multiphoton 레이저 스캐닝 현미경을 사용되었으며 어떤 결과가 자이스 혈구 현미경으로 획득했다) 프레리 울티마 multiphoton 레이저 스캐닝 현미경을 사용하고 있습니다. <ol><li> 레코딩 챔버에서 FFN511 - 로드된 슬라이스 (RC - 27L, 워너)을 놓고 분당 1-2 ML의 흐름 속도와 산소 ACSF superfuse. 그런 다음 실험 기간 동안 움직임을 최소화하기 위해 조각 위에 나일론 스트링과 플래티넘 하프를 놓으십시오. 추가 움직임을 최소화하려면 슬라이스가 이전에 영상으로 챔버에 적어도 10 분 동안 안정 수 있습니다. </li><li> 시각화 및 10X 물 침지 목표 아래 명시야 발광와 지느러미 striatum을 찾습니다. </li><li> 이 지역의 장소와 위치 바이폴라 꼬인 텅스텐 전극 자극 실험을 수행하는 경우. 이상적인 이미징 영역은 자극 양극성 전극의 두 팁 사이에 300 μm의 사이에 위치하고 있습니다. 시야의 중심이 지역에 놓으십시오. </li><li> 이미지 FFN511 -라는 63x (0.9 NA) 물 침지 자외선 목표 아래 striatal 터미널. FFN511는 밴드 패스 필터 (480-520 nm의)를 통해 볼 수 있습니다 스펙트럼 물리 striatal 터미널 최적의 형광에서 마이 타이 레이저 760 nm의에 흥분됩니다. 이미지는 512 X 512 픽셀 해상도로 관심의 75 X 75 μm의 영역을 12 비트 형식으로 캡처됩니다. 자극 destaining 실험은 Z - 비행기 1 μm의로 구분하여 Z 축 이동 5-7 이미지의 Z - 시리즈에 대한 보상은 각 기간 동안 얻을 수 있습니다. </li></ol> 4. FFN511 Destaining FFN511 레이블은 KCl 높은 농도 (우리 70 MM KCl을 사용하여), (+) - 암페타민 황산염 (AMPH, 20 μm의), 또는 전기적 자극에 의​​해 어느 destained 수 있습니다. 에 높은 칼륨의 ACSF 솔루션 두뇌 슬라이스에 적용됩니다 KCl destaining 실험, 2 분 이내 FFN511 레이블 destains. 기록은 XYZ - T의 이미지를 시간의 경과에 FFN511 destaining을 추적할 수 있습니다. 다음은 전기 자극에 의​​존 도파민 터미널 destaining 설명 : <ol><li> 시간이 지남에 따라 FFN511 destaining를 추적하려면, XYZ - T의 이미지가 기록됩니다. 슬라이스의 최소한의 움직임을 (Z 축 미만 4 μm의)되도록하려면없고, Z - 스택의 레이저, 제어 시간 시리즈 이미지로 photobleaching이 자극하기 전에 최소한 5 분 취득해야합니다. 그렇지 않으면, 레이저 파워를 조정합니다. </li><li> 1 주파수, 4 또는 20 Hz에서에서 자극을 시작하면서 이러한 컨트롤 이미지에 따라 XYZ - T의 이미지를 계속합니다. 1, 4 또는 20 Hz에서 (300 μs X 1mA)의 자극은 양극성 전극을 사용하여 마스터 - 8 펄스 발생기 (AMPI, 예루살렘, 이스라엘)을 계기로 ISO - 플렉스 자극 아이 솔 레이터에 의해 로컬 striatum에 적용됩니다. 최소화하기 위해릴리스 사이트의 탈분극의 변화, 우리는 주기적 voltammetry에 의해 결정 최대한의 자극 강도의 150 %를 적용 자극 프로토콜을 사용하고 있습니다. </li><li> 이미지 분석을위한 적절한 소프트웨어를 사용합니다. 우리가 실험실에서, 우리는 번이나로 puncta 형광 및 변경 사항을 수치 IDL의 이미지 J (웨인 Rosband, 건강의 국립 연구소, 락빌, MD) 및 사용자 정의 작성된 소프트웨어 (연구 시스템, 볼더, CO)을 사용합니다. </li></ol> Represenative 결과 그림 1은 striatal 슬라이스에 FFN511로드 지금 완료 보여줍니다. 10X 및 60x 목표를 사용하는 대표 이미지는 Fig.1에 표시됩니다. 도파민 단말기의 선택적 라벨링는 20 μm의의 암페타민에 의해 destained 수 있습니다. 높은 KCl에 의해 FFN511 라벨링의 destaining 그림 2 보여줍니다. 지역 전기적 자극에 의​​해 FFN511 라벨링의 destaining 3 쇼 그림. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 라이브 피질 - striatal 급성 조각에 FFN511 라벨 도파민 터미널 (A) 급성 라이브 피질 - striatal 통에 FFN511하여 레이블 :.. striatum에서 풍부한 라벨 (STR), 피질에서 sparser 라벨 (CTX), 그리고 노 레이블 코퍼스의 callosum (CC). 스케일 바. 100 μm의 암페타민에 의해 striatum에서 FFN511의 (B) Destaining. 왼쪽 패널 : 전에 암페타민, 오른쪽 패널 : 20 μm의의 암페타민 20 분 후. 스케일 바 : 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 높은 KCl에 의해 FFN511 라벨의 Destaining. FFN511 라벨이 ACSF 70 MM KCl 2 분 응용 프로그램 내에서 destained입니다. 스케일 바 : 10μm. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. striatum에서 FFN511 라벨링의 주파수 의존 destaining가. (A) 4 Hz에서 현지 자극은 터미널에서 destaining 결과. 자극은 t = 0에서 시작되었다. 스케일 바 : 5 μm의 (B) 4 Hz에서에서 FFN511의 Destaining은 칼슘 2 + - 및 주파수 의존.. 컨트롤이 더 자극 (3 조각에서 153 puncta)를받지 않습니다. 카드뮴 염화물 (200 μm의)와 Destaining 것은 unstimulated 컨트롤 (5 조각에서 475 puncta)로 동일했습니다. 로 계산 값은 각각의 자극 주파수에 대한 destaining 곡선은 하나의 지수 감쇠 함수와 반감기 (T 1 / 2)에 의해 맞는 τ X 0.693 (1 Hz에서 : 9 조각, 4 Hz에서에서 765 puncta : 7 조각에서 410 puncta, 20 Hz에서 6 조각)에서 416 puncta. striatal 두뇌 슬라이스 준비 exocytosis 동안 FFN511 destaining의 2 광자 현미경에서 비디오 현미경을 참조하십시오.

<ol><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
<li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li>
<li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

이 비디오에서는, 우리는 형광 도파민의 analogs를 사용하여 광학 neurotransmission을 시각화하는 방법을 보여줍니다. FFN511 우리가 개발한 FFNs의 첫 세대입니다. 그것은으로 과학에 나타난 시냅스 vesicles로 세포질에서 모노 아민 신경 전달 물질을 실시하고, 특히 피질의 striatum 및 추정 카테 및 / 또는 세로토닌 터미널에서 도파민 터미널 레이블의 연결 기공을 갖는 모노 아민 전송기 (VMAT2)를 (대상으로 설계되었지만 FFN511 상대적으로 소수성이기 때문에 종이), 적절한 로딩 기간은 특이성을 위해 중요합니다. 우리는 그 40 분 이상을위한 인큐베이션은 striatal 조각의 광범위한 특이 현상이 얼룩집니다 발견했습니다. 특이성은 straightforwardly 기능 시냅스 vesicles 이내 FFN의 출시를 일으킬해야 KCl의 높은 농도를 사용 destaining에 의해 결정하실 수 있습니다. 미만 15 분 FFN511하는 슬라이스의 노출은 터미널에있는 색소의 부족 로딩으로 인해 약한 형광 신호가 발생합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 세포 조직 바운드 염료를 제거하는 100μM ADVASEP - 7을 사용합니다. 이 단계는 필요하지 않습니다,하지만 생략하면 ACSF의 워시 아웃 시간 연장해야합니다. 요약, 당신이 선택한 준비에 따라 최적의 레이블을 결정하기 위해 집중 로딩 기간을 수정해야합니다.

<table><tbody><tr><td>FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)</td><td>Columbia University - Dalibor Sames Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADVASEP-7 </td><td>CyDex</td><td>AR-OA7-005</td><td></td></tr><tr><td>RC-27L 기록 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>PELCO PrepEze 6-웰 홀더</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>36157-1</td><td>슬라이스 배양용</td></tr><tr><td>Master-8 펄스 자극기 및 Iso- Flex 자극 절연기</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

개인 presynaptic 터미널에서 도파민 릴리스 ffns와 시각

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

신경계는 시냅스 소포의 융합 동안 신경 전달 물질 방출을 통해 뉴런 사이의 신호를 전송합니다. 신경 전달 물질의 이해와 직접 개별 presynaptic 터미널에서 릴리스를 관찰하기 위해, 우리는 시냅스 소포 모노 아민 전송을위한 기판으로 형광 잘못된 신경 전달 물질을 설계했습니다. striatum의 이미지 도파민 릴리스 이러한 프로브를 사용하여, 우리는 시냅스 소성에 관련 몇 가지 관찰을했다. 우리는 자극마다 신경 전달 물질을 방출하는 시​​냅스 vesicles의 분율이 자극 주파수에 의존 것으로 나타났습니다. kinetically 별개 &quot;예약&quot;시냅스 소포 인구는 이러한 실험 조건 하에서 관찰되지 않았습니다. presynaptic 터미널의 주파수 종속 이질은 그 presynaptic 선택의 주파수 의존 코딩을위한 메커니즘을 나타내는 D2 도파민 수용체에 부분적으로 의존했다 발표했다. 휘 장 및 니코 G.의 Gubernator이 작품에 동등하게 공헌했습니다.

새로운 형광 도파민의 analogs를 사용하여 광학 neurotransmission을 측정하는 것을 의미합니다.

개인 Presynaptic 터미널에서 도파민 릴리스 FFNs와 시각

신경계는 시냅스 소포의 융합 과정 중 신경전달물질의 방출을 통해 뉴런 간에 신호를 전달합니다. 신경전달물질의 흡수 및 ...를 관찰하기 위해

형광 가성 신경전달물질. FFN 511은 뇌 절편에 적용했을 때 시냅스 물리적 모노아민 운반체의 기질로 작용할 수 있는 형광 모노아민입니다. FN 511은 모노아민 운반체를 통해 도파민성 시냅스 소포로 흡수되며, S stratum에 있는 것과 같은 모노아민 뉴런의 시냅스 전단자로부터 신경전달물질의 방출을 직접 시각화하는 데 사용될 수 있습니다. 단자로부터의 전달물질 방출은 절편 내에서 점상 형광 신호의 감소로 관찰됩니다.본 영상에서는 FFN 511로 염색된 250 µm 두께의 관상 면 전두엽 절편을 제작하고 다광자 레이저 현미경을 사용하여 이미징하는 과정을 다룹니다. iCal 방출의 주파수 의존적 불균질성을 보여주는 검출 실험이 제시됩니다. 안녕하세요, 컬럼비아 대학교 신경학과의 David s 연구실 소속 HU입니다.안녕하세요, Soldier Lab의 Minerva입니다. 오늘은 형광 가성 신경전달물질을 사용하여 뇌 절편 내의 도파민 말단을 표지하는 과정을 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 도파민 방출을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작해 보겠습니다. 급성 뇌 절편을 준비하기 전에, 인공 뇌척수액(A CSF)에 산소를 공급하고 뇌 추출 전 최소 15분 동안 얼음으로 냉각시켜야 합니다. 해부 과정 동안 A CSF를 차갑게 유지하며 산소 공급을 지속하십시오. 마우스에서 뇌 전체를 추출하여 바이브람 트레이(vibram tray) 위에 올린 뒤, 순간접착제를 사용하여 바이브람 위에 고정합니다. 뇌 추출 및 고정 작업은 2분 이내에 완료되어야 합니다.냉각된 산소 공급 A CSF로 채운 트레이에 +1.54에서 +0.62 사이의 250 µm 두께로 절단한 관상면 직선 또는 뇌 절편을 넣습니다. 3개의 전체 절편을 얻게 되며, 이는 바늘을 사용하여 6개의 반절편으로 절단할 수 있습니다. 뇌 절편이 배양되는 동안 실온의 산소 공급 A CSF에서 최소 1시간 동안 배양하십시오.산소화된 A CSF 내에 10 millimolar FFN 511 스톡 솔루션을 첨가하여 10 micromolar FFN 511 로딩 솔루션을 준비합니다. 그 후, A CSF로 100 micromolar A-D-V-A-S-E-P seven 솔루션을 준비합니다. 슬라이스에 각각 로딩하기 전, 두 솔루션을 최소 15분 동안 산소화합니다. 각 뇌 슬라이스를 FFN 511 로딩 솔루션과 함께 실온에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 로딩된 슬라이스를 산소화된 100 µM advers, seven A CSF 내에서 실온으로 30분 동안 배양하여 세포 외 조직에 결합된 di를 제거합니다. 이제 슬라이스를 이미징할 준비가 되었습니다. FFN 511 염색은 prairie Ultima 다광자 레이저 주사 현미경을 사용하여 슬라이스 내에서 이미징합니다. FFN 511이 로딩된 슬라이스를 기록 챔버에 넣고 산소화된 A CSF를 1~2 mL/min의 유속으로 관류합니다. 그다음 슬라이스 위에 나일론 줄이 달린 백금 하프를 배치하여 움직임을 최소화합니다.움직임을 더욱 최소화하기 위해, 이미징 전 챔버 내에서 슬라이스가 최소 10분 동안 안정화되도록 합니다. 10 x 수침 렌즈 하에서 명시야 발광을 통해 dorsal stri AUM을 시각화하고 위치를 확인한 후, 자극 실험을 수행하기 위해 이 영역에 양극성 트위스티드 텅스텐 전극을 배치하고 고정합니다. 유휴 이미징 영역은 300 micrometers 이내에 위치합니다.자극용 양극 전극의 두 팁 사이에 FFN 511로 표지된 Sal terminals 영역이 시야 이미지의 중심에 오도록 배치하고, 63 x 수침 자외선 대물렌즈로 관찰합니다. FFN 511은 Spectral Physics사의 MiTai 레이저를 사용하여 760 nanometers에서 들뜨게 합니다. SAL terminals의 최적 형광은 밴드패스 필터를 통해 확인하며, 512 by 512 픽셀 해상도에서 75 by 75 micrometer 관심 영역(ROI)으로 12비트 형식의 이미지를 캡처합니다. FFN 511로 표지된 Sal 도파민 터미널의 예시 이미지가 여기에 제시되어 있습니다.FFN 511 라벨은 고농도의 potassium chloride amphetamine sulfate 또는 potassium chloride 탈착 실험에서의 전기 자극에 의해 탈착될 수 있습니다. 고농도 potassium A CSF 용액을 뇌 절편에 처리하면 FFN 511 라벨이 4분 이내에 탈착됩니다. 전기 자극에 의한 FFN 511 염색의 경우, 시간에 따른 FFN 511 탈착 과정을 추적하기 위해 XYZT 이미지를 기록하십시오. 자극 전 최소 5분 동안 Zack의 대조군 시계열 이미지를 획득하여 절편의 움직임을 최소화하고, 이미지 획득 후 레이저에 의한 광퇴색(photo bleaching)이 일어나지 않도록 하십시오.양극 전극을 사용하는 master eight 펄스 발생기에 의해 트리거되는 isof lex 자극 절연기를 통해 선조체에 국소적으로 1, 4 또는 20 Hz 주파수의 자극을 가하면서 XYZT 이미징을 계속합니다. 이 영상은 SAL 뇌 절편에서 엑소사이토시스(exocytosis) 동안의 FFN 511의 소실을 보여줍니다. 준비 단계에서 SAL로의 FFN 511 로딩이 완료되면 선조체에서의 풍부한 라벨링, 피질에서의 희소한 라벨링, 그리고 뇌량에서의 라벨링 없음이 관찰됩니다.도파민 말단의 선택적 표지는 이 대표 이미지들에서 보는 바와 같이, potassium chloride 처리 전과 70 mM potassium chloride 처리 2분 후의 모습을 통해 potassium chloride에 의해 제거될 수 있음을 알 수 있습니다. FFN 511 표지의 CSF 제거는 amphetamine으로도 수행할 수 있습니다. 그리고 이 이미지는 amphetamine 처리 전 선조체에서의 FFN 511 표지를 보여줍니다.이 이미지는 20 µM 암페타민으로 처리한 20분 후의 선조체를 보여줍니다. 국소 전기 자극에 의한 FFN 511 표지의 탈착은 자극 전, 그리고 4 Hz 자극 시작 후 217초와 514초 때의 선조체 내 FFN 511 표지를 보여주는 이 이미지들에 나타나 있습니다. 시간에 따른 정규화된 형광 강도를 나타낸 이 그래프는 FFN 511의 탈착이 칼슘 및 빈도 의존적임을 보여주며, 빈 삼각형으로 표시된 대조군은 자극을 받지 않았습니다. 빈 원으로 표시된 염화 카드뮴 처리군은 자극을 받지 않은 대조군과 동일했습니다.색상 원으로 표시된 각 자극 빈도에 대한 감쇠 곡선은 단일 지수 감쇠 함수로 피팅되었으며, 반감기 값은 tau에 0.693을 곱하여 계산되었습니다. 지금까지 급성 뇌 절편의 도파민 말단에 형광 힘 신경전달물질 FFN five 11을 로딩하는 방법과 고농도 칼륨 및 자극 유도를 통해 이를 방출시키는 방법을 보여드렸습니다. 이것은 개별 시냅스 말단 수준에서 신경전달물질의 방출을 광학적으로 조사하기 위해 개발된 최초의 수단입니다.이 절차를 수행할 때, 슬라이스의 건강한 상태를 유지하는 것이 중요하며 로딩 시간, 배경 표백 및 움직임 아티팩트에 유의해야 합니다. 슬라이스는 슬라이스 준비 후 최대 4시간까지 양호한 FFN five 11 로딩 및 이미징 상태를 보입니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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