단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR
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디지털 중합효소 연쇄 반응(dPCR)은 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)를 정량화하는 데 유용하며, 이는 게놈의 특정 위치에서 단일 뉴클레오티드를 치환하면 두 개의 뉴클레오티드 변이 또는 대립유전자를 생성하는 돌연
변이입니다.chip-in-a-tube dPCR 기술을 사용하여 정량화를 시작하려면 SNV(돌연변이 대립유전자 및 해당 야생형 대립유전자)가 포함된 DNA 샘플을 채취합니다. 내열성 DNA 중합효소, dNTP 및 프라이머를 포함하는 혼합물을 추가합니다.
다음으로, 대립유전자를 구별하기 위해 다양한 색상의 형광으로 표지된 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브(allele-specific oligonucleotide probe)와 소광제(quencher) 분자를 추가합니다. 담금질제와 기자의 근접성은 형광을 억제합니다.
용액을 microfluidic 칩의 반응 챔버로 분할합니다. 대립유전자를 포함하는 각 챔버는 독립적인 반응 용기 역할을 합니다.
칩이 있는 튜브를 열 순환기 안에 넣고 반응을 시작합니다. 고온에서 이중 가닥 DNA는 단일 가닥으로 변성됩니다. 온도를 낮추어 프라이머와 올리고뉴클레오티드 프로브를 상보적 영역으로 어닐링합니다.
적절한 확장 온도에서 DNA 중합효소는 프라이머를 확장하고 프로브를 절단합니다. 담금질제로부터의 거리로 인해 기자의 형광 방출이 가능합니다.
서로 다른 색의 형광 신호를 읽고, 대립유전자가 포함된 챔버를 검출하기 위한 위치 플롯을 만듭니다.
돌연변이 대립유전자(variant allele fraction)의 빈도를 결정하기 위해 돌연변이 대립유전자와 야생형 대립유전자를 포함하는 방의 비율을 계산합니다.
