Name: 동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석 엔테로 종.과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: 학습하세요 이중 디지털 PCR 분석을 통해 수집에서 Enterococcus spp.와 HF183 마커를 동시 정량하는 방법을 배우세요. 이 기술은 표준 곡선 없이 정확한 수질 모니터링을 제공합니다.

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1. 분석 혼합물 준비 <ol><li> TE의 pH 8 버퍼에있는 모든 분자 수준의 물에 프라이머 및 프로브 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12 100 μmol / L의 재고 농도를 확인; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3]. 참고 :이 타겟 프로브는 형광 재료 / 장비 목록에 표시된 다른 형광 (7)으로 표시됩니다. </li><li> 계획 반응에 따라 혼합하여 12 μl의 디지털 PCR 믹스 마스터 믹스를 준비 0.216 ㎕를 앞으로 각 (배 재고, 자재 / 장비의 목록 참조) 프라이머, 0.06 ㎕를 각 형광 프로브를 반대하고, 클레아없는 물 μl를 5.016 (최종 농도 : 900 nM의 각각의 프라이머, 250 nM의 각 프로브). 용액에 공기 방울을 소개 않도록주의하면서 혼합 아래로 적어도 10 시간을 피펫합니다. </li><li> 6 μL의 DNA 템플릿에 혼합 일반 PCR 튜브 또는 판에, (단계 1.2에서) 피펫 18 μL 마스터 믹스 (기술은 기존과 같이 추출교활한 13) 액적 생성에 대한 분석 혼합물을 확인합니다. 중복 샘플을 실행하면, 피펫 마스터 믹스 36 μl를 잘 각각에 12 μl의 DNA 템플릿입니다. 접시에 해당하는 복제 우물이 비어 둡니다. 양성 대조군 (자재 / 장비의 목록 참조)없이 템플릿 컨트롤 (NTC를) 포함 (즉, 템플릿으로 사용되는 분자 수준의 물). 주 : 양성 대조군 분석이 올바르게 실행되고 있는지 확인하기 위해 필요하며, NTC 플레이트 내에 오염이없는 보장하고 데이터 분석 뒷부분 형광 기준선을 설정하는 것이 필요하다. 처음 사용자는 모두 원액 희석 DNA 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 2. 물방울 생성 및 PCR 플레이트 설치 <ol><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 아래로 약 15 시간을 피펫 팅하여 분석 혼합물을 섞는다. 피펫 팁이 혼합물 내에서 초과 거품을 방지하기 위해 액체 내에서 유지 있는지 확인합니다. </li><li> 기능ERT의 흰색 카트리지 홀더에 카트리지 1 (포함 8 우물) 카트리지 홀더 종료를 클릭합니다. 카트리지 1은 제자리에 있으며 방울을 생성하는 동안 홀더에서 빠질 수 없습니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 조심스럽게 기포를 도입하지 않고 카트리지 표시된 &quot;예제&quot;의 중간 위치로 분석 혼합물 20 μl를 옮긴다. </li><li> 피펫은 카트리지의 좌측 액적 생성 오일을 70 μL의 ( &#39;유&#39;로 표시). </li><li> 개스킷 개스킷과 플랫 (4)에 의해 균일하게 유지된다 확인한와 커버 카트리지는 카트리지의 가장자리를 향해 틱. 열고 카트리지를 배치 방울 생성기의 녹색 조명 버튼을 누릅니다. 를 눌러 발전기를 닫 버튼을 다시 녹색 조명. 참고 : 문이 닫히고 나면, 버튼을 흐리게 문을 다시 열 수 없으며 액적 발생 즉시 약 1 분 동안 계속 시작합니다. </li><li> 두 번째 이상 8 반응, 장소 카트리지 2 일 경우액적 생성 총 설정 시간을 저장하는 진행 중에 흰색 카트리지 홀더 및 카트리지 (1)과 동일한 방법으로 준비한다. </li><li> 희미한 조명 버튼을 액적 생성의 완료를 나타내는 녹색으로 바뀌면 방울 생성기 문을 엽니 다. 방울 생성기에 흰색 카트리지 1 포함 카트리지 홀더, 따로 설정 및 장소 카트리지 (2)를 제거합니다. </li><li> 카트리지 1 가스켓을 제거하고 폐기합니다. 부드럽게 열 사이클링 (실온에서 유지), 최종 PCR 플레이트에 카트리지 ( &#39;물방울&#39;로 표시)의 세 번째 열에서 생성 된 방울의 전체 부피 (약 40 μL)를 옮긴다. 참고 : 새로 생성 된 물방울을 깰 수있는 작업으로 흰색 카트리지 홀더를 해제합니다하지 마십시오 방울 최종 판에 전사 된 후에 만​​ 카트리지 홀더를 연다. </li><li> 반복하여 추가 샘플에 대한 2.1-2.7 단계를 반복합니다. </li><li> 모든 방울 최종 PCR 플레이트되면 뚫을 배치접시 위에 호일 커버와 접시 시일에 놓습니다. 실러에 180 ° C 키를 눌러 &#39;재생&#39;에 대한 봉인을 설정하고 10 초 동안 실을 수 있습니다. </li></ol> 3. 열 사이클링과 물방울 읽기 <ol><li> 열 사이 클러에 밀봉 판을 놓고, 단계 2.7에서 사용 된 최종 PCR 플레이트, 2.0 ° C / sec의 온도 램핑 속도에 대응 한. </li><li> 다음 열 프로그램을 실행하여 10 분간 유지 한 다음 94 ℃에서 30 초, 95 ° C에서 10 분, 60 ° C에서 60 초 선택적 98 ° C (AT : 최종 보류 4 또는 15 ° C). </li><li> 사이클 종료 후, 각 웰에 각각의 액적에서 형광의 자동 측정을위한 액적 리더 플레이트를 옮긴다. 또한, 액적 읽기 전에 최대 3 일 동안 4 ° C에서 접시를 저장합니다. 물방울 읽기를 진행하기 전에 실온에 있는지 확인. <ol><li> 설정에 방울 독서를 동반하는 소프트웨어를 엽니 다. 에서&#39;샘플&#39;, &#39;분석 1&#39;과 &#39;분석 2.&#39;빈 96 웰 플레이트의 개략적 인을 포함하는 기본 &#39;설정&#39;메뉴는 두 번 세 부분을 포함하는 메뉴를 엽니 다 잘 A1을 클릭 </li><li> &#39;샘플&#39;섹션에서 &#39;이름&#39;키를 누릅니다 입력하거나 표시 오른쪽에있는 상자를 확인 표시된 상자에 샘플 ID를 입력합니다 &#39;적용을.&#39; 다음, 메뉴 표시 &#39;실험&#39;드롭 다운을 클릭하고 &#39;RED&#39;(희귀 이벤트 감지)를 선택하고 입력을 클릭합니다. </li><li> &#39;분석 1.&#39;표시 부분으로 이동 &#39;이름&#39;섹션에서 분석 (예를 들어, 엔테로)를 작성하여 입력을 클릭합니다. 라벨 &#39;형식&#39;아래 상자에서 드롭 다운 메뉴를 클릭하고 &#39;채널 알 수없는 1&#39;을 선택하고 입력을 클릭합니다. </li><li> &#39;분석 2.&#39;표시 부분으로 이동 &#39;이름&#39;섹션에서 분석 (예 : HF183)를 작성하여 입력을 클릭합니다. 라벨 &#39;형식&#39;아래 상자에 메뉴 드롭 다운을 클릭&#39;채널 알 수없는 2&#39;를 선택하고 입력을 클릭 거라고. 3.3.4에 3.3.2 지금 단계에서 모든 정보는 잘 A1에서 제시한다. </li><li> 방울을 포함하는 모든 후속 우물의 이름을 지정합니다. 총 설치 시간을 절약하기 위해 동시에 여러 우물을 선택하는 &#39;시프트&#39;또는 &#39;Ctrl 키를,&#39;을 클릭합니다. </li><li> 판의 디지털 묘사 메뉴의 오른쪽 하단에 물리적 판을 눌러 &#39;OK&#39;를 반영합니다. &#39;템플릿&#39;섹션 아래에있는 판 회로도의 상단에 표시되는 새 메뉴에서 &#39;다른 이름으로 저장&#39;와 이름을 선택하고 판을 저장합니다. </li><li> 화면의 왼쪽에있는 &#39;실행&#39;을 클릭하고 팝업 아웃 &quot;실행 옵션&quot;창에 적절한 염료 설정을 선택합니다. 데이터 수집 시작하고 소프트웨어에서 실시간으로 표시됩니다. </li></ol></li></ol> 4. 데이터 분석 및보고 <ol><li> 독자가 완료되고 상자 &#39;완벽한 실행&#39;라는 나타나면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. 참고 : 소프트도자기는 소프트웨어의 &#39;분석&#39;섹션에서 최종 데이터 파일을 표시합니다. 이 관점에서, 소프트웨어는 &#39;2D 진폭의 데이터 플롯에 선택한 모든 접시에 우물과 기본값을 가지고있다. </li><li> 양극과 음극 방울 사이의 거리를 확인합니다. NTC 우물에있는 모든 방울의 형광베이스 라인 근처에 있는지 확인합니다. </li><li> 표시된 버튼을 클릭 &#39;이벤트.&#39; 제시된 막대 그래프의 오른쪽에 &#39;총&#39;라는 이름의 상자 당 잘 받아 방울의 총 수를 표시하기 위해 하단에있는 &quot;하나&quot;라는 이름의 상자를 클릭합니다. Ctrl 키를 누른 제외 할 잘 (들)을 클릭하여 &lt;10,000 방울 (7)를 포함하는 모든 우물을 제외합니다. </li><li> 모두 타겟 NTC 우물에 부정적인 방울 위의 약 하나의 표준 편차 (500-700 형광 단위)에서 형광 임계 값을 설정하는 &#39;1D 진폭&#39;로 표시 버튼을 클릭합니다. 화면 유엔의 바로 왼쪽에두 개의 임계 버튼을 보여주는 &#39;자동 분석&#39;그것을 통해 실행하는 솔리드 핑크 수평 라인이 오른쪽에있는 아이콘을 선택 데르. </li><li> 진폭 그래프의 각에서 &#39;설정 임계 값&#39;의 왼쪽에있는 상자를 클릭하고 적절한 형광 임계 값을 입력합니다. μL 반응 당 복사본 목표 농도를 자동적으로 계산된다. 주 : 임계 값 다른 표적에 대해 동일 할 필요는 없다. </li><li> 1D 진폭 화면의 왼쪽 상단 모서리에있는 &#39;내보내기&#39;버튼을 클릭하여 .csv 파일에 결과를 보냅니다. .csv 파일에서 DNA 템플릿 μL 당 대상의 복사 ㎕의 반응에 따라 대상의 사본 (엔테로 종의 23S 유전자. 또는 HF183 마커)에서 변환 (4)에 의해 수출 목표 농도를 곱합니다. </li></ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 마스터 믹스 종래 qPCR의 마스터 믹스보다 점성이기 때문에 먼저, 분석 혼합물의 혼합은 어렵다. 간단한 텍싱 차례로 분석 혼합물에이어서 방울에 DNA 템플릿의 비 균일 한 분포로 연결 불충분 한 혼합, 발생할 수 있습니다. 프로토콜에 설명 된 혼합 별 피펫 팅 기술은 정확한 dPCR 정량을 보장하기 위해 따라야합니다. 둘째, 물방울이 균일 한 형태와 크기로 생성되도록하는 것이 중요하다. 시간이 방울 생성기가 하나의 카트리지가 평소보다 짧은에 방울 생성을 완료하는 데 걸리는 경우 경우 염두해야합니다. 이 최적의 액적 생성을 나타낼 수있다. 필요한 경우, 각각의 카트리지의 액적 생성 시간이 문제 해결을 위해 기록 될 수있다. 셋째, 전단없이 최종 PCR 플레이트에 카트리지로부터 발생 된 물방울의 전체 40 μL를 전송하는 것이 중요방울 및 정량만큼 방울을 가지고 있지 마십시오. 다음 기술은 전송을 위해 사용될 수있다 : 1) 40 μL에 멀티 채널 피펫을 설정하고 45 ° 각도 &#...

들이보다 빠르고 유연하고 전통 문화 기반 방법에 비해 특정한 때문에 정량적 PCR (qPCR에) 방법이 널리 오락 수질 모니터링 및 미생물 소스 추적 애플리케이션에 사용되어왔다. 따라서, qPCR에이 같은 엔테로 종으로 일반 배설물 지표에 대한 신속한 물 모니터링 결과를 달성하는 것이 좋습니다. 개정 USEPA 레크리에이션 수질 기준 1. 대부분의 qPCR 분석은 개발 환경이 물에 분변 오염의 소스를 식별하기위한 검증되었다. 이들 중에서도 HF183 마커 분석은 가장 자주 인간 분변 오염 연관된 3 식별하는데 사용들이다. 그들이 정량 표준 곡선에 의존하기 때문에, qPCR의 결과는 종종 편향 될 수있다. qPCR에는 스탠에서 자신의 정량주기 (Cq와)를 보간하여 샘플 대상의 알 수없는 농도를 정량화Cq와와 직렬로 희석 된 표준 세트의 로그 양 사이에 선형 관계를 설명 바 닥 곡선. 안정적이고 일관된 표준 참조 물질의 부족 때문에 크게 qPCR에 결과를 바이어스 할 수 있습니다. 연구 qPCR의 결과가 서로 다른 공급 업체의 4에서 약 절반 로그 사용 기준에 차이와 같은 공급 업체 5 표준의 다른 배치를 사용하여 2 배에 의해 것으로 나타났다. 디지털 PCR (dPCR) 기술은 균일 한 나노 리터 또는 피코 리터 반응 6 수천 또는 수백만 벌크 qPCR의 분할에 의해 생성 된 소형 PCR들의 다수의 긍정의 빈도를 카운트하여 미지 시료를 정량화한다. 파티션이 물 유 방울 (즉,이 문서) 또는 칩에 작은 챔버 경우 그것은 각각 (즉,이 문서) 방울 디지털 PCR 또는 챔버 디지털 PCR로 언급된다. 높은 샘플 농도는 대상 DNA의 존재를 야기 할파티션의 높은 비율 (따라서 긍정적 인 PCR), 포아송 분포로 근사 관계. 이와 같이, 이진 결과 (양 또는 음 PCR)이 기록되어 포지티브 액적 주파수 qPCR에 같이 표준 곡선에 대한 필요성을 제거 직접 포아송 근사 통해 미지의 샘플 농도를 계산하는데 사용된다. 디지털 PCR 정량이 진 본성은 qPCR에 7 위에 추가 이점을 제공한다. 지연 증폭 여전히 양성 PCR을 수득 할 수 있기 때문에, dPCR 정량화는 증폭 효율을 감소 억제에 대해 더 강력하다. qPCR에 8 ~ 10에 비해 dPCR 높은 정밀도로 이어지는, qPCR에있다 마찬가지로, dPCR 정량이 된 CQ 값의 변동에 의해 영향을받지 않습니다. 또한, 분할 프로세스는 효과적으로 amplificatio 동안 (기판의 경쟁을 최소화하는 각 방울에 타겟 DNA에 존재하는 매우 소량 보장qPCR에에 (즉, 분석이 동시에 두 개의 DNA 목표를 측정) 양면 인쇄를 달성하기위한 일반적인 장애물 서로 다른 DNA 대상)의 n은. 따라서, 양면 또는 단면에 실행 (즉 하나의 대상이 하나의 분석에서 측정) 여부를 dPCR 모두 대상 7,11의 거의 구별 정량을 생산하고 있습니다. 이 문서에서 설명하는 디지털 PCR 분석 (EntHF183 dPCR)의 목표는 일반 배설물 표시 엔테로 종의 동시 직접 정량화를 얻을 수 있습니다. 향상된 정밀도, 재현성 및 억제에 대한 견고성과 인간 배설물 관련 HF183 마커는 qPCR에 비교 대응. 이 분석은 성공적 환경 담수, 해수 및 각종 분뇨 7 분변 오염의 정량을 위해 사용되었지만, 또한 물 및 폐수의 다른 유형에도 적용될 수있다. 이 분석은 때문에 그것을 퇴적물 또는 토양 분석을위한 큰 약속을 보유하고억제에 높은 내성을이야,하지만 억제제는 샘플의 이러한 종류의 혼합의 추가 시험 때문에 복잡성 요구된다.

<table><tbody><tr><td>낮은 바인딩 마이크로 튜브</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>시약 저장, 마스터 믹스 샘플 / 생산</td></tr><tr><td>뉴클레아제 무료 물</td><td>FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8 버퍼</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>하드 쉘 96 웰 플레이트</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>초기 마스터 믹스 및 샘플 접종</td></tr><tr><td>알루미늄 밀봉 필름</td><td>BioRad</td><td>359-0133</td><td>샘플 플레이트를 밀봉하려면</td></tr><tr><td>액적 발생기</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>액적 생성 오일</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>카트리지</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 카트리지 홀더</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>개스킷</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; l 피펫 팁</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td> 카트리지 200 &#956<td>에 대한 샘플/마스터 믹스 tansferring용</td></tr><tr><td>; l 피펫 팁</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>최종 Twin.Tec 플레이트로 액적 이송용</td></tr><tr><td>Twin.Tec 96 웰 플레이트</td><td>Eppendorf</td><td>951020320</td><td>최종 액적 열 순환 및 판독용</td></tr><tr><td>피어싱 가능한 열 밀봉 호일</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>열 순환 전 Twin.Tec 플레이트 밀봉</td></tr><tr><td>PX1 PCR 플레이트 씰러</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 열순환기</td><td>BioRad</td><td>CFX96 및 C1000</td><td>열 순환기만 필요하며, 광학은 필요하지 않습니다</td></tr>. <tr><td>QX100 드롭릿 리더</td><td>BioRad</td><td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td>드롭릿 리더 오일</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>드롭릿 PCR 슈퍼믹스&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>i.e. 원고의 디지털 PCR 믹스</td></tr><tr><td>QuantaSoft 소프트웨어(v1.3.2)Quantasoft</td><td>&nbsp;</td><td>QX100&nbsp;</td><td>ddPCR 데이터 보기, 분석 및 내보내기용</td></tr><tr><td>Entero Forward Primer (Ent F1A)</td><td>Operon</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>대체 공급 업체 사용 가능</td></tr><tr><td>Entero Reverse Primer (Ent R1)</td><td>Operon</td><td>CAGTGCTCTACCTCCATCATT</td><td>대체 공급 업체 사용 가능</td></tr><tr><td>Entero Probe (GPL813TQ)</td><td>Operon</td><td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]</td><td>대체 공급 업체를 사용할 수 있지만 플로로포어는 FAM</td></tr><tr><td>HF183 Forward Primer ( HF183-1)</td><td>Operon</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td><td>대체 공급업체를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>HF183 Reverse Primer (BthetR1)</td><td>Operon</td><td>CGTAGGAGTTTGGACCGTGT</td><td>대체 공급업체를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>HF183 프로브(BthetP1)</td><td>Operon</td><td>[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]</td><td>대체 공급업체를 사용할 수 있지만 플로로포어는 HEX여야 합니다(VIC를 사용하는 경우 적절한 매트릭스 보상을 선택해야 합니다. &nbsp;</td></tr><tr><td>양성 대조군</td><td></td><td></td><td>E. faecalis 게놈 DNA와 HF183 표준 플라스미드의 혼합물(IDT에서 주문). 주문한 HF183 플라스미드의 E. faecalis 배양에 대한 자세한 방법은 Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008)를 참조하십시오. 실험실에서 준비한 <E. faecalis 게놈 DNA 대신 상업적으로 사용 가능한 em>Enterococcus DNA 표준물(ATCC 29212Q-FZ)도 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

동시 정량을위한 이중 디지털 pcr 분석<em&gt; 엔테로 종.</em&gt;과 바다에서 인간 방패 관련 hf183 마커

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

이 원고는 엔테로 종의 동시 정량. 인간 배설물 관련 HF183 마커에 대한 이중 디지털 PCR 분석 (EntHF183 dPCR)에 대해 설명합니다. EntHF183 이중 dPCR (EntHF183 dPCR로 함 이에 관해서) 분석은 공개 된 개별 정량 PCR (qPCR에) 대응과 같은 프라이머 및 프로브 시퀀스를 사용합니다. 마찬가지로, 이전 qPCR에 대해 수행과 같은 물 여과 및 DNA 추출 절차는 dPCR를 실행하기 전에 다음에 있습니다. 그러나, 이중 dPCR 분석은 qPCR에 분석을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 가장 중요한 dPCR 분석은 대상의 직접 정량화하여, 따라서 표준 곡선을 실행에 대한 필요성, 관련 바이어스 및 가변성을 제거합니다. qPCR에있는 (즉, 동시 정량) 엔테로 및 HF183를 양면 인쇄하는 동안뿐만 아니라, 종종 샘플 덜 풍부한 대상의 심각한 과소 평가로 연결, dPCR 두 목표의 일관성 정량을 제공하며, 자극그녀는 동일한 반응을 개별적으로 또는 동시에 정량. dPCR 분석도 qPCR에 의해 용인보다 높은 크기 1 ~ 2 오더이다 PCR 억제제의 농도를 허용 할 수있다. 그것은 동시에 두 개의 별도 qPCR에 분석을 실행할 필요없이 환경 바다에서 모두 일반과 인간의 관련 분변 오염에 대한 정확하고 반복 가능한 정보를 제공하기 때문에 이러한 장점은 EntHF183 dPCR 분석이 특히 매력적. qPCR에 이상 장점에도 불구하고, 현재 사용 가능한 장비와 dPCR 분석의 상부 정량 한계는 약 qPCR에 의한 달성보다 낮은 크기의 네 주문이다. 따라서, 희석 등의 일반적으로 하수 유출이 관찰 된 것과 대상 생물의 높은 농도의 측정을 위해 요구된다.

좋은 EntHF183 이중 dPCR 실행 허용 방울 (약 10,000-17,000) 및 음과 양의 물방울 7 형광 값 사이의 비교적 큰 차이 (약 5,000)의 상대적으로 높은 숫자가 발생한다. 방울의 수가 비정상적으로 낮은 가능성 액적 생성 공정에서 문제를 나타내고, 만 방울의 차단이 문서에서 사용되는 액적 dPCR 시스템으로부터 경험적 데이터에 기초하여 제시된다. 양극과 음극 방울 사이의 약한 분리 (즉 작은 형광 차이) 억제하거나 성능이 저하 된 프로브 (7)을 표시 할 수있다. qPCR에이 표준과 관련된 편견에 대한 수정과 더 억제 7가없는 경우 전반적으로, EntHF183 이중 dPCR 분석은 단순 qPCR에의 것과 매우 유사한 결과를 얻을 수 ...

이 원고를 동시에 엔테로 종을 정량화하는 데 사용할 수있는 이중 디지털 PCR 분석. 레크리에이션 바다에서 일반과 인간의 관련 분변 오염의 지표로 HF183 유전자 마커를 설명합니다.

동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석<em&gt; 엔테로 종.</em&gt;과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

본 Duplex Digital PCR 분석의 전반적인 목표는 수중의 일반 분변 오염과 인간 유래 분변 오염을 동시에 정량화하는 것입니다. 이 분석은 레크리에이션 용수 수질 모니터링에서 일반 분변 지표균인 Enterococcus와 더욱 중요한 인간 분변 관련 HF183 마커가 수중에 얼마나 존재하는지와 같은 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 분석법의 주요 장점은 한 번의 반응으로 두 가지 표적을 정량할 수 있다는 점이며, qPCR과 비교하여 표준 곡선을 작성할 필요가 없으므로 그와 관련된 편향성과 가변성을 제거할 수 있다는 것입니다. 본 절차의 시연은 수석 연구 기술자인 Meredith Raith가 진행하겠습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 먼저 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 모든 프라이머는 Molecular Grade Water에, 프로브는 TEPH 8 Buffer에 사용하여 100 $\mu\text{M}$의 스톡 농도로 준비하십시오.다음으로, 적절한 양의 Digital PCR mix, 정방향 및 역방향 프라이머, 형광 프로브, 그리고 Nuclease-Free Water를 혼합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 용액에 기포가 생기지 않도록 주의하며 피펫팅을 최소 10회 이상 반복하여 혼합합니다. dPCR 마스터 믹스는 일반적인 qPCR 마스터 믹스보다 점도가 높으므로, 균질한 용액을 만들기 위해 피펫팅 혼합 기술을 사용하는 것이 필요합니다.이를 통해 후속 단계에서 정확한 dPCR 정량이 가능합니다. 샘플을 중복으로 실행하기 위한 액적 생성용 분석 혼합물(Assay Mixture)을 조제하려면, 일반 PCR 플레이트에 마스터 믹스(Master Mix) 36 µL를 피펫으로 분주합니다. 각 36 µL의 마스터 믹스에 DNA 템플릿 12 µL를 혼합하며, 플레이트 상의 해당 반복 실험 웰은 비워 둡니다.분석이 적절하게 수행되고 있는지 확인하기 위해 양성 대조군을 포함하십시오. 플레이트 내에 오염이 없는지 확인하고 이후 데이터 분석을 위한 형광 베이스라인을 설정하기 위해 템플릿 제외 대조군(NTC)을 포함하십시오. 드롭렛 생성기를 설정하기 전에 멀티채널 피펫을 사용하여 분석 혼합물을 약 15회 정도 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.혼합물 내에 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 피펫 팁이 액체 속에 머물도록 하십시오. 다음으로, 8개의 웰이 포함된 카트리지 1을 흰색 카트리지 홀더에 삽입하고 홀더를 딸깍 소리가 나도록 닫으십시오. 이제 카트리지 1이 단단히 고정되어 액적 생성 중에 홀더에서 이탈되지 않습니다.멀티채널 피펫을 사용하여 공기 방울이 생기지 않도록 Assay Mixture 20 µL를 카트리지의 sample 표시가 된 중앙 위치로 조심스럽게 옮깁니다. 카트리지의 oil 표시가 된 왼쪽에 Droplet Generation oil 70 µL를 피펫팅합니다. 가스켓이 평평하게 놓이고 카트리지 가장자리를 향한 4개의 눈금에 의해 고르게 고정되었는지 확인하며 카트리지를 가스켓으로 덮습니다.Droplet Generator의 녹색 등이 켜진 버튼을 눌러 도어를 열고 카트리지를 배치하십시오. 버튼을 다시 눌러 생성기를 닫습니다. 도어가 닫히면 녹색 버튼의 불이 꺼지며 도어를 다시 열 수 없습니다.액적 생성이 즉시 시작되어 약 1분 동안 계속됩니다. 액적 생성 작업이 진행되는 동안 두 번째 카트리지를 두 번째 흰색 카트리지 홀더에 넣고 첫 번째 카트리지와 동일한 방식으로 준비하십시오. 액적 생성이 완료되면 희미하게 켜져 있던 버튼이 녹색으로 바뀝니다.Droplet Generator 도어를 열고, 카트리지 1이 들어 있는 흰색 카트리지 홀더를 꺼내어 옆으로 둡니다. 카트리지 2를 Droplet Generator에 장착합니다. 카트리지 1에서 가스켓을 제거하여 폐기합니다.새로 생성된 액적(droplet)이 파괴될 수 있으므로 흰색 카트리지 홀더를 클릭 해제하지 마십시오. 40 µL로 설정된 멀티채널 피펫을 사용하여, droplets라고 표시된 카트리지의 세 번째 열에 팁을 45도 각도로 삽입한 다음 모든 액적을 천천히 흡입하십시오. 피펫 팁을 PCR 플레이트 웰 벽의 중간 지점쯤에 대고 액적을 천천히 분사하여 최종 PCR 플레이트로 옮기십시오.마찬가지로, 두 번째 카트리지의 액적 생성이 완료되면 두 번째 카트리지에서 가스켓을 제거하고 생성된 액적을 최종 PCR 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 상단에 뚫을 수 있는 호일 커버를 덮고 플레이트 실러 위에 올립니다. 실러를 180 °C로 설정하고, 실러의 재생 버튼을 눌러 10초 동안 밀봉합니다.이 절차를 시작하려면 밀봉된 최종 PCR 플레이트를 서모사이클러에 넣으십시오. 최종 PCR 플레이트와 호환되며 초당 2°C의 온도 램핑 속도를 가진 서모사이클러를 사용하십시오. 95°C에서 10분 동안 수행한 후, 94°C에서 30초와 60°C에서 60초를 40회 반복하고, 마지막으로 98°C에서 10분 동안 유지하는 다음의 열 프로그램을 실행하십시오.사이클링이 완료되면, 플레이트를 드롭렛 리더(Droplet Reader)로 옮겨 각 웰 내의 각 드롭렛에 있는 형광을 자동으로 측정합니다. 드롭렛 리딩을 진행하기 전에 드롭렛이 상온 상태인지 확인하십시오. 먼저 전용 소프트웨어를 실행하여 드롭렛 리딩 설정을 수행합니다.빈 96웰 플레이트의 도식도가 포함된 기본 설정 메뉴에서 A1 웰을 더블 클릭하여 Sample, Assay 1 및 Assay 2의 세 가지 섹션이 포함된 메뉴를 엽니다. Sample 섹션의 Name이라고 표시된 상자에 Sample ID를 입력하고 오른쪽에 있는 Apply 확인란을 선택합니다. 다음으로, experiment라고 표시된 드롭다운 메뉴를 클릭하여 Rare Event Detection을 의미하는 RED를 선택하고 Enter를 클릭합니다.Assay 1로 표시된 섹션으로 이동합니다. Name 섹션의 Assay 항목을 작성하고 Enter를 클릭합니다. 아래의 Type이라고 표시된 상자에서 드롭다운 메뉴를 클릭하고, Channel 1 Unknown을 선택한 다음 Enter를 클릭합니다.Assay 2로 표시된 섹션으로 이동하십시오. Name 섹션의 Assay 란을 작성하고 Enter를 누르십시오. 아래의 Type이라고 표시된 상자에서 드롭다운 메뉴를 클릭하고 Channel 2 Unknown을 선택한 후 Enter를 누르십시오.이전 단계의 모든 정보가 이제 A1 웰에 포함되었습니다. 액적이 들어 있는 이후의 모든 웰의 이름을 지정하십시오. 전체 설정 시간을 단축하려면 Shift 또는 Ctrl 키를 클릭하여 여러 웰을 동시에 선택하십시오. 플레이트의 디지털 묘사가 실제 플레이트와 일치하면 메뉴 오른쪽 하단의 OK를 누르십시오.플레이트 도식 상단에 나타나는 새 메뉴의 템플릿(Template) 항목에서 다른 이름으로 저장(Save As)을 선택하고, 플레이트의 이름을 지정하여 저장합니다. 화면 왼쪽의 실행(Run)을 클릭하고 팝업으로 뜨는 실행 옵션(Run Options) 창에서 적절한 염료 세트(Dye Set)를 선택합니다. 데이터 수집이 시작되며 소프트웨어에 실시간으로 표시됩니다.리더의 작동이 완료되어 Run Complete라는 상자가 나타나면 OK를 클릭합니다. 양성 및 음성 드롭렛 간의 분리 상태를 확인합니다. NTC 웰의 모든 드롭렛 내 형광 값이 기저선(baseline) 근처에 있는지 확인합니다. Events라고 표시된 버튼을 클릭합니다.하단에서 Single이라고 표시된 상자를 클릭하고, 표시된 히스토그램의 오른쪽에 있는 Total 상자를 클릭하여 웰당 수용된 총 액적 수를 표시합니다. Ctrl 키를 누른 상태에서 제외할 웰을 클릭하여 액적이 10,000개 미만인 웰을 모두 제외합니다. 1D Amplitude라고 표시된 버튼을 클릭하여 두 타겟 모두에 대해 NTC 웰 내 음성 액적의 약 1 표준편차 지점에 형광 임계값을 설정합니다.두 개의 임계값 버튼이 표시되는 화면 맨 왼쪽 하단의 Auto Analyze에서, 분홍색 가로 실선이 그어져 있는 오른쪽 아이콘을 선택하십시오. 각 Amplitude Graph 아래의 Set Threshold 왼쪽에 있는 상자를 클릭하고 적절한 형광 임계값 수치를 입력하십시오. 그러면 마이크로리터 반응당 복제수로 표시되는 표적 농도가 자동으로 계산됩니다.1D 진폭 화면의 왼쪽 상단에 있는 내보내기 버튼을 클릭하여 결과를 CSV 파일로 내보냅니다. CSV 파일에서, 내보낸 표적 농도에 4를 곱하여 마이크로리터(µL) 반응당 표적 복제 수에서 마이크로리터(µL) DNA 템플릿당 표적 복제 수로 변환합니다. 이 그림은 디지털 PCR 분석의 듀플렉스(duplex) 및 심플렉스(simplex) 형식을 비교한 것입니다.왼쪽과 오른쪽 패널은 각각 Enterococcus와 HF183 정량 분석 결과와 더불어 듀플렉스(duplex) 및 심플렉스(simplex) 결과 간의 상관계수를 보여줍니다. 실선은 회귀선을 나타내며, 회색 음영은 그에 해당하는 표준 오차를 나타냅니다. 서로 다른 유형의 샘플은 기호로 표시되어 있습니다.Enterococcus와 HF183을 하나의 반응에서 동시에 측정하거나 두 개의 반응에서 각각 측정하더라도 결과는 매우 일관적이며 종종 구분이 불가능할 정도입니다. Digital PCR Assay는 qPCR 방식보다 한두 배 더 높은 농도의 억제제 농도에서도 견딜 수 있습니다. 이 그림은 PCR을 억제하는 휴믹산(humic acid)의 농도를 높여 첨가한 깨끗한 하수 DNA 내 HF183 마커의 qPCR 및 Digital PCR 정량 결과를 보여줍니다.억제제가 없을 때의 예상 HF183 정량 값은 두 수평 점선 사이의 95% 신뢰 구간으로 정의됩니다. 삼각형으로 표시된 Digital PCR은 반응당 휴믹산 농도가 15 nanograms per microliter까지 정확한 정량을 계속해서 제공하는 반면, 십자로 표시된 qPCR은 1 nanogram per microliter에서 과소평가하기 시작하며 5 nanograms per microliter에서는 완전히 억제됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 이 HF183 Duplex Droplet Digital PCR 분석 또는 다른 프라이머와 프로브를 사용한 유사한 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.2015년 Water Research에 발표된 이 듀플렉스 분석법(Duplex Assay) 개발 이후, 저희는 일반적인 분변 지표 박테리아, 미생물 추적 마커 및 수인성 병원체를 대상으로 하는 다양한 디지털 PCR 분석법을 개발하고 검증해 왔습니다. 이러한 분석법들은 표적 물질에 대한 직접적이고 편향되지 않은 정량을 제공하며, 수질 검사 분야에서 qPCR 분석법을 대체할 유용한 대안이 되고 있습니다.

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우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘​​플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 "을 믹스 앤 읽기"를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 "RFD-EC1"표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를...

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Waterborne를 검색하는 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 및 열 분해 단계를 사용 수정일 EPA 방법 1,623<em&gt; Cryptosporidium</em&gt;과<em&gt; Giardia SPP.</em

이 비디오에서는 두 개의 서로 다른 유전자 마커를 동시에 검출하는 데 유용한 기존 PCR 기술을 변형한 ddPCR(duplex digital PCR) 기술을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적으로 증폭되는 나노리터 크기의 유화 액적으로 분할되며, 액적 분획에서 서로 다른 색상의 형광 증폭 신호를 검출하는 것은 표적 염기서열의 초기 농도를 계산하는 데 사용됩니다.

이중 유전자 마커의 동시 정량을 위한 Duplex Digital PCR

H7는 고유 한 유전자 마커, Z3276을 대상으로 :의 qPCR 분석은 대장균 O157 검출을 위해 개발되었다. qPCR에는 라이브 셀 검출을위한 프로피 디움 모노 아자 이드 (PMA) 처리와 결합했다. 이 프로토콜은 다수의 샘플을 간단하고 일관성있는 처리를위한 96 - 웰 플레이트 형식으로 수정하고 적용되었습니다...

라이브의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

많은 양의 농업용수에서 식품 매개 병원체의 통합 농도, 농축 및 종말점 비색 검출과 관련된 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.  물은 선택적 또는 비선택성 매체로 농축된 MMS(Modified Moore Swabs)를 통해 여과되며, 검출은 박테리아 표시 비색 기판이 내장된 종이 기반 분석 장치(μPAD)를 사용하여 수행됩니다.

색도계 탐지의 종이 기반의<em&gt; 대장균</em&gt;<em&gt; 살모넬라</em&gt; SPP., 그리고<em&gt; 리스테리아</em&gt; 농업 다량의 물에서

여기에서는 역전사-정량적 PCR을 사용하여 환경 및 음용수에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 정량화하는 절차를 제시합니다. EPA Method 1615의 표준화된 절차를 통해 지하수에서 바이러스가 회수되는 평균 비율은 소아마비 바이러스의 경우 20%, 쥐 노로바이러스의 경우 30%였다.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

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E. 콜라이 O157:H7의 Foodborne 병원 체 검사를 사용 하 여 자기 형광 Nanosensor: 신속한 감지

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이 프로토콜은 미세유체 칩을 기반으로 연속 유동 중합효소 사슬 시스템을 구축하는 방법과 실험실에서 모세관 전기영동 시스템을 구축하는 방법을 설명합니다. 실험실에서 핵산 분석을 위한 간단한 방법을 제시합니다.

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학습하세요 이중 디지털 PCR 분석을 통해 수집에서 Enterococcus spp.와 HF183 마커를 동시 정량하는 방법을 배우세요. 이 기술은 표준 곡선 없이 정확한 수질 모니터링을 제공합니다.

동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석

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