동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석

본 Duplex Digital PCR 분석의 전반적인 목표는 수중의 일반 분변 오염과 인간 유래 분변 오염을 동시에 정량화하는 것입니다. 이 분석은 레크리에이션 용수 수질 모니터링에서 일반 분변 지표균인 Enterococcus와 더욱 중요한 인간 분변 관련 HF183 마커가 수중에 얼마나 존재하는지와 같은 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 분석법의 주요 장점은 한 번의 반응으로 두 가지 표적을 정량할 수 있다는 점이며, qPCR과 비교하여 표준 곡선을 작성할 필요가 없으므로 그와 관련된 편향성과 가변성을 제거할 수 있다는 것입니다. 본 절차의 시연은 수석 연구 기술자인 Meredith Raith가 진행하겠습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 먼저 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 모든 프라이머는 Molecular Grade Water에, 프로브는 TEPH 8 Buffer에 사용하여 100 $\mu\text{M}$의 스톡 농도로 준비하십시오.

다음으로, 적절한 양의 Digital PCR mix, 정방향 및 역방향 프라이머, 형광 프로브, 그리고 Nuclease-Free Water를 혼합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 용액에 기포가 생기지 않도록 주의하며 피펫팅을 최소 10회 이상 반복하여 혼합합니다. dPCR 마스터 믹스는 일반적인 qPCR 마스터 믹스보다 점도가 높으므로, 균질한 용액을 만들기 위해 피펫팅 혼합 기술을 사용하는 것이 필요합니다.

이를 통해 후속 단계에서 정확한 dPCR 정량이 가능합니다. 샘플을 중복으로 실행하기 위한 액적 생성용 분석 혼합물(Assay Mixture)을 조제하려면, 일반 PCR 플레이트에 마스터 믹스(Master Mix) 36 µL를 피펫으로 분주합니다. 각 36 µL의 마스터 믹스에 DNA 템플릿 12 µL를 혼합하며, 플레이트 상의 해당 반복 실험 웰은 비워 둡니다.

분석이 적절하게 수행되고 있는지 확인하기 위해 양성 대조군을 포함하십시오. 플레이트 내에 오염이 없는지 확인하고 이후 데이터 분석을 위한 형광 베이스라인을 설정하기 위해 템플릿 제외 대조군(NTC)을 포함하십시오. 드롭렛 생성기를 설정하기 전에 멀티채널 피펫을 사용하여 분석 혼합물을 약 15회 정도 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.

혼합물 내에 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 피펫 팁이 액체 속에 머물도록 하십시오. 다음으로, 8개의 웰이 포함된 카트리지 1을 흰색 카트리지 홀더에 삽입하고 홀더를 딸깍 소리가 나도록 닫으십시오. 이제 카트리지 1이 단단히 고정되어 액적 생성 중에 홀더에서 이탈되지 않습니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 공기 방울이 생기지 않도록 Assay Mixture 20 µL를 카트리지의 sample 표시가 된 중앙 위치로 조심스럽게 옮깁니다. 카트리지의 oil 표시가 된 왼쪽에 Droplet Generation oil 70 µL를 피펫팅합니다. 가스켓이 평평하게 놓이고 카트리지 가장자리를 향한 4개의 눈금에 의해 고르게 고정되었는지 확인하며 카트리지를 가스켓으로 덮습니다.

Droplet Generator의 녹색 등이 켜진 버튼을 눌러 도어를 열고 카트리지를 배치하십시오. 버튼을 다시 눌러 생성기를 닫습니다. 도어가 닫히면 녹색 버튼의 불이 꺼지며 도어를 다시 열 수 없습니다.

액적 생성이 즉시 시작되어 약 1분 동안 계속됩니다. 액적 생성 작업이 진행되는 동안 두 번째 카트리지를 두 번째 흰색 카트리지 홀더에 넣고 첫 번째 카트리지와 동일한 방식으로 준비하십시오. 액적 생성이 완료되면 희미하게 켜져 있던 버튼이 녹색으로 바뀝니다.

Droplet Generator 도어를 열고, 카트리지 1이 들어 있는 흰색 카트리지 홀더를 꺼내어 옆으로 둡니다. 카트리지 2를 Droplet Generator에 장착합니다. 카트리지 1에서 가스켓을 제거하여 폐기합니다.

새로 생성된 액적(droplet)이 파괴될 수 있으므로 흰색 카트리지 홀더를 클릭 해제하지 마십시오. 40 µL로 설정된 멀티채널 피펫을 사용하여, droplets라고 표시된 카트리지의 세 번째 열에 팁을 45도 각도로 삽입한 다음 모든 액적을 천천히 흡입하십시오. 피펫 팁을 PCR 플레이트 웰 벽의 중간 지점쯤에 대고 액적을 천천히 분사하여 최종 PCR 플레이트로 옮기십시오.

마찬가지로, 두 번째 카트리지의 액적 생성이 완료되면 두 번째 카트리지에서 가스켓을 제거하고 생성된 액적을 최종 PCR 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 상단에 뚫을 수 있는 호일 커버를 덮고 플레이트 실러 위에 올립니다. 실러를 180 °C로 설정하고, 실러의 재생 버튼을 눌러 10초 동안 밀봉합니다.

이 절차를 시작하려면 밀봉된 최종 PCR 플레이트를 서모사이클러에 넣으십시오. 최종 PCR 플레이트와 호환되며 초당 2°C의 온도 램핑 속도를 가진 서모사이클러를 사용하십시오. 95°C에서 10분 동안 수행한 후, 94°C에서 30초와 60°C에서 60초를 40회 반복하고, 마지막으로 98°C에서 10분 동안 유지하는 다음의 열 프로그램을 실행하십시오.

사이클링이 완료되면, 플레이트를 드롭렛 리더(Droplet Reader)로 옮겨 각 웰 내의 각 드롭렛에 있는 형광을 자동으로 측정합니다. 드롭렛 리딩을 진행하기 전에 드롭렛이 상온 상태인지 확인하십시오. 먼저 전용 소프트웨어를 실행하여 드롭렛 리딩 설정을 수행합니다.

빈 96웰 플레이트의 도식도가 포함된 기본 설정 메뉴에서 A1 웰을 더블 클릭하여 Sample, Assay 1 및 Assay 2의 세 가지 섹션이 포함된 메뉴를 엽니다. Sample 섹션의 Name이라고 표시된 상자에 Sample ID를 입력하고 오른쪽에 있는 Apply 확인란을 선택합니다. 다음으로, experiment라고 표시된 드롭다운 메뉴를 클릭하여 Rare Event Detection을 의미하는 RED를 선택하고 Enter를 클릭합니다.

Assay 1로 표시된 섹션으로 이동합니다. Name 섹션의 Assay 항목을 작성하고 Enter를 클릭합니다. 아래의 Type이라고 표시된 상자에서 드롭다운 메뉴를 클릭하고, Channel 1 Unknown을 선택한 다음 Enter를 클릭합니다.

Assay 2로 표시된 섹션으로 이동하십시오. Name 섹션의 Assay 란을 작성하고 Enter를 누르십시오. 아래의 Type이라고 표시된 상자에서 드롭다운 메뉴를 클릭하고 Channel 2 Unknown을 선택한 후 Enter를 누르십시오.

이전 단계의 모든 정보가 이제 A1 웰에 포함되었습니다. 액적이 들어 있는 이후의 모든 웰의 이름을 지정하십시오. 전체 설정 시간을 단축하려면 Shift 또는 Ctrl 키를 클릭하여 여러 웰을 동시에 선택하십시오. 플레이트의 디지털 묘사가 실제 플레이트와 일치하면 메뉴 오른쪽 하단의 OK를 누르십시오.

플레이트 도식 상단에 나타나는 새 메뉴의 템플릿(Template) 항목에서 다른 이름으로 저장(Save As)을 선택하고, 플레이트의 이름을 지정하여 저장합니다. 화면 왼쪽의 실행(Run)을 클릭하고 팝업으로 뜨는 실행 옵션(Run Options) 창에서 적절한 염료 세트(Dye Set)를 선택합니다. 데이터 수집이 시작되며 소프트웨어에 실시간으로 표시됩니다.

리더의 작동이 완료되어 Run Complete라는 상자가 나타나면 OK를 클릭합니다. 양성 및 음성 드롭렛 간의 분리 상태를 확인합니다. NTC 웰의 모든 드롭렛 내 형광 값이 기저선(baseline) 근처에 있는지 확인합니다. Events라고 표시된 버튼을 클릭합니다.

하단에서 Single이라고 표시된 상자를 클릭하고, 표시된 히스토그램의 오른쪽에 있는 Total 상자를 클릭하여 웰당 수용된 총 액적 수를 표시합니다. Ctrl 키를 누른 상태에서 제외할 웰을 클릭하여 액적이 10,000개 미만인 웰을 모두 제외합니다. 1D Amplitude라고 표시된 버튼을 클릭하여 두 타겟 모두에 대해 NTC 웰 내 음성 액적의 약 1 표준편차 지점에 형광 임계값을 설정합니다.

두 개의 임계값 버튼이 표시되는 화면 맨 왼쪽 하단의 Auto Analyze에서, 분홍색 가로 실선이 그어져 있는 오른쪽 아이콘을 선택하십시오. 각 Amplitude Graph 아래의 Set Threshold 왼쪽에 있는 상자를 클릭하고 적절한 형광 임계값 수치를 입력하십시오. 그러면 마이크로리터 반응당 복제수로 표시되는 표적 농도가 자동으로 계산됩니다.

1D 진폭 화면의 왼쪽 상단에 있는 내보내기 버튼을 클릭하여 결과를 CSV 파일로 내보냅니다. CSV 파일에서, 내보낸 표적 농도에 4를 곱하여 마이크로리터(µL) 반응당 표적 복제 수에서 마이크로리터(µL) DNA 템플릿당 표적 복제 수로 변환합니다. 이 그림은 디지털 PCR 분석의 듀플렉스(duplex) 및 심플렉스(simplex) 형식을 비교한 것입니다.

왼쪽과 오른쪽 패널은 각각 Enterococcus와 HF183 정량 분석 결과와 더불어 듀플렉스(duplex) 및 심플렉스(simplex) 결과 간의 상관계수를 보여줍니다. 실선은 회귀선을 나타내며, 회색 음영은 그에 해당하는 표준 오차를 나타냅니다. 서로 다른 유형의 샘플은 기호로 표시되어 있습니다.

Enterococcus와 HF183을 하나의 반응에서 동시에 측정하거나 두 개의 반응에서 각각 측정하더라도 결과는 매우 일관적이며 종종 구분이 불가능할 정도입니다. Digital PCR Assay는 qPCR 방식보다 한두 배 더 높은 농도의 억제제 농도에서도 견딜 수 있습니다. 이 그림은 PCR을 억제하는 휴믹산(humic acid)의 농도를 높여 첨가한 깨끗한 하수 DNA 내 HF183 마커의 qPCR 및 Digital PCR 정량 결과를 보여줍니다.

억제제가 없을 때의 예상 HF183 정량 값은 두 수평 점선 사이의 95% 신뢰 구간으로 정의됩니다. 삼각형으로 표시된 Digital PCR은 반응당 휴믹산 농도가 15 nanograms per microliter까지 정확한 정량을 계속해서 제공하는 반면, 십자로 표시된 qPCR은 1 nanogram per microliter에서 과소평가하기 시작하며 5 nanograms per microliter에서는 완전히 억제됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 이 HF183 Duplex Droplet Digital PCR 분석 또는 다른 프라이머와 프로브를 사용한 유사한 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

2015년 Water Research에 발표된 이 듀플렉스 분석법(Duplex Assay) 개발 이후, 저희는 일반적인 분변 지표 박테리아, 미생물 추적 마커 및 수인성 병원체를 대상으로 하는 다양한 디지털 PCR 분석법을 개발하고 검증해 왔습니다. 이러한 분석법들은 표적 물질에 대한 직접적이고 편향되지 않은 정량을 제공하며, 수질 검사 분야에서 qPCR 분석법을 대체할 유용한 대안이 되고 있습니다.