동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석 엔테로 종.과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커

이 듀플렉스 디지털 PCR 분석의 전반적인 목표는 용수 내 일반 및 인간 관련 배설물 오염을 동시에 정량화하는 것입니다. 이 분석은 일반적인 배설물 지표, 즉 엔테로코커스 및 더 중요하게는 인간 배설물 관련 HF183 마커가 물에 얼마나 많은지와 같은 레크리에이션 수질 모니터링의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 분석의 주요 장점은 하나의 반응에서 두 개의 표적을 정량화하고 qPCR과 비교하여 표준 곡선을 실행할 필요가 없어 관련 편향 및 변동성이 없다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 선임 연구 기술자인 Meredith Raith가 맡습니다. 이 절차를 시작하려면 먼저 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 Molecular Grade Water의 모든 프라이머와 TEPH 8 Buffer의 프로브에 대해 리터당 100마이크로몰 스톡 농도를 준비합니다.

다음으로, 적절한 양의 디지털 PCR 믹스, 정방향 및 역방향 프라이머, 형광 프로브 및 뉴클레아제가 없는 물을 혼합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫을 위아래로 최소 10회 이상 반복하여 혼합하면서 용액에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. dPCR 마스터 믹스는 기존 qPCR 마스터 믹스보다 점성이 높기 때문에 균일한 용액을 만들기 위해서는 피펫팅 기법을 통한 혼합을 사용해야 합니다.

이를 통해 다운스트림에서 정확한 dPCR 정량화가 가능합니다. 샘플을 중복으로 실행하기 위한 액적 생성을 위한 분석 혼합물을 만들려면 마스터 믹스 36마이크로리터를 일반 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 36마이크로리터 마스터 믹스 각각에 12마이크로리터의 DNA 템플릿을 혼합하여 해당 복제 웰을 플레이트에 비워 둡니다.

분석이 제대로 실행되고 있는지 확인하기 위해 positive control을 포함하십시오. 템플릿 제어 또는 NTC를 포함하지 않아 플레이트 내에 오염이 없는지 확인하고 나중에 데이터 분석을 위해 형광 기준선을 설정할 수 있습니다. 액적 생성기를 설정하기 전에 멀티채널 피펫을 사용하여 혼합물을 약 15회 위아래로 피펫팅하여 분석 혼합물을 혼합합니다.

혼합물 내에 기포가 생기지 않도록 피펫 팁이 액체 내에 남아 있는지 확인하십시오. 그런 다음 8개의 웰이 들어 있는 카트리지 1을 흰색 카트리지 홀더에 삽입하고 카트리지 홀더를 딸깍 소리를 내며 닫습니다. 카트리지 1은 이제 제자리에 단단히 고정되었으며 비말을 생성하는 동안 홀더에서 분리할 수 없습니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 기포 없이 20마이크로리터의 분석 혼합물을 카트리지로 표시된 샘플의 중간 위치로 부드럽게 옮깁니다. 70마이크로리터의 액적 생성 오일을 카트리지에 넣은 피펫을 오일로 표시된 카트리지의 왼쪽에 놓습니다. 개스킷으로 카트리지를 덮고 개스킷이 평평하고 카트리지 가장자리를 향해 4개의 눈금으로 고르게 고정되도록 합니다.

액적 생성기의 녹색 조명 버튼을 눌러 도어를 열고 카트리지를 넣습니다. 버튼을 다시 눌러 발전기를 닫습니다. 문이 닫히면 녹색 버튼이 흐려지고 문을 다시 열 수 없습니다.

액적 생성은 즉시 시작되어 약 1분 동안 계속됩니다. 액적 생성이 진행되는 동안 카트리지 2를 두 번째 흰색 카트리지 홀더에 넣고 카트리지 1과 동일한 방식으로 준비합니다. Droplet Generation이 완료되면 희미하게 켜진 버튼이 녹색으로 바뀝니다.

액적 생성기 도어를 열고 카트리지 1이 들어 있는 흰색 카트리지 홀더를 제거한 다음 따로 보관합니다. 카트리지 2를 액적 발생기에 넣습니다. 카트리지 1에서 개스킷을 제거하고 폐기합니다.

흰색 카트리지 홀더를 클릭 해제하면 새로 생성된 물방울이 깨질 수 있으므로 클릭을 취소하지 마십시오. 40마이크로리터로 설정된 멀티채널 피펫을 사용하여 팁을 45도 각도로 표시된 카트리지의 세 번째 열에 삽입하고 모든 물방울을 천천히 피펫으로 밀어 올립니다. 피펫 팁을 웰 벽의 대략 절반 아래에 대고 방울을 천천히 배출하여 최종 PCR 플레이트로 옮깁니다.

같은 방식으로, 카트리지 2에 대한 액적 생성이 완료되면 카트리지 2에서 개스킷을 제거하고 생성된 액적을 최종 PCR 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 위에 피어싱 가능한 호일 덮개를 놓고 플레이트 실러에 놓습니다. 씰러를 섭씨 180도로 설정하고 씰러의 재생을 누른 다음 10초 동안 씰링합니다.

이 절차를 시작하려면 밀봉된 최종 PCR 플레이트를 Thermocycler에 넣습니다. 최종 PCR 플레이트와 호환되고 초당 섭씨 2도의 온도 램핑 속도를 가진 thermocycler를 사용하십시오. 다음 열 프로그램을 95도에서 10분간 실행한 다음 94도에서 30초, 60도에서 60초씩 40회 사이클을 실행한 다음 98도에서 10분 동안 유지합니다.

사이클링이 완료되면 플레이트를 Droplet Reader로 옮겨 각 웰의 각 액적에서 형광등을 자동으로 측정합니다. 액적 판독을 진행하기 전에 액적이 실온에 있는지 확인하십시오. 함께 제공되는 소프트웨어를 열어 Droplet Reading을 설정하는 것으로 시작하십시오.

빈 96웰 플레이트의 회로도가 포함된 기본 설정 메뉴에서 웰 A1을 두 번 클릭하여 Sample, Assay 1 및 Assay 2의 세 섹션이 포함된 메뉴를 엽니다. Sample(샘플) 섹션에서 Name(이름)이라고 표시된 상자에 Sample ID(샘플 ID)를 입력하고 오른쪽에 Apply(적용)라고 표시된 상자를 선택합니다. 그런 다음 experiment라고 표시된 드롭다운 메뉴를 클릭하고 Rare Event Detection(희귀 이벤트 감지)에 대해 RED를 선택한 다음 Enter를 클릭합니다.

Assay 1로 표시된 섹션으로 이동합니다. Name 섹션에서 Assay를 작성하고 Enter를 클릭합니다. 아래 Type(유형)이라고 표시된 상자에서 드롭다운 메뉴를 클릭하고 Channel 1 Unknown(채널 1 알 수 없음)을 선택한 다음 Enter를 클릭합니다.

Assay 2로 표시된 섹션으로 이동합니다. Name 섹션에서 Assay를 작성하고 Enter를 클릭합니다. 아래 유형 상자에서 드롭다운 메뉴를 클릭하고 채널 2 알 수 없음을 선택한 다음 Enter를 클릭합니다.

이전 단계의 모든 정보는 이제 액적을 포함하는 모든 후속 웰 A1.Name 웰에 존재합니다. 총 설정 시간을 절약하려면 shift 또는 control을 클릭하여 여러 well을 동시에 선택할 수 있습니다. 플레이트의 디지털 묘사가 실제 플레이트를 미러링하면 메뉴 오른쪽 하단의 OK를 누릅니다.

플레이트 회로도 상단에 나타나는 새 메뉴의 Template(템플릿)에서 Save As(다른 이름으로 저장)를 선택하고 플레이트의 이름을 지정하고 저장합니다. 화면 왼쪽에서 실행을 클릭하고 팝업 실행 옵션 창에서 적절한 염료 세트를 선택합니다. 데이터 수집이 시작되고 소프트웨어에 실시간으로 표시됩니다.

읽기가 완료되고 Run Complete(실행 완료)라는 상자가 나타나면 OK(확인)를 클릭합니다. 양극 방울과 음극 방울 사이의 분리를 확인하십시오. NTC 웰의 모든 액적에 있는 형광등이 기준선에 가까운지 확인합니다. Events(이벤트)라고 표시된 버튼을 클릭합니다.

하단에서 Single(싱글)이라는 상자를 클릭하고 표시된 히스토그램의 오른쪽에 있는 Total(총계)이라는 상자를 클릭하여 웰당 허용되는 총 액적 수를 표시합니다. 10 미만, 000 작은 물방울을 포함하는 모든 우물을 통제 키를 누른 상태에서 제외될 우물을 클릭하여 제외하십시오. 1D Amplitude라고 표시된 버튼을 클릭하여 두 표적에 대한 NTC 웰에 있는 음의 방울의 약 1 표준 편차로 형광 임계값을 설정합니다.

두 개의 임계값 단추를 표시하는 자동 분석 아래의 화면 맨 왼쪽에서 단색 분홍색 가로선이 가로지르는 오른쪽의 아이콘을 선택합니다. 각 진폭 그래프 아래에 있는 Set Threshold(임계값 설정) 왼쪽에 있는 상자를 클릭하고 적절한 형광 임계값을 입력합니다. 그런 다음 마이크로리터 반응당 copy의 목표 농도가 자동으로 계산됩니다.

1D Amplitude 화면의 왼쪽 상단 모서리에 있는 Export 버튼을 클릭하여 결과를 CSV 파일로 내보냅니다. CSV 파일에서 내보낸 타겟 농도에 4를 곱하여 마이크로리터 반응당 타겟 사본에서 마이크로리터 DNA 템플릿당 타겟 사본으로 변환합니다. 이 그림은 디지털 PCR 분석의 듀플렉스 및 심플렉스 형식을 비교합니다.

왼쪽 및 오른쪽 패널에는 각각 Enterococcus 및 HF183 Quantification이 듀플렉스 결과와 심플렉스 결과 간의 해당 상관 계수와 함께 표시됩니다. 실선은 회귀선을 나타내고 회색 음영은 해당 표준 오류를 나타냅니다. 다양한 유형의 샘플이 기호로 표시됩니다.

결과는 매우 일관되며 Enterococcus와 HF183이 한 번의 반응에서 동시에 측정되는지 아니면 두 개의 반응에서 별도로 측정되는지 여부에 관계없이 종종 구별할 수 없습니다. 또한 Digital PCR Assay는 qPCR 분석법보다 1-2배 높은 농도의 억제제를 견딜 수 있습니다. 이 그림은 PCR을 억제하는 부식산의 농도가 증가함에 따라 급증한 깨끗한 하수 DNA에서 HF183 마커의 qPCR 및 디지털 PCR 정량화를 보여줍니다.

억제제가 없을 때 예상되는 HF183 정량화는 두 개의 수평 점선 사이의 95% 신뢰 교차로 정의됩니다. 삼각형으로 표시된 디지털 PCR은 마이크로리터당 15나노그램 반응의 부식산 농도까지 정확한 정량화를 계속 제공하는 반면, 십자 표시로 표시된 qPCR은 마이크로리터당 1나노그램에서 과소평가되기 시작하여 마이크로리터당 5나노그램에서 완전히 억제됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다른 프라이머 및 프로브를 사용하여 이 경장 HF183 듀플렉스 액적 디지털 PCR 분석 또는 기타 유사한 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

2015년 수질 연구에 발표된 이 이중 분석법의 개발 이후, 당사는 일반적인 분변 지표 박테리아, 미생물 추적 마커 및 수인성 병원체를 표적으로 하는 수많은 다른 디지털 PCR 분석을 개발하고 검증했습니다. 이러한 분석은 표적에 대한 직접적이고 편향되지 않은 정량화를 제공하며 수질 검사 분야에서 qPCR 분석의 유용한 대안이 되고 있습니다.