기본 조직의 두 Thymidine의 Analogues의 Immunofluorescent 검색 (CldU 및 이두)

안녕하세요. Calor D-U-I-D-U 염색 프로토콜에 오신 것을 환영합니다. 오늘 영상은 세 번째 단계인 재수화, 투과화 및 항원 회복부터 시작하겠습니다. 먼저 슬라이드를 캐리어에 장착하십시오.

슬라이드 로딩이 완료되면, 자일렌 용액에 5분 동안 담가 둡니다. 이후 다시 자일렌 용액에 5분 동안 담그는 과정을 한 번 더 수행합니다.

슬라이드를 100% 용액부터 시작하여 50% 용액까지 에탄올 용액으로 옮기며 재수화를 계속하십시오. 그 후, 세포막을 투과시키기 위해 슬라이드를 1X PBS에 5분 동안 담가 재수화를 완료합니다. 슬라이드를 0.2% Triton X 용액에 5분 동안 침지하십시오. 슬라이드가 완전히 잠기도록 충분한 양의 0.01 M sodium citrate buffer가 담긴 유리 비커에 넣어 마이크로웨이브 조직 항원 회수 준비를 하십시오. 이때 용액은 슬라이드 상단보다 5 cm 더 높게 채워져야 합니다.

증발 손실을 보완하기 위해, 용액이 끓을 때까지 슬라이드를 전자레인지에 가열합니다. 최대 출력에서 약 3~10분 정도 소요됩니다. 슬라이드가 끓고 있는지 확인하십시오.

마이크로웨이브 출력을 10에서 80% 사이로 낮추고 슬라이드를 20분 동안 천천히 더 끓입니다. 끓인 후, 슬라이드가 담긴 비커를 실험대 위에 놓아 상온에 도달할 때까지 약 2시간 동안 천천히 식힙니다. 슬라이드가 상온 상태인지 확인합니다.

슬라이드를 상온에서 1.5 natural hydrochloric acid에 40분 동안 담급니다. hydrochloric acid에서 슬라이드를 꺼내 1x PBS 세척액에 5분 동안 둡니다. 그 다음 두 번째 1x PBS 세척을 수행합니다.

액체 블로킹 왁스 펜을 사용하여 1x PBS 접근 용액에서 슬라이드를 꺼냅니다. 각 조직 절편에 원을 그린 후 슬라이드를 다시 PBS에 넣습니다. 밀폐 용기 바닥에 젖은 종이 타월을 깔아 습윤 배양 챔버를 만듭니다.

1X PBS에 10% docking serum을 희석하여 블로킹 용액을 조제하십시오. 약 1 × 1.5 cm 크기의 일반적인 조직 절편의 경우, 각 절편이 용액으로 완전히 덮이도록 하는 것이 중요합니다. 50 µL의 블로킹 용액이면 충분합니다.

마우스 anti BRDU 항혈청을 5% donkey serum에 희석하여 1차 IDU 항체를 준비합니다. 희석 배율은 1:250으로 합니다. 준비된 1차 항체 용액을 각 슬라이드 섹션 위에 피펫으로 분주합니다.

슬라이드를 4°C 냉장고에 보관하십시오. 밤새 배양하는 경우, 고엄격도 세척액을 준비하십시오. TBST가 적합합니다.

슬라이드를 서로 등지게 배치합니다. 슬라이드를 약 35~40 milliliters의 TBST Solution에 넣습니다. 튜브를 37 degrees Celsius의 진탕 배양기(shaking bacterial culture incubator)에 넣습니다.

225 RPM으로 20분 동안 흔들어 줍니다. 이제 슬라이드를 캐리어에 적재하십시오. 슬라이드를 XPBS에 넣고 5분 동안 PBS 세척을 수행합니다.

이어서 XPBS로 5분 동안 2차 세척을 수행합니다. 5% donkey serum으로 rat anti BRDU를 희석하여 1차 CLDU 항체 용액을 준비합니다. 1:250 농도로 첨가한 후, 슬라이드를 페이퍼 타월 위에 놓고 왁스 펜으로 구획을 표시합니다.

피펫을 사용하여 각 조직 절편을 1차 CLDU 용액으로 덮습니다. 모든 조직 절편이 완전히 덮이도록 약 50 µL의 용액을 사용하십시오. 슬라이드를 4 °C 냉장고에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다.

슬라이드를 캐리어에 넣은 후 1×PBS 세척액에 5분 동안 담가 둡니다. 슬라이드를 두 번째 1×PBS 세척액에 옮겨 다시 5분 동안 담가 둡니다. CY2 donkey anti-RAD 및 PS5 donkey anti-mouse 항체를 5% donkey serum에 희석하여 2차 항체를 준비합니다. 핵 염색을 위해 DPI도 사용하며, 조직 절편이 2차 항체로 완전히 덮이도록 도포합니다.

조직을 완전히 덮기 위해서는 50 µL의 용액이면 충분합니다. 재수화 챔버를 실온의 어두운 곳에 두고 1시간 동안 배양하십시오. 슬라이드를 캐리어에 넣은 후, 5분 동안 1회 XPBS 세척을 수행하십시오.

슬라이드를 두 번째 1×PBS 세척액에 5분 동안 담급니다. 종이 타월을 사용하여 과량의 PBS 용액을 톡톡 쳐서 제거합니다. 그런 다음 Prolong Gold 항퇴색 마운팅 용액을 가져와 각 조직 절편 위에 소량씩 떨어뜨립니다.

커버 슬립을 집어 슬라이드 절편 위에 조심스럽게 덮습니다. 페이퍼 타월을 누름판으로 사용하여 슬라이드 절편과 커버 슬립 사이에 갇혀 있을 수 있는 과잉 기포를 밀어내어 제거합니다. 마지막으로, 피펫 팁을 사용하여 남아 있을 수 있는 과잉 기포를 밀어내어 제거합니다. 고에너지 광원과 다중 형광 채널이 장착된 형광 현미경을 사용하여 분석 대상 조직의 이미지를 획득하고 결과를 정량화합니다.

먼저 Dabi 양성 세포의 수를 측정합니다. SI 2채널 이미지를 사용하여 CLDU 양성 세포의 수를 측정합니다. SCI 5채널 이미지를 사용하여 IDU 양성 세포의 수를 측정합니다.

마지막으로, SCI two 채널 이미지 파일과 SCI five 채널 이미지 파일을 번갈아 확인하며 이중 양성 표지 세포의 수를 측정하십시오.