Name: 콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 배우세요 콜라겐 젤화 및 폴리에틸렌 튜브 절단을 이용한 모듈형 미세조직 제조 방법입니다. 내피세포 코팅을 통해 조직공학 및 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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기금은 보건 국립 연구소 (EB 001013), 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 및 건강 연구 캐나다 연구소에 의해 제공되었다. 우리는 그녀의 전문 박사 AP 맥기건 감사와 모듈의 개발에 도움이됩니다.

관 1) 준비 <ol><li> 폴리에틸렌 튜브 2 ~ 3 미터 길이 (0.76 mm ID를 X 1.22 mm OD)를 자르고. </li><li> 튜브의 한쪽 끝을로 20 G1 바늘에 실을 꿰다. </li><li> 변환기 자체 밀봉 주머니 (7 1 / 2 "X 13")에 코일 튜빙 장소. 튜빙의 두 끝을은 가방의 unsealed 끝에 위치 및 가스 살균 테이프와 장소에서 녹화한다. </li><li> 인감 가방 및 가스 소독. </li></ol> 콜라겐 2) 중화 참고 : 콜라겐 1 ML는 폴리에틸렌 튜빙의 약 2 미터 채워집니다. <ol><li> 15 ML 원뿔 관에 튜브를 원하는 길이에 필요한 콜라겐의 필요한 양을 놓고 얼음 계속. </li><li> 128 UL 추가 10X α - 멤 당 ML 튜브와 반복 솔루션을 pipetting으로 혼합하는 콜라겐니다. 참고 : (1) 솔루션은 산성의 콜라겐에 α - 멤 같은 노란색이 혼합된 것입니다 설정해야하며 (2) 혼합시 거품을 최소화하려고합니다. </li><li> 콜라겐은 7.4의 산도를 가지고 때까지 0.8 M 나트륨 중탄산염을 추가하여 콜라겐을 중화. 산도의 추가 나트륨 중탄산염에 대한 일반적인 추정을위한 노란색 콜라겐 솔루션은 밝은 핑크색 색상을 발견되기 전까진. 참고 : 일반적으로 콜라겐의 각 ML 당 30-60 μL 걸립니다. </li><li> 무력화 콜라겐으로 사용할 준비까지 겔 4 보관하면되지 않습니다 얼음에 무력화 콜라겐 계속 ° C. </li></ol> 셀 3) 삽입 (옵션) 참고 : 세포 종류에 따라 세포가 ML 당 20,000,000 세포 ML 당 백만 세포 사이의 농도에서 임베디드 수 있습니다. 당신이 포함하고자하는 세포에 필요한 매체를 사용하십시오. <ol><li> 세포에서 미디어를 제거하고 PBS로 5 ML 씻으십시오. </li><li> PBS를 제거 및 3 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다. </li><li> 37 5 분 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에있는 세포를 품어 ° C. </li><li> 7 ML 매체에 세포를 Resuspend. </li><li> 세포를 세어보세요. </li><li> 15 ML 원뿔 관을 삽입에 대한 세포의 필요한 번호를 전송합니다. </li><li> 5 분 300 XG에 펠렛은 세포. </li><li> 세포 펠렛에서 미디어를 대기음. </li><li> 무력화 콜라겐의 세포를 Resuspend 얼음 계속. </li></ol> 콜라겐 4) 겔링 <ol><li> 생물 학적 안전 캐비넷에서 폴리에틸렌 튜브가 들어있는 가방의 밀봉 끝을 잘라. </li><li> 멸균 핀셋을 사용하여 튜브의 한쪽 끝을에서 20G 바늘로 3 ML의 주사기를 연결합니다. 가방에 튜빙을 유지. </li><li> 끝이 살균 핀셋을 사용하여 원뿔 관의 하단에까지 무력화 콜라겐에 튜브의 다른 쪽 끝을 삽입합니다. 원뿔 튜브 얼음에 보관하십시오. </li><li> retracting 천천히 주사기의 플런저에 의해 폴리에틸렌 튜브에 콜라겐을 당겨. 참고 : 콜라겐이 빠르게 다음 거품이 콜라겐의 형성에 튜브에 뽑아 경우. </li><li> 튜빙을 통해 콜라겐을 당기는 후, 튜브 밖으로 20G 바늘을 끌어와 가방에 다시 양쪽을 넣어. 테이프 가방 종료. </li><li> ° C 60 분 37 가방을 품다. 콜라겐은 세포가 포함되어있는 경우 다음 각 15 분 이상의 가방을 플립. 그래서 세포는 모듈의 한쪽으로 해결하지 않습니다. </li></ol> 5) 튜브의 절단은 Gelled 콜라겐을 포함 <ol><li> 절단 장치와 튜브를 잡아 트레이에 대한 압력솥 헤더와 블레이드. </li><li> 절단 장치를 조립. </li><li> 플레이스 장치를 절단 앞에 살균 트레이에 튜브 및 절단 장치에 튜빙을로드합니다. </li><li> 컷 모듈을 수집하는 절단 장치의 콘센트에서 미디어의 25 ML을 포함한 50 ML 원뿔 튜브를 설정합니다. 참고 : 모듈이 언론에 FBS없이 튜브에서 분리하지 않는 콜라겐 전용 모듈도 FBS를 포함하는 사용 미디어. 모듈이 포함되어 있으면 세포가 포함된 세포에 필요한 미디어를 사용합니다. 있다면 모듈에 포함된 세포가 내피 세포에 대한 미디어를 사용하지 않습니다. </li><li> 튜빙의 2mm 길이를 잘라 튜브를 잘라 절단 장치를 설정합니다. </li><li> 37 모듈을 잘라 품어 ° 50 ML 원뿔 튜브 60 분 C. </li></ol> 6) 튜브에서 콜라겐 모듈 제거 <ol><li> 10 초에 대한 튜브의 모듈을 포함하는 소용돌이 50 ML 원뿔 관. 참고 : 파손을 피하기 위해 높은 세포 밀도와 임베디드 모듈을 분리 때 부드럽게한다. </li><li> 모듈 튜브의 바닥에 정착하자. 약 5 분 정도 소요됩니다. </li><li> 넓은 입 10 ML serological 피펫을 사용하면 15 ML 원뿔 관에 정착한 모듈을 전송합니다. </li><li> 단계를 6.1-6.3 두 번 반복합니다. </li><li> 아닌 조직 문화 처리 강판에 내피 세포 또는 전송 모듈과 코트 모듈 7 단계로 이동합니다. </li></ol> 내피 세포와 함께 7) 코팅 모듈을 <ol><li> 일 미디어의 5 ML과 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 모듈을 정착E는 세포를 내장. </li><li> 내피 세포에서 미디어를 제거하고 PBS로 5 ML 씻으십시오. </li><li> PBS를 제거 및 3 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다. </li><li> 37 5 분 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에있는 세포를 품어 ° C. </li><li> 7 ML 매체에 세포를 Resuspend. </li><li> 세포를 세어보세요. 원뿔 관의 하단에있는 포장 모듈 ML 당 5x10 6 내피 세포가 필요 해요. </li><li> 5 ML 내피 세포 미디어에서 5 분 및 resuspend 300 XG에 펠렛은 세포. </li><li> 모듈에 내피 세포가 들어있는 미디어의 5 ML을 추가합니다. 참고 : 이것은 우리가 두 세포 유형의 생존과 기능에 대한 작업 찾은 두 미디어 유형의 50:50 비율을 제공합니다. 사용 그것을 사용하기 전에 두 세포 유형의 phenotypes의 적절한 유지 보수를 위해 공식화 공동 문화 매체를 테스트합니다. </li><li> 모두 정적 및 동적으로 내피 세포와 모듈을 품어. </li><li> 정적 배양 믹스 역전의 내피 세포와 모듈과 37 수직 튜브를 설정할 ° 15 분 C하십시오. 반복합니다. </li><li> 부드럽게 37 튜브를 락을하여 동적으로 씨앗이 내피 세포 ° 60 분 C. </li><li> 두 정적 부화를 반복합니다. </li><li> 아닌 조직 문화가 처리 강판의 모듈을 놓고 37 밤새 품어 ° C. </li><li> 새로운 미디어와 새로운 비 조직 문화 처리 강판의 다음날 장소의 모듈 (50:50 혼합하는 경우 사용하는 공동 문화 시스템) 무소속의 내피 세포를 제거하려면 다음과 같이하십시오. </li><li> 그들은 모듈의 표면의 100 %를 커버까지 내피 세포와 입혀져 있습니다 모듈을 품어. 이것은 일반적으로 약 7 일이 소요됩니다. </li></ol> 8) 대표 검색 결과 : 그들이 처음 튜브에서 제거하는 경우 모듈은 원통 모양 것입니다. 모듈이 포함된 셀 및 /를 포함 또는 내피 세포로 코팅하는 경우 그들은 볼륨 50 %까지 계약하고 타원형 모양 (그림 1)을 개발할 수 있습니다. 모듈은 또한 가벼운 현미경 (그림 1)에서 볼 때 밀도가 더 불투명하게 될 것입니다. 또한 내피 세포가 모듈의 표면에 합류하는 경우 VE - Cadherin의 immunofluorescence 얼룩 (그림 2)에서보실 수 있습니다 꽉 분기점의 형성이 있습니다. 대량 전송 분석 모듈 (대형 직경의 예 : 모듈, D = 1.4 대규모 조직에서 흔히 문제는 불충 분한 산소 수송에 의한 괴사성 핵심을 개발하지 않고 높은 세포 밀도를 (8x10 7 세포 / cm 3) 지원 할 수있다 증명했다 mm) (그림 3). <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 모듈 제조 및 수축. 모듈 수축이 시딩 상당히 작은 모듈 직경 및 길이 (P &lt;0.001) (A)를 결과 HUVEC - C (내피 세포 라인)을 다음과 같은 세 가지 일 동안 발생했습니다. 임베디드 HepG2 세포가 균일하게 제조시 모듈 내에 배포 및 높은 생존 능력 (B)를 유지했다. [세포가 녹색 라이브, 죽은 세포 레드] [코스토핀 2010에서 적응] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 모듈의 표면에 코팅 십일 RAEC 후 EC 꽉 세포 분기점의 VE - Cadherin immunofluorescent 얼룩. 스케일 바 = 50 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 메이슨의 전형적인 모듈의 trichrome 염색법 (0.76 mm 초기 직경) 및 대형 모듈 (1.4 mm 초기 직경)는 산소 확산 제한의 효과를 보여줍니다. 제조 아래 세븐 일, 죽은 세포의 큰 숫자가 가능한 세포의 단지 얇은 테두리를 (~ 200μm 두께) 떠나, 대형 모듈 (오른쪽 아래 패널)의 핵심 내에서 형성했다. 반대로 작은 모듈은 라이브 세포의 균일한 높은 분포를 유지. [모듈 HepG2 세포와 임베디드 및 내피 세포와 코팅.] [코스토핀 2010에서 가져온] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 : poloxamine에 (A) HMEC - 1 씨앗 - 콜라겐 모듈. poloxamine - 콜라겐 모듈은 자신의 원통형 모양을 유지하고 제한된 세포 부착 속성 콜라겐에만 모듈에 비해있다 시딩의 1 일 후. 스케일 바 = 200 μm의. PLGA 기반 생분해성 microspheres를 포함하는 콜라겐 모듈의 (B) 라이트 현미경 이미지. 스케일 바 = 500 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5 : 시험 관내 assays에의 예. (A) Angiogenesis 분석 : 모세와 같은 형태 내피 세포와 씨앗 모듈에 쉽게 지방 - 유래 줄기 세포로 감지하고 배양 5 일 후에 계량하실 수 있습니다. (B)의 모듈에 대한 라이브 / 죽은 분석의 공촛점 현미경 이미지라이브 세포에 대한 taining 것은 녹색과 죽은 세포를 위해 빨간색입니다. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6 : 임베디드 mesenchymal 줄기 세포와 내피 세포의 표면 레이어를 포함하는 콜라겐 모듈. 모듈은 microfluidic 챔버에서 7 일 동안 전단 응력 (~ 0.64 dyn / cm 2) 노출 및 연락처 지점에서 융합을 표시하기 시작했다. 내피 세포 vWF (갈색)와 스테인드 및 mesenchymal 줄기 세포의 핵은 청색 (H &amp; E) 표시됩니다. 스케일 바 = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7 : 지방 - 유래 줄기 세포 (ASC)와 인간 Microvascular 내피 세포와 코팅을 포함하는 콜라겐 모듈의 수백은 (HMEC) 지방의 재생 어플 리케이션을위한 생체내에 ASC / HMEC 상호 작용을 연구하기 위해 마우스 칩을 피부 밑에 심어입니다.

<ol><li>Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+vessel+tissue+engineering+driven+by+endothelialized+modules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules.</a> , (2010).</li>
<li>Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+factor+and+diffusion+limitations+in+collagen+gel+modules+containing+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2010).</li>
<li>Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+endothelialized+modular+constructs+implanted+in+an+omental+pouch+in+nude+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats.</a> Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).</li>
<li>Leung, B. M., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tissue+engineering+construct+containing+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells.</a> Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cell-containing+gel+modules+to+assemble+modular+tissue-engineered+constructs+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected].</a> Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+organoid+engineered+by+modular+assembly+enables+blood+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+tissue+engineering%3A+fabrication+of+a+gelatin-based+construct%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct.</a> J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+sub-mm-sized+modules+containing+encapsulated+cells+for+modular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+criteria+for+a+modular+tissue-engineered+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design criteria for a modular tissue-engineered construct.</a> Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombogenicity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cell+seeded+collagen+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules.</a> Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).</li>
<li>Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen%2Fpoloxamine+hydrogels%3A+cytocompatibility+of+embedded+HepG2+cells+and+surface-attached+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells.</a> Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 서로 다른 세포 유형 1-11와 임베디드 모듈을 사용하여 여러 가지 마이크로 조직을 가공했습니다. 우리는 성공적으로 기본 cardiomyocytes, 아일 레츠, 지방 줄기 세포 및 mesenchymal stromal 세포뿐만 아니라, HepG2, NIH 3T3 및 복제 구 간 세포를 포함한 여러 세포 라인을 내장했습니다. 우리는 쥐 대동맥 내피 세포, 인간 제대 정맥 내피 세포 및 인간의 microvascular 내피 세포를 포함한 내피 세포의 여러 종류의 모듈을 코팅합니다. 모듈은 또한 콜라겐과 poloxamine 고분자 또는 약물 eluting microspheres를 (그림 4)이있는의 혼합물로 제작되었습니다. 시험 관내 assays 여러가 immunofluorescence 서양 얼룩, angiogenesis, 알라마 파란색 증식 및 라이브 / 죽은 assays (그림 5)를 포함한 모듈과 호환되도록 표시되었습니다. 그들은 또한 microfluidic 챔버 (그...

<table><tbody><tr><td>Intramedic tubing PE60</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>모듈의 직경을 변경하기 위해 서로 다른 직경의 튜빙을 사용할 수 있음</td></tr><tr><td>인산완충식염수 (PBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Purcol 산성화 콜라겐, 3 mg/mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>20G 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td>바늘의 직경은 튜빙의 직경과 유사해야 함</td></tr><tr><td>3 mL 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Convertors Self-Seal 파우치 7 1/2&amp;#8221; x 13&amp;#8221;</td><td>Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Wide Tip 혈청학적 피펫</td><td>BD Biosciences</td><td>357504</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 혈청학적 피펫</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 혈청학적 피펫</td><td>BD Biosciences</td><td>357543</td><td></td></tr></tbody></table>

콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

이 프로토콜은 모듈이라는 마이크로 조직의 유형의 제조에 대해 설명합니다. 모듈 접근 방식은 유니폼, 확장성과 vascularized 조직을 생성합니다. 모듈은 콜라겐뿐만 아니라 다른 gelable 또는 crosslinkable 재료 만들 수 있습니다. 그들은 제조시 직경 길이 약 2mm와 0.7 mm 있지만 임베디드 세포 또는 경우 모듈이 내피 세포로 코팅 아르와 크기로 축소. 개별 모듈은 임베디드 세포가 산소와 다른 영양소의 확산 제한 내에 있지만 모듈 perfusable 아르 더 큰 조직을 형성하기 위해 함께 포장 수있는 정도로 작은 수 있습니다. 그들이 복잡한 조직을 형성하기 위해 함께 모여되기 전에 다른 셀 형식에 포함된 또는 모듈에 코팅된 수 있기 때문에 이러한 조직 건설에 모듈입니다. 모듈을 만들기 위해 세 가지 주요 단계가 있습니다 : (1) 콜라겐을 중화하고 그 안에 세포를 포함, 튜브 (2) 겔화 콜라겐과 내피 세포와 모듈과 (3) 코팅 모듈을 절단.

임베디드 세포와 어떤 표면을 포함하는 모듈 불리는 원통형 콜라겐 젤을 사용하여 마이크로 조직의 생성은 내피 세포로 코팅됩니다.

본 프로토콜은 모듈(modules)이라고 불리는 일종의 미세 조직 제작 방법을 설명합니다. 모듈 접근 방식은 균일하고 확장 가능하며 혈관화된...

본 절차의 전반적인 목표는 조직 공학 실험에 사용할 수 있는 모듈형 미세 조직을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 주사기를 사용하여 폴리에틸렌 튜브 내로 콜라겐 용액을 끌어당긴 후, 콜라겐을 겔화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 폴리에틸렌 튜브를 2 mm 길이로 잘라 미세 조직 모듈을 형성하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 모듈을 튜빙에서 분리하는 것이며, 마지막으로 모듈에 혈관 내피세포를 코팅합니다. 최종적으로, 이렇게 제작된 마이크로 조직은 미세유체 챔버를 통해 세포 간의 상호작용을 연구하기 위한 인비트로(in vitro) 세포 분석에 사용할 수 있습니다. 또한, 이 마이크로 조직을 이식하여 생체 내(in vivo)에서 마이크로 조직의 상호작용 및 리모델링을 연구하기 위한 조직을 생성할 수 있습니다.안녕하세요, 저는 토론토 대학교 Sepan Lab의 Brendan Long입니다. 대형 3D 조직 대체물을 제작할 때 직면하는 주요 장애물은 이식 후 신속한 혈관 형성이 부족하다는 점입니다. 이 영상에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 내피세포로 코팅된 모듈형 조직을 만드는 방법을 보여드리겠습니다.시연은 Septin lab의 포스트닥터 펠로우인 Chamberlain이 진행하겠습니다. 중화할 콜라겐의 양은 폴리에틸렌 튜브의 길이에 따라 달라집니다. 이번 시연에서는 내경 0.76 millimeter, 외경 1.22 millimeter인 2m 길이의 폴리에틸렌 튜브를 사용하겠습니다.튜빙을 준비하려면 20 G 바늘 하나를 튜빙의 한쪽 끝에 끼운 다음, 가스 멸균을 위해 튜빙을 컨버터 자가 치유 파우치(converter self-heal pouch)에 넣습니다. 콜라겐 1 mL가 폴리에틸렌 튜빙 약 2m를 채우므로, 콜라겐 1 mL를 중화시키겠습니다. 콜라겐을 15 mL 원추형 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.콜라겐 1mL당 10 x alpha, MEM 128 µL를 튜브에 넣고 피펫팅을 반복하여 혼합합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며, alpha MEM이 산성화된 콜라겐과 섞이면서 용액이 노란색으로 변해야 합니다. 다음으로 0.8 M 중탄산나트륨을 첨가하여 콜라겐을 중화합니다. pH를 대략적으로 추정하기 위해 노란색 콜라겐 용액이 연분홍색으로 변할 때까지 중탄산나트륨을 첨가합니다.pH 7.4를 맞추기 위해서는 일반적으로 콜라겐 1 mL당 30~60 µL가 소요됩니다. 중화된 콜라겐이 겔화되는 것을 방지하려면 사용 직전까지 얼음 위에 보관하십시오. 콜라겐 겔화 절차를 시작하려면, 멸균된 폴리에틸렌 튜브가 들어 있는 백을 생물 안전 작업대로 옮긴 후 튜브는 백 안에 둔 상태에서 백의 밀봉된 끝부분을 잘라내십시오.멸균된 핀셋을 사용하여 튜브의 한쪽 끝에 미리 삽입해 둔 20 gauge 바늘에 3 mL 주사기를 연결합니다. 튜브의 반대쪽 끝을 얼음 위에 보관 중인 원추형 튜브 바닥 끝까지 닿도록 중화된 콜라겐에 삽입합니다. 다음 단계는 천천히 수행해야 하며, 그렇지 않으면 콜라겐 내에 기포가 유입될 수 있습니다.주사기 플런저를 천천히 당겨 콜라겐을 폴리에틸렌 튜브 안으로 끌어옵니다. 콜라겐이 튜브를 통해 모두 이동하면, 20 gauge 바늘을 제거하고 튜브의 양 끝을 다시 백 안에 넣습니다. 백을 테이프로 밀봉한 후, 37 °C에서 60분 동안 배양합니다.미리 조립된 절단 장치를 사용하여 튜빙을 절단합니다. 이 절차를 시작하려면, 절단 장치 앞에 있는 멸균 트레이에 튜빙을 놓고 튜빙을 절단 장치의 배출구에 장착한 뒤, 25 mL의 혈관내피세포 배지가 들어 있는 50 mL 원추형 튜브를 준비합니다. 절단된 모듈을 수집하기 위해, 절단 장치를 2 mm 길이로 절단하도록 설정한 다음 튜빙을 절단합니다.절단된 모듈을 50 mL 원추형 튜브에 넣고 37 °C에서 60분 동안 배양합니다. 튜브에서 콜라겐 모듈을 분리하기 위해, 모듈이 들어 있는 50 mL 원추형 튜브를 중간 속도로 10초 동안 볼텍싱합니다. 모듈이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 약 5분 정도 기다립니다.튜브 바닥에 모듈의 느슨한 펠렛이 형성되고, 튜빙은 배지 위에 층을 형성하게 됩니다. 모듈이 가라앉으면, 입구가 넓은 10 milliliter 세롤로지컬 피펫을 사용하여 이를 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 15 milliliter 원추형 튜브를 볼텍싱한 후, 모듈이 다시 가라앉도록 두 번 더 반복합니다.두 번째와 세 번째 와텍스에서 가라앉은 모듈들 또한 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 모든 모듈을 튜브에서 제거하여 한데 모은 후, 튜브 내 배지 부피를 5 milliliter로 맞춥니다. 이제 모듈에 혈관내피세포를 코팅할 준비가 되었으며, 다음 단계에서 모듈 코팅을 위한 혈관내피세포 준비 과정이 제시될 것입니다.먼저, 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. PBS를 제거한 후, 3 mL의 trypsin EDTA를 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 7 mL의 배지에 현탁하여 15 mL 튜브로 옮깁니다.헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하십시오. 원추형 튜브 바닥의 packed modules 1 mL당 5 × 10⁶개의 혈관내피세포가 필요합니다. 300 G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하십시오. 세포 펠렛을 5 mL의 혈관내피세포 배지에 다시 현탁하십시오.이제 혈관 내피세포가 포함된 배지 5 mL를 모듈에 추가합니다. 모듈을 혈관 내피세포와 함께 정적 및 동적으로 배양하는데, 정적 배양의 경우 혈관 내피세포가 포함된 모듈을 반전시켜 혼합한 다음, 튜브를 똑바로 세워 37 °C에서 15분 동안 둡니다. 15분 후, 튜브를 다시 반전시켜 37 °C에서 추가로 15분 동안 배양합니다.내피세포와 함께 모듈을 동적으로 배양하려면, 15 mL 튜브를 37 °C에서 60분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 내피세포와의 배양이 완료되면, 모듈을 조직 배양 처리가 되지 않은 플레이트로 옮겨 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 부착되지 않은 내피세포를 제거하기 위해 모듈을 신선한 배지가 담긴 새로운 조직 배양 처리되지 않은 플레이트로 옮깁니다. 내피세포가 코팅된 모듈을 세포가 모듈 표면의 100%를 덮을 때까지 37 °C에서 배양합니다.이 과정은 보통 약 7일이 소요됩니다. 튜브에서 처음 꺼냈을 때 모듈은 원통형 모양을 띱니다. 내피세포가 코팅된 경우, 부피가 최대 50%까지 수축하여 타원형이 될 수 있으며, 광학 현미경으로 관찰했을 때 더 조밀하고 불투명해질 수 있습니다.이 이미지들에서 모듈의 직경과 길이는 각각 d와 l로 표시되어 있습니다. 다음 이미지는 제작 당시 모듈 내에 균일하게 분포된 삽입된 Hep G2 세포를 보여줍니다. 생존 세포의 녹색으로 표시된 바와 같이 세포들은 높은 생존율을 유지했습니다.내피세포가 합쳐져 단층을 형성했을 때 죽은 세포는 붉은색으로 나타납니다. 모듈 표면에는 면역형광법으로 확인할 수 있는 밀착 연접이 형성됩니다. VE cadherin 염색 및 물질 전달 분석 결과, 모듈이 높은 세포 밀도를 유지하면서도 대형 조직에서 흔히 발생하는 문제인 산소 전달 부족으로 인한 괴사 중심부 형성 없이 세포를 지원할 수 있음이 입증되었습니다.본 사례에서, 전형적인 소형 모듈의 massen Tri chro 염색 결과, 제작 7일 후에도 모듈 내에 살아있는 세포가 균일하고 높게 분포되어 있음을 보여줍니다. 이와 대조적으로, 대형 모듈의 중심부에는 다수의 사멸 세포가 형성되었으며, 가장자리에만 얇은 생존 세포 층이 남아 있었습니다. 또한, 콜라겐과 미세 폴리머의 혼합물로 구성되거나 약물 방출 미세구를 포함하는 모듈도 제작되었습니다.여기에서 h h EC 세포가 palin 콜라겐 모듈 위에 배양되었을 때, 모듈은 원통형 모양을 유지하며 콜라겐 단독 모듈에 비해 세포 부착 특성이 제한적입니다. PLGA 기반 생분해성 미세구체를 포함하는 콜라겐 모듈의 광학 현미경 이미지가 여기에 표시되어 있습니다. 여러 가지 in vitro 분석법이 모듈과 호환되는 것으로 나타났습니다.예를 들어, 혈관 형성 분석(angiogenesis assay)에서 내피 세포가 안착된 모듈의 모세혈관 유사 구조는 지방 유래 줄기 세포와 함께 5일간 배양한 후 쉽게 검출하고 정량화할 수 있습니다. 또 다른 예로, 모듈 내 생사 분석(live dead assay)의 공초점 현미경 이미지는 살아 있는 세포는 녹색으로, 죽은 세포는 빨간색으로 염색된 모습을 보여줍니다. 마지막으로, 모듈은 미세 유체 챔버에 사용되거나 마우스 및 랫트에 이식되어 서로 다른 세포 유형 간의 상호작용과 숙주 반응에 의해 미세 조직이 어떻게 재구성되는지를 연구하는 데에도 활용되었습니다.해당 절차에 따라 모듈을 페트리 접시나 바이오리액터 또는 미세유체 장치와 같은 다른 용기에서 배양할 수 있습니다. 이 방법은 세포 유형의 다양한 조합을 사용하거나 서로 다른 직경의 튜브를 사용하여 다양한 조직을 생성하도록 조정할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

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조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산

배우세요 콜라겐 젤화 및 폴리에틸렌 튜브 절단을 이용한 모듈형 미세조직 제조 방법입니다. 내피세포 코팅을 통해 조직공학 및 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤

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