콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤

본 절차의 전반적인 목표는 조직 공학 실험에 사용할 수 있는 모듈형 미세 조직을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 시린지를 사용하여 폴리에틸렌 튜브 안으로 콜라겐 용액을 끌어당긴 후, 콜라겐을 겔화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 폴리에틸렌 튜브를 2mm 길이로 잘라 미세 조직 모듈을 형성하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 모듈을 튜빙에서 분리하는 것이며, 마지막으로 모듈에 혈관 내피세포를 코팅합니다. 최종적으로, 이렇게 만들어진 마이크로 조직은 미세유체 챔버를 통해 세포 간의 상호작용을 연구하기 위한 in vitro 세포 분석에 사용할 수 있습니다. 또한, 마이크로 조직을 이식하여 in vivo에서 마이크로 조직의 상호작용 및 리모델링을 연구하기 위한 조직을 생성할 수 있습니다.

안녕하세요, 토론토 대학교 Sepan Lab의 Brendan Long입니다. 대형 3D 조직 대체물을 제작하는 데 있어 주요 장애물 중 하나는 이식 후 신속한 혈관 형성이 부족하다는 점입니다. 본 영상에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 내피 세포로 코팅된 모듈형 조직을 만드는 방법을 보여드리겠습니다.

실험 절차 시연은 Septin 연구실의 포스트닥터 펠로우인 Chamberlain이 진행합니다. 중화할 콜라겐의 양은 폴리에틸렌 튜브의 길이에 따라 달라집니다. 본 시연에서는 내경 0.76 millimeter, 외경 1.22 millimeter의 2미터 폴리에틸렌 튜브를 사용하겠습니다.

튜빙을 준비하려면, 20 G 바늘 하나를 튜빙의 한쪽 끝에 끼운 다음, 가스 멸균을 위해 튜빙을 컨버터 셀프힐 파우치에 넣으십시오. 콜라겐 1 mL가 폴리에틸렌 튜빙 약 2 m를 채우므로, 콜라겐 1 mL를 중화하겠습니다. 콜라겐을 15 mL 원심분리 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

콜라겐 1mL당 10 x alpha MEM 128µL를 튜브에 넣고 피펫팅을 반복하여 혼합합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며, alpha MEM이 산성화된 콜라겐과 섞이면서 용액이 노란색으로 변해야 합니다. 다음으로, 0.8M 탄산수소나트륨을 첨가하여 콜라겐을 중화합니다. pH를 대략적으로 확인하려면 노란색 콜라겐 용액이 연분홍색으로 변할 때까지 탄산수소나트륨을 첨가하십시오.

pH 7.4를 달성하려면 일반적으로 콜라겐 1mL당 30~60µL가 소요됩니다. 중화된 콜라겐의 겔화를 방지하기 위해 사용 직전까지 얼음 위에 보관하십시오. 콜라겐 겔화 절차를 시작하려면, 멸균된 폴리에틸렌 튜브가 들어 있는 백을 생물안전작업대(BSC)로 옮기고 튜브를 백 안에 둔 상태에서 백의 밀봉된 끝부분을 잘라내십시오.

멸균된 핀셋을 사용하여 튜브의 한쪽 끝에 미리 삽입해 둔 20 gauge 바늘에 3 mL 시린지를 연결합니다. 튜브의 반대쪽 끝을 중화된 콜라젠에 삽입하여 팁이 얼음 위에 놓인 원뿔형 튜브 바닥에 닿게 합니다. 다음 단계는 천천히 수행해야 하며, 그렇지 않으면 콜라젠 내부에 기포가 유입될 수 있습니다.

주사기 플런저를 천천히 당겨 콜라겐을 폴리에틸렌 튜브 안으로 끌어옵니다. 콜라겐이 튜브를 통해 모두 이동하면 20 gauge 바늘을 뽑고 튜브의 양 끝을 다시 백 안에 넣습니다. 백을 테이프로 밀봉한 후, 37 °C에서 60분 동안 배양합니다.

튜브를 절단하기 위해 미리 조립된 절단 장치를 사용합니다. 이 절차를 시작하려면, 절단 장치 앞의 멸균 트레이에 튜브를 놓고 절단 장치의 배출구에 튜브를 장착한 뒤, 25 mL의 혈관 내피 세포 배지가 담긴 50 mL 코니컬 튜브를 준비합니다. 절단된 모듈을 수집하기 위해, 절단 장치를 2 mm 길이로 절단하도록 설정한 다음 튜브를 절단합니다.

절단된 모듈을 50 mL 원심분리 튜브에 넣고 37 °C에서 60분 동안 배양합니다. 튜브에서 콜라겐 모듈을 분리하기 위해, 모듈이 들어 있는 50 mL 원심분리 튜브를 중간 속도로 10초 동안 볼텍싱합니다. 모듈이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 약 5분 정도 기다립니다.

튜브 바닥에 모듈의 느슨한 펠릿이 형성되고, 튜빙은 배지 위에 층을 이룹니다. 모듈이 가라앉으면, 입구가 넓은 10 milliliter 세롤로지컬 피펫을 사용하여 이를 15 milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 15 milliliter 원뿔형 튜브를 보텍싱한 후, 모듈이 가라앉을 때까지 이 과정을 두 번 더 반복합니다.

두 번째와 세 번째 소용돌이에서 가라앉은 모듈들도 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 모든 모듈을 튜브에서 제거하여 한데 모은 후, 튜브 내 배지의 부피를 5 milliliter로 맞춥니다. 이제 모듈에 혈관 내피 세포를 코팅할 준비가 되었으며, 다음 단계에서 모듈 코팅을 위한 내피 세포 준비 과정을 보여드리겠습니다.

먼저, 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. PBS를 제거한 후, trypsin EDTA 3 mL를 첨가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 배지 7 mL에 현탁하여 15 mL 튜브로 옮깁니다.

헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하십시오. 원추형 튜브 바닥의 농축 모듈 mL당 5×10⁶개의 혈관내피세포가 필요합니다. 300 G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 세포 펠릿을 5 mL의 혈관내피세포 배지에 재현탁하십시오.

이제 혈관 내피세포가 포함된 배지 5 mL를 모듈에 추가합니다. 모듈을 혈관 내피세포와 함께 배양하는데, 정적 배양의 경우 모듈을 혈관 내피세포와 함께 뒤집어 섞은 다음 튜브를 똑바로 세워 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 튜브를 다시 뒤집어 37 °C에서 추가로 15분 동안 배양합니다.

내피세포와 함께 모듈을 동적으로 배양하려면, 15 mL 튜브를 37 °C에서 60분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 내피세포 배양이 완료되면 모듈을 조직 배양 처리되지 않은 플레이트로 옮겨 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 부착되지 않은 내피세포를 제거하기 위해 모듈을 신선한 배지가 담긴 새로운 조직 배양 처리되지 않은 플레이트로 옮깁니다. 내피세포가 코팅된 모듈을 세포가 모듈 표면의 100%를 덮을 때까지 37 °C에서 배양합니다.

이 과정은 보통 약 7일이 소요됩니다. 튜브에서 처음 꺼냈을 때 모듈은 원통형으로 보입니다. 내피세포가 코팅된 경우, 부피가 최대 50%까지 수축하여 타원형이 될 수 있으며, 광학 현미경으로 관찰했을 때 더 밀도가 높고 불투명해집니다.

이 이미지들에서 모듈의 직경과 길이는 각각 d와 l로 표시됩니다. 다음 이미지에서는 제작 시점에 모듈 내에 균일하게 분포된 내장된 Hep G2 세포를 보여줍니다. 생존 세포의 녹색으로 표시된 바와 같이 세포들은 높은 생존력을 유지했습니다.

내피세포가 합쳐져 단층(confluent)을 형성했을 때, 사멸한 세포는 붉은색으로 나타납니다. 모듈의 표면에는 밀착연접(tight junctions)이 형성되며, 이는 면역형광법으로 확인할 수 있습니다. VE cadherin 염색 및 질량 전달 분석 결과, 본 모듈은 대형 조직에서 흔히 문제가 되는 산소 전달 부족으로 인한 괴사 중심(necrotic core) 형성 없이 높은 세포 밀도를 유지할 수 있음이 입증되었습니다.

이 예시에서, 전형적인 소형 모듈의 Masson's Trichrome 염색 결과, 제작 7일 후에도 모듈 내에 살아있는 세포들이 균일하고 높게 분포되어 있음을 보여줍니다. 반면, 대형 모듈의 중심부에는 다수의 사멸 세포가 형성되어 외곽의 얇은 층에만 생존 세포가 남아 있었습니다. 또한, 콜라겐과 미세 폴리머의 혼합물로 제작하거나 약물 방출 미세구체를 포함하는 모듈도 제작되었습니다.

여기 h hm EC 세포가 플레인 콜라겐 모듈 위에 배치되었을 때, 모듈은 원통형 모양을 유지하며 콜라겐 전용 모듈에 비해 세포 부착 특성이 제한적입니다. PLGA 기반 생분해성 미세구체가 포함된 콜라겐 모듈의 광학 현미경 이미지가 여기에 표시되어 있습니다. 여러 가지 인비트로(in vitro) 분석법이 모듈과 호환되는 것으로 나타났습니다.

예를 들어, 혈관 형성 분석(angiogenesis assay)에서 내피 세포가 배치된 모듈 위에 지방 유래 줄기 세포를 함께 배양하고 5일 후 관찰하면, 모세혈관 유사 구조의 형성을 쉽게 검출하고 정량화할 수 있습니다. 또 다른 예로, 모듈에서 실시한 생사 판별 분석(live dead assay)의 공초점 현미경 이미지를 통해 살아있는 세포는 녹색으로, 죽은 세포는 적색으로 염색된 것을 확인할 수 있습니다. 마지막으로, 모듈을 미세유체 챔버에 적용하거나 생쥐 및 쥐에 이식하여 서로 다른 세포 유형 간의 상호작용과 호스트 반응에 의해 미세 조직이 어떻게 재구성되는지 연구하는 데 활용해 왔습니다.

이 절차에 따라 모듈을 페트리 접시나 바이오리액터 또는 미세유체 장치와 같은 다른 용기에서 배양할 수 있습니다. 또한, 다양한 세포 유형의 조합을 사용하거나 서로 다른 직경의 튜브를 사용하여 다양한 조직을 생성하도록 이 방법을 조정할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.