콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤

이 절차의 전반적인 목표는 조직 공학 실험에 사용할 수 있는 모듈식 미세 조직을 생산하는 것입니다. 이것은 먼저 주사기를 사용하여 콜라겐 용액을 폴리에틸렌 튜브로 당긴 다음 콜라겐을 겔화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 폴리에틸렌 튜브를 2mm 길이로 절단하여 미세 조직 모듈을 형성하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 튜브에서 모듈을 분리하는 것이며, 마지막으로 모듈은 내피 세포로 코팅됩니다. 궁극적으로, 생성된 미세 조직은 미세유체 챔버를 통한 세포의 상호 작용을 연구하기 위해 체외 세포 분석에 사용할 수 있습니다. 또한, 마이크로 조직을 이식하여 생체 내에서 마이크로 조직의 상호 작용 및 리모델링을 연구하기 위한 조직을 생성할 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 토론토 대학교 Sepan Lab의 Brendan Long입니다. 대형 3D 조직 대체물을 만드는 데 있어 주요 장애물은 이식 후 빠른 혈관 형성이 부족하다는 것입니다. 이 동영상에서는 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 되는 내피 세포로 코팅된 모듈식 조직을 만드는 방법을 보여줍니다.

이 절차를 시연하는 것은 Septin 실험실의 수술 후 연구원인 Chamberlain으로 간주됩니다. 중화해야 하는 콜라겐의 양은 폴리에틸렌 튜브의 길이에 따라 다릅니다. 이 데모에서는 내경이 0.76mm이고 외경이 1.22mm인 2미터 폴리에틸렌 튜브를 사용합니다.

튜브를 준비하려면 20G 바늘 하나를 튜브의 한쪽 끝에 끼운 다음 가스 살균을 위해 튜브 자가 치유 파우치에 튜브를 넣습니다. 콜라겐 1밀리리터는 약 2미터의 폴리에틸렌 튜브를 채우므로 1밀리리터의 콜라겐을 중화합니다. 콜라겐을 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 두십시오.

128 마이크로 리터의 10 x 알파, 콜라겐 밀리리터 당 MEM을 튜브에 추가하고 용액을 반복적으로 피펫팅하여 혼합합니다. 거품 생성을 최소화하도록 주의하면 알파 MEM이 산성화된 콜라겐에 혼합됨에 따라 용액이 노랗게 변해야 합니다. 다음으로, 0.8몰 중탄산나트륨을 첨가하여 콜라겐을 중화합니다.pH의 일반적인 추정치를 위해 노란색 콜라겐 용액이 연한 분홍색으로 변할 때까지 중탄산나트륨을 추가합니다.

일반적으로 콜라겐 1밀리리터당 30-60마이크로리터가 있어야 pH가 7.4입니다. 중화된 콜라겐이 겔화되는 것을 방지하려면 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오. 콜라겐을 젤링하는 절차를 시작하려면 멸균된 폴리에틸렌 튜브가 들어 있는 백을 생물 안전 캐비닛으로 가져가 튜브를 백에 넣은 상태에서 백의 밀봉된 끝을 잘라냅니다.

멸균된 핀셋을 사용하여 이전에 튜브의 한쪽 끝에 삽입된 20게이지 바늘에 3밀리리터 주사기를 부착합니다. 팁이 얼음 위에 보관된 원뿔형 튜브의 바닥에 올 때까지 튜브의 다른 쪽 끝을 중화된 콜라겐에 삽입합니다. 이 다음 단계는 천천히 수행해야 하며, 그렇지 않으면 콜라겐에 기포가 유입됩니다.

콜라겐을 폴리에틸렌 튜브로 당겨 주사기의 플런저를 천천히 집어넣습니다. 콜라겐이 튜브를 통해 당겨지면 20게이지 바늘을 당겨 빼내고 튜브의 양쪽 끝을 백에 다시 넣습니다. 가방을 테이프로 닫은 후 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다.

사전 조립된 절단 장치를 사용하여 튜브를 절단합니다. 이 절차를 시작하려면 절단 장치 앞의 멸균 트레이에 튜브를 놓고 절단 장치의 출구에 있는 절단 장치에 튜브를 로드하고 25ml의 내피 세포 매체가 들어 있는 50ml 원추형 튜브를 설정합니다. 절단 모듈을 수집하려면 절단 장치를 설정하여 2mm 길이의 튜브를 절단한 다음 튜브를 절단합니다.

50ml 원뿔형 튜브에서 섭씨 37도의 절단 모듈을 60분 동안 배양합니다. 튜브에서 콜라겐 모듈을 제거하기 위해 와류, 중간 속도로 모듈을 포함하는 50리터 원추형 튜브. 10초 동안 모듈을 튜브 바닥에 가라앉히는 데 약 5분이 걸립니다.

느슨한 모듈 펠릿은 튜브 바닥에 형성되고 튜브는 매체 위에 층을 형성합니다. 모듈이 안정된 후 입이 넓은 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. Vortex, 15 밀리리터 원뿔형 튜브를 사용한 다음 모듈이 두 번 더 안정되도록 합니다.

두 번째 및 세 번째 와류에서 침전된 모듈도 15밀리리터 튜브로 전달됩니다. 모든 모듈을 튜브에서 제거하고 풀링한 후 튜브의 미디어 부피를 5ml로 가져옵니다. 이제 모듈은 내피 세포로 코팅할 준비가 되었으며, 다음은 모듈 코팅을 위한 내피 세포를 준비하기 위해 표시될 것입니다.

먼저 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. PBS를 제거한 후 트립신 EDTA 3ml를 넣고 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 다음으로, resusus, 7 밀리리터의 배지에 세포를 현탁시키고 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.

혈구 분석기를 사용하여 세포를 세면 원뿔형 튜브 바닥에 포장 된 모듈의 밀리리터 당 6 번째 내피 세포에 5 곱하기 10이 필요합니다. 300G에서 5분 동안 세포를 펠렛으로 만듭니다. 세포 펠릿을 5ml의 내피 세포 배지에 재현탁합니다.

이제 내피 세포를 포함하는 5ml의 배지를 모듈에 추가합니다. 모듈은 정적 배양을 위해 정적, 동적으로 내피 세포와 함께 배양되고, 반전을 통해 모듈을 내피 세포와 혼합한 다음 튜브를 섭씨 37도에서 15분 동안 똑바로 세웁니다. 15분 후 튜브를 다시 뒤집고 섭씨 37도에서 15분 더 배양합니다.

내피 세포가 있는 모듈을 동적으로 배양하려면 섭씨 37도에서 15ml 튜브를 60분 동안 부드럽게 흔듭니다. 내피 세포를 사용한 배양이 완료되면 모듈을 비조직 배양 처리 플레이트로 옮기고 다음 날 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한 후 새로운 배지가 있는 새로운 비조직 배양 처리 플레이트에 모듈을 배치하여 부착되지 않은 내피 세포를 제거합니다. 내피 세포로 코팅된 모듈을 섭씨 37도에서 세포가 모듈 표면의 100%를 덮을 때까지 배양합니다.

이 작업은 보통 약 7일이 소요됩니다. 모듈은 튜브에서 처음 제거될 때 원통형으로 보입니다. 내피 세포로 코팅되어 있으면 부피가 최대 50%까지 수축하고 타원형 모양이 될 수 있을 뿐만 아니라 광학 현미경으로 볼 때 밀도가 높아지고 불투명해질 수 있습니다.

이 이미지에서 모듈의 직경과 길이는 각각 d와 l로 표시됩니다. 다음 이미지는 제작 당시 모듈 내에 균일하게 분포되어 있는 임베디드 G형 간염 2개의 세포를 보여줍니다. 세포는 살아있는 세포의 녹색으로 표시된 것처럼 높은 생존력을 유지했습니다.

죽은 세포는 내피 세포가 합류할 때 빨간색을 띱니다. 모듈의 표면에는 면역형광으로 볼 수 있는 긴밀한 접합부가 형성되어 있습니다. VE cadherin 질량 전달 분석의 염색은 모듈이 더 큰 조직에서 종종 문제가 되는 부적절한 산소 수송으로 인해 괴사 코어를 생성하지 않고 높은 세포 밀도를 지원할 수 있음을 입증했습니다.

이 예에서 일반적인 소형 모듈의 massen Tri chro 염색은 모듈이 제작 후 7일 동안 살아있는 세포의 균일하고 높은 분포를 유지했음을 보여줍니다. 대조적으로, 큰 모듈의 중심부 내에 많은 수의 죽은 세포가 형성되어 생존 가능한 세포의 얇은 테두리만 남았습니다. 모듈은 또한 콜라겐과 ine 폴리머의 혼합물 또는 약물 용출 미세구를 함유하여 생산되었습니다.

여기서 h hm EC one 세포가 페일린 콜라겐 모듈에 안착할 때, 모듈은 원통형 모양을 유지하고 콜라겐 전용 모듈에 비해 세포 부착 특성이 제한적입니다. PLGA 기반 생분해성 미세구를 포함하는 콜라겐 모듈의 광학 현미경 이미지가 여기에 나와 있습니다. 여러 체외 분석법이 모듈과 호환되는 것으로 나타났습니다.

예를 들어, 혈관 형성 분석에서 내피 세포가 있는 모듈의 모세관 유사 형성은 지방 유래 줄기 세포로 배양한 지 5일 후에 쉽게 검출하고 정량화할 수 있습니다. 또 다른 예로, 모듈에서 살아있는 죽은 분석의 컨포칼 현미경 이미지는 살아있는 세포가 녹색으로 염색되고 죽은 세포가 빨간색으로 착색된 것을 보여줍니다. 마지막으로, 모듈은 미세유체 챔버에서도 사용되었으며 마우스와 쥐에 이식되어 서로 다른 세포 유형 간의 상호 작용과 미세 조직이 숙주 반응에 의해 어떻게 리모델링되는지 연구했습니다.

절차에 따라 모듈은 페트리 접시 또는 생물 반응기 또는 미세 유체 장치와 같은 다른 용기에서 배양 할 수 있습니다. 이 방법은 세포 유형의 다양한 조합을 사용하거나 직경이 다른 튜브를 사용하여 다른 조직을 생성하도록 조정할 수도 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.