Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

제한 희석 세포 이식 분석법은 실험 동물 모델에서 자가 재생 가능성을 평가하기 위한 황금 표준입니다. 이 시연에서는 1 세포 단계 syngeneic zebrafish 배아에 rag two MIC 및 RAG 2 GFP를 주입하여 형광 표지된 T 세포 급성 림프구 백혈병을 발병시킬 형질전환 제브라피쉬를 생성합니다. 생후 60일이 지나면 제브라피시에서 원발성 백혈병 세포를 분리한 다음 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 정제합니다.

다음으로, 세포를 성인 제브라피쉬의 복막강에 극한 희석으로 이식하고 최대 90일 동안 물고기의 종양 성장을 모니터링합니다. 마지막으로, 극한 희석 분석 통계 소프트웨어 프로그램은 원래 종양 내에서 백혈병 증식 세포의 빈도를 정량화하는 데 사용됩니다. 제한 희석 세포 이식 분석을 통해 연구자는 종양 덩어리의 대부분에 포함된 자가 재생 세포의 수를 정확하게 평가할 수 있습니다.

이러한 자가 재생 세포가 암 형성을 촉진하고 궁극적으로 재발의 원인이 됩니다. 제브라 피쉬 모델에서 제한 희석 이식 분석을 수행하는 주요 이점은 각 실험에 대해 많은 물고기를 이식할 수 있어 자가 재생 종양 증식 세포의 빈도를 결정할 때 더 나은 정밀도를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법은 급성 림프모구 백혈병인 T 세포의 종양 전파 세포에 대한 통찰력을 제공합니다.

또한 다른 제브라피시 암 모델을 이해하는 데에도 적용할 수 있습니다. 연구실의 동료인 제시카 블랙번(Jessica Blackburn)과 재능 있는 기술자인 샐리 리우(Sally Liu)가 오늘 절차를 시연할 예정입니다.Rag 2 CM 및 RAG 2 G-F-P-D-N-A 구조를 선형화하려면 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 하나가 아닌 제한 효소로 각 플라스미드 10마이크로그램을 분해합니다. 페닐 클로로포름 추출 및 에탄올 침전 후, 우리는 각 플라스미드를 20 마이크로 리터의 물에 현탁시킵니다.

20 마이크로리터, 10 마이크로리터 및 5 마이크로리터의 고범위 DNA 래더를 사용하여 각 분해된 플라스미드를 1:1, 1-5, 1-10 희석하여 1% agro gel의 DNA 농도를 측정합니다. 이제 DNA를 CG 1 균주 신젠에 주입하기 위해 마이크로리터당 60나노그램의 최종 농도로 희석합니다. 제브라피쉬 배아는 마이크로리터 당 30나노그램, 걸레 2CM, 마이크로리터당 30나노그램 250나노

두 개의 GFP를 하나의 세포 단계 제브라피시 배아로 조심스럽게 DNA를 노른자가 아닌 세포로 직접 표적으로 삼습니다. 주입된 배아는 섭씨 28.5도에서 보관하고 생후 5일째 24시간 후에 죽은 배아를 제거하고, 주입 후 약 28일 후에 동물을 대형 탱크로 옮깁니다. 페트리 접시에 25ml의 어류 시스템 물에 200마이크로리터의 밀리리터 트리카 S 당 4나노그램을 첨가하여 유충 제브라피쉬를 마취했습니다.

GFP 형광을 검출하기 위해 epi 형광 현미경을 사용하여 형광 표지된 TALL 유충의 발달 여부를 검사합니다. 종양 양성 유충과 음성 유충을 분리하여 분석에서 백혈병 물고기가 누락되지 않도록 합니다. 음성 유충은 종양이 더 커졌을 수 있는 후 나중에 검사할 수 있으며, 종양 성장을 추적하기 위해 에피 형광 현미경을 사용하여 적어도 일주일에 한 번 형광 표지된 백혈병 물고기를 모니터링합니다.

GFP 양성 백혈병 세포가 동물의 50% 이상을 추월한 경우 밀리리터당 4나노그램 1밀리리터를 추가합니다. Trica S를 9 밀리리터의 물고기 시스템 물이 들어있는 페트리 접시에 넣고 물고기를 희생시키기 위해 0.9 XPBS에 5 % 태아 혈청 1 밀리리터가 들어있는 새로운 페트리 접시에 물고기를 넣고 면도날로 물고기를 침식하고 혼합물을 피펫으로 만들어 큰 세포 덩어리를 분리합니다. 그런 다음 세포를 40마이크로미터 메쉬 스트레이너를 통해 50ml 튜브에 통과시킵니다.

500 마이크로 리터의 세포를 4 밀리리터 폴리스티렌 튜브에 피펫으로 넣습니다. 밀리리터당 1밀리그램의 1마이크로리터, 요오드화 페리듐을 추가하여 죽은 세포 소용돌이를 표시한 다음 세포를 얼음 위에 두십시오. 또한 이식 중 종양 세포의 운반체 역할을 하는 정상 혈액 세포를 0.9 X PB S에서 50ml 튜브에 50ml 튜브에 총 5ml의 총 부피로 채취하기 위해 야생형 CG one 물고기를 준비합니다.

정상 혈액 세포를 0.9 x pbs에서 5%FBS의 밀리리터당 5번째 세포로 3배 10으로 희석한 다음 형광 활성화 세포 분류기를 사용하여 96웰 플레이트의 웰당 100마이크로리터를 피펫으로 계산하고, GFP 양성 PI 음성 종양 세포를 표시된 용량으로 혈액 세포를 포함하는 96웰 플레이트로 분류합니다. 게다가, 10의 세포를 정상적인 혈액 세포 없는 우물로 분류하고 분류한 세포 분리기의 순수성 그리고 생존 능력을 사정하기 위하여 사실을 사용하여 재분석하십시오. 96웰 플레이트를 2000GS에서 10분 동안 가열하여 세포를 펠릿화합니다.

95마이크로리터의 스내트를 제거하고 나머지 5마이크로리터에 세포를 재현탁합니다. 26 및 1/2 게이지 마이크로 주사기를 사용하여 60일 이상 된 성인 syngeneic zebrafish의 복막강에 세포 현탁액을 주입합니다. 제브라피쉬는 이식 전에 마취할 필요가 없습니다.

이식 후 약 28일 이내에 10개의 백혈병 세포를 가진 물고기 45마리, 100개의 세포를 가진 물고기 20마리, 1000개의 세포를 가진 물고기 7마리, 그리고 10, 000개의 키가 큰 세포를 가진 물고기 5마리를 이식합니다. 4 85 20 여기 파장과 5 30 25 방출 필터를 사용하여 epi 형광 현미경으로 수용된 얼룩말 물고기를 검사했습니다. GFP 형광을 검출하기 위하여.

주입된 총 물고기 수당 양성 물고기 수를 기록합니다. 14일마다 최대 90마리까지 물고기를 재검사하고 양성 물고기의 수를 기록합니다. 종양 양성 물고기가 더 많아지면

트리카 US 과다 투여로 동물을 희생하고, 결과를 표에 입력하고, 데이터를 웹 기반의 극한 희석 분석 소프트웨어에 업로드하여 1차 톨 내에서 자가 재생 백혈병 세포의 빈도를 결정하고, CG 1 균주 배아에 RAG 2 cmic 및 RAG 2 GFP 유충을 주입하고, 이전 연구와 일치하는 28일 후에 1차 톨을 스크리닝하고, 주입된 물고기의 약 5%는 흉선 내에 GFP 양성 T 세포를 가지고 있으며, 이 물고기의 100%는 백혈병에 걸립니다. 여기서, 형광 표지된 TALL 세포를 65일 된 병에 걸린 동물로부터 분류하여 제한 희석 세포 이식 분석에 사용하였다. 먼저, 단일 세포를 선택하기 위해 보행을 그렸습니다.

그런 다음 프로피듐 요오드화물 음성 세포를 선택했습니다. 그리고 마지막으로 분류를 위해 GFP 양성 백혈병 세포만 선택하기 위해 보행을 그렸습니다. 28일째에 키가 큰 이식된 물고기의 이 예에서 초기 단계 종양은 주사 부위 근처의 GFP 양성 세포 영역으로 나타났습니다.

일부 TLS는 이러한 실험을 위해 복막강을 채우도록 확장되어 더 진행되었지만, 220마리 이상의 동물을 이식했으며, 이는 한 사람이 몇 시간 내에 쉽게 수행할 수 있습니다. elda 소프트웨어를 사용한 데이터 분석은 평균적으로 135개의 T 세포 중 1개, 모든 세포가 자가 재생 백혈병 증식 세포인 것으로 나타났습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 syngenetic zebrafish의 복막강에 희석을 제한하면서 종양 세포를 이식하는 방법과 결과 데이터를 사용하여 주어진 종양 내에서 종양 증식 세포의 빈도를 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

유전자 변형 동물을 활용한 추가 연구는 이러한 종양 증식 세포의 자가 재생을 관장하는 메커니즘을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.