Name: 품질 이노시톨 Pyrophosphates의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 학습하세요 이노시톨 피로인산(IP7)의 효소적 합성 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용한 정제 방법을. 이 프로토콜은 암과 당뇨병 등 인간 질병 연구에 필수적인 세포 신호전달 메커니즘 규명에 활용됩니다.

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우리는 도움이 덧글에 대한 A. 이럴 감사하고 원고를 읽을 수 있습니다. 이 작품은 셀 단위로 생물 의학 연구위원회 (MRC) 기금에 의해 그리고 인간 프론티어 과학 프로그램 그랜트 (RGP0048/2009-C)에 의해 지원되었다.

1. 효소 반응 - 1 일 (오후에 1 시간) <ol><li> 첫 번째 단계는 IP 6 K1이나 VIP1이 pyrophosphorylated isoforms에 IP 6으로 변환하는 효소 반응을 독립 10-20를 준비하는 것입니다. </li><li> 우리는 E.에서 정화 그의 - IP 6 K1과 GST - Vip1 효소를 사용하여 프로토콜에 따라 대장균 이전 17,18 설명했다. </li><li> 1X 반응 완충액 (30 MM의 Hepes 산도 6.8, 50 MM NaCl, 6 MM MgSO 4, 1 ㎜ DTT), 6 당연 PhosphoCreatine (PCR), 25 U / ML CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 MM ATP (MG가 포함된 50 μL 반응 준비 소금), 0.3 MM IP6, 0.05-0.1 μg 그의 - IP 6 K1이나 GST - Vip1. MiliQ ddH 2 O.과 볼륨을 조정 </li><li> 간단히 37 반응과 부화 ° C 하루 회전을 스핀. </li></ol> 2. Polyacrylamide 젤 주조 및 로딩 - 2 일 (오후 4 시간) <ol><li> polyacrylamide 젤은 24cm 길이 18cm 폭 유리 접시와 1.5 mm 폭 스페이서를 사용하여 준비가되어 있습니다. 보통 16 차선 또는 예비 하나의 레인 빗이 사용됩니다. </li><li> 35.5 % (W / V) 아크릴 아미드 : 비스 - 아크릴 아미드 19시 1분, 1X 트리스 / Borate / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TBE), 0.05 % (W / V) 암모늄 persulfate (APS는 다음을 포함하는 혼합 (50 ML / 겔) 준비 ), 0.05 % (W / V)가 Temed. , 사전 c​​asted 유리 플레이트 사이의 믹스를 부어 빗를 넣고 RT에서 30~60분을위한 중합 보자. </li><li> 젤 polymerized되면​​ 추위 방기구를 전송하고 200-300 볼트에서 30-60 분 동안 1X TBE에 미리 실행합니다. </li><li> 각 반응 OrangeG 염료의 1X (10 MM 트리스 - HCL pH7.0, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 30 % 글리세롤, 0.1 % OrangeG) 추가합니다. 표준 컨트롤로 로드할 수 IP 6 2 nmol을 포함하는 샘플을 준비합니다. </li><li> 주사기 및 침전물을 제거하는 21G 바늘을 사용하여 버퍼를 실행하는 각 잘 철저히 세척 후 젤을로드합니다. 측면 우물에 로딩하지 마십시오. </li><li> OrangeG 염료 밴드가 젤 하단에서 마지막 10cm 이내가 될 때까지, 450-550 볼트 (7 mAmp / 겔)에서 하룻밤 젤을 실행합니다. </li></ol> 3. IP 7 절연 - 3 일 (4 시간)과 일 4 (6-7시간의 SpeedVac 건조 과정) <ol><li> 겔 기기를 분해 조심스럽게 다른 하나 젤 떠나는 한 유리 플레이트를 제거합니다. 그림 1에 표시된 IP 6 표준 하나의 샘플 레인이있는 바닥에 그냥 OrangeG 염료 대역 이상에서 젤의 일부를 잘라. </li><li> 컷 몇 분 동안 Toluidine 블루 (0.1 % (W / V) toluidine 파란색, 20 % (W / V) 메탄올, 2 % (W / V) 글리세롤)로 젤의 부분 (1-3 분) 또는 스테인 이노시톨 나트륨 밴드가 나타날 때까지. 이전에 건조에서 흠없는 젤을 방지하기 위해 젤 위에 다시 제거 유리 접시 놔. </li></ol> 그것은 IP 6 표준보다 약간 느리게 동작하기 때문에 IP 7 밴드가 표시됩니다. IP 6보다 빠르게 실행 ATP는 또한 (그림 1) 표시되어야합니다. 몇 분 동안 데 - 얼룩 솔루션 (20 % (W / V) 메탄올)에 젤의 스테인드 부분을 전송, Toluidine 블루의 초과 멀리 세척하고 흠없는 젤로 젤을 조정. 높은 pyrophosphorylated 이노시톨 isoforms (IP 8 IP 9)의 시각화가 필요한 경우, 상온에서 20 분 Toluidine 블루 얼룩 솔루션 젤 얼룩. 그 후, 약 15 분 드 얼룩 솔루션 Toluidine의 블루 멀리 씻으십시오. <ol start="3"><li> 면도날은 참조로 스테인드 젤 (그림 1)로 결정 IP 7 마이 그 레이션하는 위치를 사용하여 젤의 흠없는 부분에 IP 7 밴드를 잘라 함께. </li><li> 15 ML 튜브의 겔에서 절단했던 IP 7 밴드 넣고 MilliQ ddH 2 O. 10 ML을 추가 실온에서 10 분 순환에 튜브를 넣어. TBE와 미세한 입자의 아크릴 아미드 초과 제거하는 액체를 폐기하십시오. </li><li> 그 후, 두 탈수 - 수화 사이클을 수행합니다. IP에 7을 포함하는 젤로 튜브의 50 % (W / V) 메탄올 5 ML을 추가하고 2 시간 동안 실온에서 회전. MilliQ ddH 2 O 5 ML를 포함하는 새로운 15 ML 튜브로 겔 슬라이스를 전송하고 2 시간 동안 실온에서 회전. 튜브에서 메탄올과 MilliQ H 2 O을 삭제하지 마십시오. 이전에 사용한 15 ML 튜브에 다시 전송 polyacrylamide 젤로 한 번 더 탈수 - 수화주기를 반복합니다. 세척 중 하나는 밤을 통해 수행할 수 있습니다. </li><li> eluted IP 7을 집중, 60 온수 SpeedVac ° C.를 사용하여 (5 ML MilliQddH 2 O 5 ML 50 % (W / V) 메탄올) 함께 10 ML을 건조 </li><li> 샘플이 거의 건조되면 a1.5 ML의 원심 분리기 튜브 및 5000 rpm으로 2 분 동안 회전하는 나머지 액체 (300-600 μl)를 전송합니다. </li><li> 새로운 1.5 ML의 원심 관에 뜨는 및 전송 수집, 휴가이 아크릴 아미드 입자를 포함할 수 있으므로 하단 20-30 μL. </li><li> 필요한 경우하면 unheated Speed​​Vac를 사용하여 건조 과정을 계속합니다. 샘플 100-300 μL의 볼륨에 도달하면 샘플이 완전히 건조하는 경우 IP 7 복구가 급격하게 감소, 따라서 건조 과정을 종료할 수 있습니다. </li></ol> 4. IP 7 농도 및 순도의 결정. <ol><li> 마찬가지로 제 2.2-2.5로, 페이지 젤에서 실행 회수 IP 7 샘플 2-5 μL를 사용하십시오. 농도 표준 및 폴리 - P 마커 4 nmol으로 IP 6 여러 dilutions (예 : 0.5, 1, 2, 4 nmol)을로드합니다. 젤을 실행 후, 섹션 3.2 (그림 2A)에 설명된 절차에 따라 얼룩 및 Toluidine 블루 솔루션 드 얼룩 전체 젤로 이노시톨 나트륨의 isoforms을 시각화. </li><li> Toluidine의 얼룩 후, 농도는 그림의 2B에 나타난 젤 검사 및 IP 6 IP 7 일 사이 강도의 차이를 비교, 같은 이미지 - J와 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여 결정하실 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : IP 6 K1과 VIP1 효소를 사용하여 IP 7 IP 6 예비 효소 변환은 쉽게 페이지 분석 (그림 1)를 사용하여 해결될 수 있습니다. 그들은 이노시톨 고리에 존재하는 인산염 그룹의 수에 따라 느리게 실행 이후 Toluidine 블루 겔 얼룩과 함께 크기 조절과 같은 IP 6 로딩은 pyrophosphorylated derivates의 확인하실 수 있습니다. 위에서 설명한 절차는 IP 7 쉽게 정화 수 있습니다. 페이지에서 정화 이노시톨 나트륨의 분석은 우리의 IP 7 (그림 2A)의 순결을 공개했다. 흥미롭게도, VIP1의 IP 7 제품의 1/3PP-IP 5 이성질체는 IP 6 K1에 의해 생성되는 IP 7 5PP - IP 5 이성질체보다 약간 느린 마이 그 레이션합니다. 정화 IP 7 (그림 2B)의 농도 쉽게 부량을 허용 IP 6 기준 중 하나를 사용하십시오. 자세한 실험 IP 7을 사용하기 전에, 그 생물 학적 활동은 평가 수 (그림 3). 5PP - IP 5 VIP1과 IP 7 인산 가수 분해 효소 DDP1 (diphosphoinositol의 polyphosphate의 phosphohydrolase)와 incubated입니다. 정기적으로, 정화 IP 7 DDP1 (그림 3)에 의해 VIP1하여 IP 8과 IP 6으로 변환됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 :. IP 7 밴드의 페이지와 고립의 Toluidine 얼룩은 표준 IP (6)이있는 젤의 부분은 절단 및 Toluidine 블루 솔루션을 사용하여 얼룩되었습니다. 세 밴드가 (위에서 아래로) IP 7, IP 6 ATP를 나타냅니다. 젤의 스테인드 부분은 다음 젤의 나머지에 부합했다. 이것은 다음 (점선 상자) 잘라 정화 수있는 IP의 7을 포함하는 젤 부분의 현지화 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : IP 6 K1과 VIP1 반응 제품의 페이지 분석. A) Toluidine 블루 염색법에 의해 IP 6 분석 (4, 2, 1, 0.5 nmol)는 IP 6 K1 (5PP - IP 5) 및 ​​VIP1 (1/3PP-IP 모두에서 정화 IP 7 농도를 결정하기 위해 사용되었습니다 5) 반응. B) 스캐터 플롯 분석 정화 IP 7의 농도를 결정합니다. 농도는 IP 6 미리 정해진 금액에 비해 imageJ 소프트웨어를 사용하여 계산 밴드 강도,에 따라 결정됩니다. X - 축은 농도를 나타내고 y 축은 nmol 표현 농도를 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 :. IP 7 생물 학적 활동의 분석 정화 IP 7의 품질을 확인하려면 우리는 DDP1 VIP1 또는 IP 7 인산 가수 분해 효소와 5PP - IP 5 (IP 6 K1 생성된 IP 7) incubated 다음 페이지에 대한 반응을 해결. DAPI와 Toluidine 얼룩이 VIP1의 IP 8 예상 생산과 DDP1하여 IP 6 IP 7의 변환을 공개했다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

생화학에서 이노시톨 나트륨의 사용은 심각하게 이러한 화합물의 상업 unavailability와 기존의 검색 방법의 가난한 감도에 의해 제한됩니다. 다른 인산염 그룹의 번호, Toluidine 블루 (그림 1), 인산염 그룹에 바인딩 metachromatic 염료를 가진 분자의 분리를 가능하게 페이지의 결합 연구 20 새로운 길을 여는 이노시톨 pyrophoshate의 isoforms의 쉬운 검색이 가능합니다. 효소 반응의 이노시톨 나트륨 제품을 정화 페이지 기술의 설명 사용 IP 6 K1이나 VIP1 하나 고품질의 IP 7 다량의 생산을 허용 간단, 경제적 안정 방법입니다 outby 실시. 위에서 설명한 방법은 7 IP의 간단한 정화에 국한되지 않습니다하지만 설명 프로토콜의 사소한 수정 이노시톨 pyrophosphates의 다른 범위의 정화를 허용할 수 있습니다. 이상의 여덟 인산염 그룹을 포함하는 높은 phosphorylated 이노시톨 나트륨의 isoforms은 기판 20,6로 IP 7 IP 6 다른 양의를 사용하여 검색하실 수 있습니다. 이러한 이노시톨 pyrophosphates은 얼룩 절차의 길이를 증가하고 이후 (3.2) 정화에 의해 감지하실 수 있습니다. 또한, 효소 반응을위한 기판으로 IP 5 사용 PP - IP 5 정화 및 이노시톨 고리에 수산기 그룹을 포함하는 다른 이노시톨 pyrophosphates을 허용합니다. 결론적으로,이 undemanding 방법은 이처럼 흥미로운 연구 분야에 대한 새로운 길을 열어, 널리 사용 악기 이노시톨 pyrophosphates의 밀리그램 수량의 안정적인 정화를 위해 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> Phytic의 산성 (IP 6) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> 폴리 - P (나트륨 hexametaphosphate) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP - MG 2 + 소금 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> PhosphoCreatine (PCR) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho의 키나제 (CPK) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST - Vip1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> 그의 - IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> 그의 - Ddp1 </td><td> 실험실에서 사용 가능 </td><td> 실험실에서 사용 가능 </td></tr><tr><td> 아크릴 아미드 : 비스 - 아크릴 아미드 19시 1분 (40 %) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> 암모늄 Persulfate (APS) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> 트리스 / Borate / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TBE) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> Temed </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Toluidine 블루 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> Speed​​Vac </td><td> 그리스도 </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> 젤 장치 </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> 진공 매니폴드 </td><td> 그리스도 </td><td> 알파 2-4 </td></tr><tr><td> 배기기 </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

품질 이노시톨 pyrophosphates의 준비

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

묘 - 이노시톨도 수정되지 않은 자연의 이상의 복잡한 phosphorylated derivates에 속해 있습니다. 최신, 진핵 세포에서 가장 풍부한 두 사람은 이노시톨 pentakisphosphate IP (5)과 이노시톨 hexakisphosphate (phytic 산성 또는 IP 6)입니다. IP 5 IP 6 하나 이상의 나트륨 채권 하나를 포함 이노시톨 나트륨 분자의 엽 성의 전구 물질입니다. IP 6 인산화은 diphoshoinositolpentakisphosphate IP (7 PP - IP 5) 및 ​​bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 (PP) 2 - IP 4) 생성합니다. 이노시톨 pyrophosphates는 지금까지 공부를 모든 진핵 생물에서 고립되어있다. 또한, 이노시톨 나트륨 합성에 대한 책임 효소의 두 개의 클래스는 매우 진화 2-4 걸쳐 보존되어 있습니다. IP 6 kinases (IP 6 KS) posses 거대한 촉매 유연성, 5 IP와 PP - IP 4 각각 IP 7 IP 6 이후, 기판 이러한 제품을 사용하여 더 복잡한 분자의 생성 5,6을 촉진 변환 . 최근 나트륨 생성 효소의 두 번째 클래스는 IP 7 8 7,8 IP에 IP 6 변환할 수있는 효모 단백질 VIP 1의 양식 (도 PP - IP 5 K로 함)에서 확인되었다. 이노시톨 pyrophosphates는 인슐린 분비 9, telomere의 길이 10,11, chemotaxis 12 소낭성의 인신 매매 13, 인산 항상성 14 HIV - 1 개그 출시 15 여러 이질적인 세포 과정을 조절. 동작의 두 가지 메커니즘이 분자의 클래스에 대한 제안되었습니다. 그들은 allosterically AKT 16과 같은 특정 단백질과 상호 작용하여 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 또는 나트륨 그룹은 사전 phosphorylated 단백질 17 인산염을 기부하실 수 있습니다. 이 연구 분야의 무한한 잠재력은 이러한 분자이 새 게시물 - translational 수정을 공부하고 많은 과학자를 방해 이노시톨 pyrophosphates의 상용 소스의 부재에 의해 방해합니다. 이노시톨 pyrophosphates을 분리하기 위해 현재 사용할 수있는 방법은 복잡한 색층 장치 18,19 필요합니다. 이러한 절차는 이노시톨 나트륨 저하 20 그러므로 가난한 회복으로 이어질 수 산성 조건을 사용합니다. 또한, 성가신 포스트 컬럼 탈염 절차는 전문 실험실 그들의 사용을 제한할 수 있습니다. 본 연구에서는 우리는 IP 6 키나제와 PP - IP 5 kinases 반응의 제품의 생성, 절연 및 정화를위한 undemanding 방법을 설명합니다. 이 방법은 매우 phosphorylated 이노시톨 polyphosphates 20를 해결하기 위해 polyacrylamide 젤 전기 영동 (PAGE)의 능력에 의해 가능했다. IP 6 K1과 기판과 같은 IP 6을 사용 PP - IP 5 K 효소 반응에 따라, 페이지는 이후 물에 eluted 있던 생성 이노시톨 pyrophosphates를 구분하는 데 사용되었다.

이노시톨 pyrophosphates 인간 pathologies에 중요한 역할 등 암, 당뇨병과 비만을 재생할 수 있지만, 행동의 정확한 메커니즘은 분쟁의 문제입니다. 상용 이노시톨 pyrophosphates의 부족 상세한 연구는 렌더링 문제. 여기 이노시톨 pyrophosphates의 밀리그램을 생산하고 격리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

품질 이노시톨 Pyrophosphates의 준비

마이오-이노시톨(Myo-inositol)은 자연계에 그대로 존재하거나 더 복잡한 인산화 유도체 형태로 존재합니다. 후자의 경우, 진핵세포에서 가장 풍부한 두 가지는...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 고품질의 nool pyrophosphate를 생성하고 정제하는 것입니다. 이를 위해 먼저 IP six를 IP six kinase 효소의 기질로 사용하여 IP seven을 생성합니다. 그다음, 효소 반응물을 폴리아미드 겔에 로딩하고 IP seven에 해당하는 밴드를 절취합니다.이후 연속적인 탈수 및 수화 사이클을 통해 IP seven을 분리합니다. 절차의 마지막 단계는 생성물의 순도를 확인하고 농도를 결정하는 것입니다. 최종적으로, IP seven의 배양을 통해 IP seven의 생물학적 활성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.VIP1 키나아제와 IP7 포스파타아제인 DDP1을 이용하면, 이러한 반응을 통해 각각 IP8과 IP6를 생성할 수 있습니다. 이 방법은 IP7 신호 전달에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 IP8과 같은 고인산화물이나 IP5 유래 PPIP4와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.본 프로토콜은 IP six kinase one 또는 VIP one이 IP six를 pyro phospho 관련 이성질체로 전환하는 효소 반응 준비 과정으로 시작합니다. 이번 시연을 위해, histamine 태그가 붙은 IP six kinase one과 GST 태그가 붙은 VIP one 효소를 이전에 설명된 절차에 따라 e coli로부터 정제하였습니다. 우선, 서면 프로토콜에 기술된 대로 IP six와 his IP six kinase one 또는 GST VIP one이 포함된 10~20개의 독립적인 효소 반응액을 준비하십시오.Milli Q 2차 증류수를 사용하여 부피를 50 µL로 조정합니다. 튜브를 짧게 원심 분리한 후, 회전시키며 37 °C에서 하룻밤 동안 반응물을 배양합니다. 길이 24 cm, 너비 18 cm의 유리판, 1.5 mm 너비의 간격 및 16-레인 콤을 사용하여 폴리아크릴아마이드 겔 장치를 준비합니다.다음으로, 미리 준비한 겔 용액을 사전 제작된 유리판 사이에 겔당 50 milliliters의 부피로 붓습니다. 콤(comb)을 삽입하고 실온에서 30분에서 60분 동안 겔을 중합시킵니다. 겔 중합이 완료되면 장치를 저온실로 옮깁니다.1배 TBE에서 200~300V로 약 30~60분 동안 젤을 사전 전기영동하며, 이때 1배 orange G 염료를 사용합니다. 각 반응에 대해 2mol의 IP six를 포함하는 표준 대조군 샘플을 준비합니다. 사전 전기영동 후, 각 웰을 전개 버퍼로 충분히 세척합니다.21 gauge 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 침전물을 제거합니다. 그런 다음 겔의 처음 두 레인과 마지막 두 레인을 제외하고 샘플을 로딩합니다. 마지막으로, 오렌지 G 염료 밴드가 겔 하단에서 10 cm 이내에 도달할 때까지 겔당 7 mA의 전류로 하룻밤 동안 전기영동을 수행합니다.IP seven의 분리를 시작하려면, 젤 장치를 분해하고 유리판 하나를 조심스럽게 제거하여 다른 유리판 위에 젤이 남도록 합니다. 오렌지색 GD 밴드 바로 위부터 바닥까지, IP six 표준물질과 샘플 레인 하나를 포함하여 젤의 일부를 작게 절단합니다. Anatol Pyrophosphate 밴드가 나타날 때까지 절단한 젤 부분을 toluidine blue로 몇 분 동안 염색합니다.그동안, 염색되지 않은 겔이 건조되는 것을 방지하기 위해 이전에 제거했던 유리판을 다시 겔 위에 덮어둡니다. 겔의 염색된 부분을 DES 염색액으로 수 분간 옮겨 과잉의 toluidine blue를 씻어낸 다음, 염색되지 않은 겔과 함께 다시 배치합니다. IP seven 밴드는 IP six 표준보다 약간 느리게 이동하므로 확인 가능해야 하며, IP six보다 빠르게 이동하는 A TP 역시 확인 가능해야 합니다.다음으로, 면도날을 사용하여 겔의 염색되지 않은 부분에서 IP seven 밴드를 절단합니다. 이때 염색된 겔을 통해 확인한 IP seven의 이동 위치를 활용하십시오. IP seven 밴드의 위치를 추정하기 위해, 겔에서 절단한 IP seven 밴드를 15 milliliter 튜브에 넣고 10 milliliters의 milli Q 이중 증류수를 추가합니다.배양 후 튜브를 상온에서 10분 동안 회전시킨 다음, 액체를 디캔팅하여 과량의 TBE와 미세한 아크릴아마이드 입자를 제거합니다. 이어서, IP seven 겔이 들어 있는 튜브에 50% methanol 5 mL를 먼저 첨가하여 두 차례의 탈수 및 재수화 사이클을 수행합니다. 시료를 상온에서 2시간 동안 회전시킵니다.그 다음 젤 슬라이스를 5 mL의 milli Q 2차 증류수가 들어 있는 새로운 15 mL 튜브로 옮기고 실온에서 2시간 동안 회전시킨다. 배양 후 메탄올이 포함된 튜브는 추후 사용을 위해 보관한다. 용출된 IP seven을 농축하기 위해 탈수 및 수화 사이클을 한 번 더 반복한다.앞서 첨가한 5 mL의 물과 5 mL의 50% Methanol을 혼합합니다. 60 °C로 가열된 speed vac를 사용하여 혼합 용액을 건조시킵니다. 샘플이 거의 건조되면, 남은 액체를 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.튜브를 5,000 rpm에서 2분 동안 원심분리합니다. 아크릴아마이드 입자가 포함되어 있을 수 있으므로 하단의 20~30 µL는 남겨두고 상층액을 수집합니다. 샘플을 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.필요한 경우, 가열되지 않은 speed vac을 사용하여 건조 과정을 계속합니다. 샘플이 완전히 건조되면 IP seven의 회수율이 급격히 감소합니다. 따라서 샘플의 부피가 100 to 300 µL에 도달했을 때 건조 과정을 반드시 중단해야 합니다.분리된 IP seven을 회수한 후, 샘플 2~5 µL를 PAGE 젤에 로딩하여 농도와 순도를 결정합니다. 농도 표준물질로 IP six를 여러 단계로 희석하여 로딩하고, 4 mol의 폴리펩타이드 마커를 로딩합니다. 젤 전기영동 후, 젤 전체를 toluidine blue 용액으로 염색 및 탈색하여 초기 pyrophosphate isoform을 시각화합니다.방금 설명한 톨루이딘 염색 절차에 따라, 젤을 스캔하고 IP six와 IP seven 사이의 강도 차이를 비교함으로써 농도를 결정할 수 있습니다. Image J와 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여, IP six kinase one 및 VIP one 효소를 이용한 IP six의 IP seven으로의 조제 효소 전환을 page 분석을 통해 쉽게 해결할 수 있습니다.크기 대조군으로 IP six를 로딩하고 톨루이딘 블루 겔 염색을 수행하면 파이로 인산화 유도체를 식별할 수 있습니다. 초기 물질에 존재하는 인산기의 수에 따라 이동 속도가 더 느리기 때문에, 위에서 설명한 절차를 통해 IP seven을 쉽게 정제할 수 있었습니다. 또한, 정제된 anatol pyrophosphate를 page로 분석하여 IP seven의 순도를 확인하였습니다.흥미롭게도, VIP1의 IP7 생성물인 1,3-피로인산 IP5 이성질체는 IP6 kinase 1에 의해 생성되는 VIP7의 5-피로인산 IP5 이성질체보다 약간 더 느리게 이동합니다. IP6 표준물질을 사용하면 IP7을 사용하기 전에 정제된 IP7의 농도를 쉽게 정량할 수 있습니다. 이후 추가 실험을 통해 그 생물학적 활성을 평가할 수 있습니다.Pyrophosphate IP five를 FIP one 및 IP seven phosphatase DDP one과 함께 통상적으로 배양합니다. 정제된 IP seven은 VIP one에 의해 IP eight로, DDP one에 의해 IP six로 전환됩니다. 이 절차 이후에, IP eight의 분리 또는 다른 인산화된 이소형(isoform) 형태와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 장시간의 tolin in blue 염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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여기에 설명 된 프로토콜은 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트로 이어지는 복잡한 경로의 방법으로 다양한 장애물을 설명하고 요약하다하는 것을 목표로하고있다. 따라서,이 프로토콜은 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 합성과 실제 응용 프로그램의 가용성 모두를 용이하게합니다.

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

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합성 및 크로마토 그래피에 대한 최적의 고정상의 양이 선택의 참여 Iodoaziridines의 정화

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고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

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