총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

이 절차의 전반적인 목표는 반복 가능하고 일관되며 비용 효율적이고 RNA가 없는 방식으로 개별 뇌 핵에서 총 RNA를 수집하는 것입니다. 이것은 먼저 RN이 없는 작업 환경을 준비하고 목이 잘린 쥐에서 전체 뇌를 제거함으로써 수행됩니다. 다음으로, 마이크로미터로 작동되는 조직 다지기를 사용하여 균일한 크기의 연속 조직 절편을 절단합니다.

그런 다음 관심 있는 뇌 영역은 RNA가 없는 매체 환경에서 조직을 유지하면서 설정된 직경의 조직 코어를 사용하여 미세 해부됩니다. 마지막으로, 총 RNA는 절제된 뇌핵에서 분리됩니다. 궁극적으로, 스펙트럼 광도 측정 또는 형광 측정 분석을 통해 다운스트림 CDNA 라이브러리 준비 및 전사체 프로파일링을 위한 충분한 총 RNA 수율 및 품질을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

총 해부학 또는 레이저 캡처 현미경 보조 뇌 영역 절제와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 개별 마우스 뇌에서 반복 가능하고 비용 효율적인 방식으로 여러 개의 개별 뇌 영역을 수집할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 신경 회로가 없는 뇌 영역 내의 뚜렷한 전사체 발현 프로필이 특정 행동 특성, 환경 반응 및/또는 질병 상태와 상관관계가 있는지 여부와 같은 것입니다. 현미해부를 준비하기 위해 Earl's Balanced Salt 용액 또는 EBSS 100ml에 중탄산나트륨 0.44g과 포도당 0.884g을 보충합니다.

오토클레이브 가능한 병 또는 나사 상단이 있는 플라스크에 0.1ml의 DEFC로 EBSS를 최소 12시간 동안 처리합니다. 섭씨 37도에서. 5 인치 및 3/4 인치 유리 피펫을 1 리터 유리 비커에 넣고 강모가 위쪽을 향하게하는 아티스트의 브러시를 100 밀리리터 유리 눈금 실린더에 놓습니다.

피펫과 브러시를 덮을 수 있도록 충분한 DEPC 처리된 수액을 추가합니다. 비커와 눈금이 매겨진 실린더를 알루미늄 호일로 덮고 DEPC, 열, 모든 DEPC 처리 재료를 섭씨 100도 이상의 온도에서 최소 15분 동안 12시간 배양 후 섭씨 37도에서 최소 12시간 동안 배양합니다. 시원하다. 섭씨 4도에서 보관하기 전에 실온에서 EBSS

비커와 눈금이 매겨진 실린더에서 DD H2O를 붓고 재료가 마를 때까지 섭씨 100도 이상에서 계속 배양합니다. 인큐베이터에서 꺼내 실온에서 식힌 다음 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오. 실험 당일에는 모든 작업 표면을 처리하여 RNA 오염 장소를 제거하고 EBSS를 섭씨 40도로 설정된 수조에서 유지하여 완충하고 산소화합니다.

EBSS는 RNA가 없는 목초지 피펫에 가스 튜브를 배치하여 5%CO2와 95%산소로 침투합니다. 그리고 피펫을 EBSS 덮개에 삽입하여 EBSS 용기의 개구부를 덮습니다. 뇌 조직의 연속 절편을 위해 조직 슬라이서를 설정합니다.

조직 슬라이서의 상단 및 하단 표면을 처리합니다. RNA 오염을 제거하려면 직사각형 watman Number 4 여과지 조각을 조직 초퍼의 플렉시글라스 표면에 부착합니다. 양날 면도날을 다지기 암에 부착합니다.

마이크로미터를 0으로 설정하고 면도날이 여과지를 절단할 수 있도록 다지기 암의 최소 높이를 조정하지만 플렉시 유리 플레이트는 절단할 수 없도록 합니다. RNA free 60 x 15mm 세포 배양 접시, tissue cos 200 microl RNA free 마이크로 피펫 팁, 곡선형 가위, 드라이 아이스 및 조직 채취용 튜브를 포함하여 마이크로 해부에 필요한 모든 추가 재료를 수집합니다. 설치류 단두대를 사용하여 쥐의 목을 베고 뒷뇌와 시신경이 손상되지 않은 상태에서 뇌 전체를 제거한 후 드라이아이스에 튜브를 놓습니다.

뇌를 60 x 15mm 크기의 RNA 자유 세포 배양 접시 위에 놓습니다. 그런 다음 조직 샘플링 작업 표면으로 옮깁니다. RNA가 없는 피펫을 사용하여 조직 다지기에 부착된 여과지를 EBSS로 보수적으로 적십니다.

EBSS로 뇌 조직을 적십니다. 뇌를 조직 다지기로 옮기고 복부 표면이 여과지 위에 놓이도록 합니다. 헬리콥터 블레이드에 수직인 정중선과 블레이드에 인접한 뇌의 로스트랄 가장자리.

A-D-E-P-C 처리된 아티스트의 브러시를 사용하여 뇌를 고정한 상태에서 뇌의 등쪽 표면에 부드러운 압력을 가하여 뇌를 고정합니다. 블레이드 홀더 레버를 등 조직 표면에서 약 4-5cm 위로 들어 올리고 이 위치로 유지합니다. 뇌 표면에서 브러시를 제거하고 750 마이크로 미터를 다이얼합니다.

마이크로미터를 사용합니다. 레버를 떨어뜨리면 조직을 자르고 초퍼 블레이드가 고정된 상태에서 750마이크로미터 관상 단면을 만듭니다. 아티스트의 브러시로 롤링 동작을 사용하여 블레이드 표면에서 티슈 부분을 부드럽게 스와이프합니다.

즉시 조직 부분을 페트리 접시의 산소가 공급된 EBSS에 넣습니다. 이 슬라이스는 이제 마이크로 해부할 준비가 되었습니다. 미세 해부를 수행하기 위해 전체 rost codal plane에 걸쳐 연속적인 뇌 절편을 얻을 때까지 슬라이싱 절차를 반복합니다.

먼저 조명을 확인하여 샘플 조명이 방해받지 않는지 확인합니다. O2 CO2 혼합물의 위치와 흐름을 조정하여 조직에 대한 완충된 산소 환경을 유지합니다. 시술 중에 관심 영역을 포함하는 관상 뇌 부분을 식별하고 아티스트의 브러시를 사용하여 페트리 접시 바닥에 평평하게 놓습니다.

적절한 직경의 조직 코어를 선택합니다. 아티스트의 브러시로 관상 조직 부분을 제자리에 잡고 조직 코어의 절단 끝을 조직 섹션 표면 위로 가져옵니다. 압력을 가하는 동안 조직 코어 팁을 조직 섹션을 통해 페트리 접시 바닥에 단단히 누릅니다.

롤링 원형 운동을 사용하여 관심 영역이 주변 조직과 분리되었는지 확인합니다. 아티스트의 브러시를 사용하여 조직 코어를 조직 섹션에서 조심스럽게 들어 올리고 마이크로 펀치를 EBSS에 떠 있게 합니다. 즉시 조직 마이크로 펀치를 드라이 아이스에 보관 된 섭씨 영하 80도의 안정적인 보관 튜브에 넣습니다.

조직은 튜브 측면에 쉽게 부착되어야 합니다. 튜브가 들어있는 마이크로 샘플을 드라이 아이스에 넣습니다. 관심 있는 각 뇌 영역에 대해 이 현저해부를 반복합니다.

현미해부가 완료되면 튜브가 포함된 각 샘플에 대한 해당 라벨 또는 바코드를 기록합니다. 조직 샘플에서 RNA를 추출하기 위해 RNA가 추출될 때까지 조직 샘플을 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣습니다. 먼저 RNA가 없는 작업 공간을 준비합니다.

total RNA isolation kit manual에 설명된 대로 충분한 양의 magnetic bead mix와 lysis binding solution을 만듭니다. 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 조직 샘플을 꺼내 튜브를 드라이아이스에 직접 놓습니다. 100마이크로리터의 용해 결합 용액을 샘플 튜브에 추가합니다.

뉴클레아제가 없는 0.5밀리리터 튜브 크기의 유봉을 펠릿 믹서에 부착하고 저잔류 뉴클레아제가 없는 피펫 팁을 사용하여 조직을 균질화합니다. 균질화된 시료를 동일한 유형의 팁을 사용하여 둥근 바닥 96웰 조직 배양 플레이트의 웰로 즉시 옮깁니다. 60마이크로리터의 100% 이소프로판올을 샘플에 추가합니다.

20 마이크로리터의 비드 혼합물을 샘플에 추가하고 3-4회 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 전체 RNA 분리 키트 프로토콜 단계에 따라 총 RNA 추출을 완료합니다. 마지막으로, 결과 total RNA total RNA의 순도와 농도를 측정합니다.다양한 뇌 영역의 마이크로 펀치에서 얻은 데이터가 이 표에 나와 있습니다.

30마이크로리터의 진화 버퍼가 포함된 RNA 샘플은 RNA 염기서열분석 응용 분야를 위해 상업적으로 이용 가능한 CD NA 준비 제품과 함께 사용할 수 있는 충분한 총 RNA를 제공했습니다. 또한, RNA 수율과 2개의 60 대 2개의 80 비율은 각 뇌 영역에서 얻은 판독값을 보여주기 위해 각 미세해부 샘플에서 얻은 단일 값이며 높은 샘플 순도를 확인합니다. 한 번 마스터하면 이 기술을 제대로 수행하면 8-10분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 RNA가 없거나 dsy로 처리된 재료만 사용하여 작업 표면 또는 조직 샘플의 RNA 오염 위험을 최소화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.