마우스 뇌를 기능적으로나 해부학적으로 다른 영역으로 미세 해부
February 15th, 2021
우리는 마우스 뇌 제거 및 신선한 뇌 조직에서 분리 된 영역의 해부를위한 실습, 단계별, 신속한 프로토콜을 제시합니다. 분자 분석을위한 뇌 영역을 얻는 것은 많은 신경 과학 실험실에서 일상화되었습니다. 이러한 뇌 영역은 시스템 레벨 분석을 위한 고품질 전사체 데이터를 얻기 위해 즉시 동결된다.
뚜렷한 뇌 영역을 연구하는 것은 뇌의 분자 및 구조적 복잡성을 이해하기 위한 디딤돌입니다. 이 프로토콜은 별개의 뇌 영역을 분리하기 위해 마우스 뇌의 체계적인 해부를 설명합니다. 뇌 해부학의 관점에서는 쉽게 재현 할 수있는 하향식 접근 방식입니다.
이 프로토콜의 장점은 두 가지입니다. 첫째,이 접근법은 작지만 중요한 뇌 영역의 분자 토대를 이해할 수있는 기회를 제공합니다. 둘째, 이 전체 해부 공정은 후방 및 분자 분석의 중요한 전제 조건인 분자 무결성의 보존을 보장하기에 충분히 짧습니다.
이 절차에는 연습과 섬세한 취급이 포함됩니다. 타이밍은 구조적 랜드 마크를 유지하는 데 매우 중요하며 적절한 훈련과 연습을 통해 달성 할 수 있습니다. 마우스 뇌 제거 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 연구 화학자이자 생물 정보학자 인 Seid Muhie가 될 것입니다.
마우스 뇌 해부의 절차를 더 시연하는 것은 우리 연구실의 신경 과학자 인 James Meyerhoff가 될 것입니다. 시작하려면 좋은 그립을 위해 피부를 청소하고 제거하십시오. 목이 잘린 머리의 상악골을 지혈제로 고정하고 거즈를 사용하여 두피를 주둥이로 반사시킵니다.
가는 곡선 가위를 구멍 매그넘에 삽입하여 부착된 수막을 분리합니다. 그런 다음 칼날이 수직을 가리키고 척수가 통과하는 두개골 기저부의 입구에 가위를 삽입하지만 기저판 뼈의 내부 표면과 평행하고 누르고 칼날을 왼쪽으로 45도 회전시킨 다음 오른쪽으로 돌립니다. 소뇌를 노출시키기 위해 정수리 내 뼈의 후두골을 제거하십시오.
중간 시상 봉합사를 따라 가위를 브레그마까지 주둥이로 전진시키고 대뇌 피질의 열상을 피하기 위해 위쪽으로 들어 올려 자릅니다. 정수리 뼈가 들어 올려지면 나머지 수막 부착물을 식별하고 절단합니다. 시상면에서 두 개의 평행 절단을하고 뇌 표면이 찢어지지 않도록 정면 뼈의 조각을 제거하십시오.
수막 부착물과 뇌신경을 절단하는 동안 중력이 뇌를 식염수로 미리 채워진 작은 컵으로 제거하는 데 도움이 되도록 두개골을 뒤집습니다. 뇌하수체 해부학을 식별 할 수 있도록 청각 수포를 그대로 유지하십시오. 뇌하수체를 제자리에 고정하고있는 막 텐트의 능선에서 양쪽에 매우 작은 parasaggital 절단을하고 초미세 집게로 뇌하수체의 후엽을 들어 올립니다.
가장 가까운 삼차 신경에서 뇌하수체 전엽의 측면 가장자리 사이에 시상을 자른 다음 뇌하수체 전엽을 들어 올립니다. 백색광의 소스를 조직 위로 향하게하십시오. 미리 냉각 된 스테인레스 스틸 블록에 뇌를 놓고 얼음처럼 차가운 식염수에 얼음으로 둘러싸서 블록을 차갑게 유지하십시오.
구조를 보존하기 위해 얼음처럼 차가운 식염수로 조직을 주기적으로 적 십니다. 대뇌 피질이 위쪽을 향하도록 뇌를 배치하십시오. 작은 곡선 집게를 사용하여 소뇌를 제거하십시오.
등쪽 접근 방식을 사용하여 뇌량 아래에 작은 구부러진 집게의 닫힌 날을 밀어 넣고 부드럽게 펴서 신피질을 양측으로 수축시켜 비판적으로 돌출된 정중선 랜드마크를 보존합니다. 결국 위쪽으로 시신경 교차, 시상 하부, 후각 구근, 수질 oblongata, 뇌하수체 스톡 및 폰틴 다리와 같은 구조가 보입니다. 반구를 분리하십시오.
뇌 복부 부위를 위로 뒤집고 대뇌 반구의 후각 구근 사이의 등쪽에서 시작하여 중간 시상 절단을 만듭니다. 수질을 제거한 다음 두 반구를 부드럽게 분리하십시오. 다음으로, 연못의 내부 가장자리에서 관상 동맥 절단을 만들어 뒷뇌를 얻고 연못의 뒤쪽 가장자리에서 수질을 분리합니다.
두 개의 대뇌 반구를 조심스럽게 분리하기 위해 뇌 조직을 뒤집습니다. 이 단계에서 후각 구근을 제거하십시오. 뇌량의 속보다 1mm 앞쪽으로 관상 동맥을 자르고 액세서리 후각 구근을 제거한 다음 내측 및 외측 전두엽 피질을 분리합니다.
측심실의 전방 뿔 아래 정중선에서 전방 교합의 횡단면을 통해 수평 또는 관상 동맥으로 부분적으로 절단하여 중격 핵을 등쪽으로, 복부 선조체를 복부로 자유롭게합니다. 측면 표면에서 소량의 피질을 제거하여 핵 굴복과 후각 결절을 제거합니다. 외부 캡슐 바로 바깥쪽에서 자른 구부러진 메스를 통해 선조체의 부분을 위에 있는 피질에서 분리합니다.
중격 핵 또는 중격을 확인하고이 섹션에서 분리하십시오. 이 단계에서 시상 하부를 분리하기 위해 곡선 절단을하십시오. 이것은 시상 하부 고랑만큼 측면으로 만 확장되는 유방 몸체의 뒤쪽에있는 부분 관상 절개를 사용하여 수행됩니다.
그런 다음 시상 하부 고랑의 길이를 따라 parasagittal 절단으로 시상 하부 단면을 자유롭게하십시오. 나머지 변연계 구성 요소에서 추가적인 변연계 연결을 드러내기 위해 측심실을 에버트합니다. 내부 피질의 안쪽 부분에서는 심실을 연 후 부채꼴 구조가 관찰됩니다.
내 후각 피질의 부채꼴 구조를 사용하여 해부 목적의 여백을 정의한 다음 편도체, 내 후각 피질, 후방 대상 피질 및 해마를 식별하고 제거합니다. 정중선 피질 평면에서 연장되는 등쪽 표면에있는 선조체 수질의 시각화로 시상의 식별을 확인하십시오. 관상 절개로 중뇌에서 시상을 완전히 분리하십시오.
이 프로토콜은 두개골에서 뇌를 즉시 제거한 다음 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 해부 된 조직은 연구의 요구 사항에 따라 나중에 보존되고 처리 될 수 있습니다. 여러 해부된 조직으로부터 추출된 RNA는 유전자 발현에 대해 분석될 수 있다.
대표적인 결과는 RNA 추출 전 몇 달 동안 섭씨 영하 80도에서 보관 한 수확 된 뇌를 사용하여 얻은 것입니다. 체중 데이터와 함께 뚜렷한 뇌 영역은 PTSD의 사회적 스트레스 모델에 노출 된 연구 공격자에서 수집되었습니다. RNA 농도 및 분광 광도 판독값이 여기에 표시됩니다.
이 프로토콜을 따를 때 뇌를 얼음 강철 블록에 유지하고 주기적으로 얼음 식염수로 조직을 사용하여 조직이 항상 냉각되도록하십시오. 조직이 수집되고 즉시 냉동되면 나중에 전사체학, 대사체학 및 단백질체학과 같은 분석에 사용할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 마우스 뇌의 제거 및 해부를 위한 단계별 실습 프로토콜을 제시하며, 이를 통해 뇌의 별개 영역을 분리합니다. 이 방법은 조직의 분자적 무결성을 보장하여 중요한 뇌 영역의 고품질 전사체 분석을 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 신경과학에서의 분자적 연구를 위해 간단하고 쉽게 재현 가능하도록 설계되었습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 뇌 해부학
- 분자 분석
배경
- 뇌의 분자 및 구조적 복잡성을 이해하는 것은 신경과학의 발전에 필수적입니다.
- 별개의 뇌 영역을 해부하면 표적화된 분자 연구가 가능합니다.
- 해부 중 조직의 무결성을 보존하는 것이 후속 분석에 매우 중요합니다.
- 해부를 올바르게 수행하려면 훈련 및 연습이 필요합니다.
연구 목적
- 마우스 뇌 해부를 위한 효율적인 프로토콜을 제공합니다.
- 작지만 중요한 뇌 영역의 분자 분석을 가능하게 합니다.
- 해부된 뇌 영역에서 얻은 전사체 데이터의 품질을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 이 프로토콜은 두개골에서 마우스 뇌를 체계적으로 제거한 후 특정 영역을 해부하는 과정을 포함합니다.
- 중요한 단계로는 구조물을 보존하고 분자적 무결성을 극대화하기 위한 신중한 절단 및 취급이 포함됩니다.
- 해부된 조직은 RNA 추출을 위해 처리되며 유전자 발현에 대한 분석이 가능합니다.
주요 결과
- 이 프로토콜은 분자 무결성을 유지하면서 마우스 뇌 영역의 신속하고 정확한 해부를 보장합니다.
- 후속 전사체 분석을 위한 RNA 추출을 가능하게 하여 분자 분석을 향상시킵니다.
- 추가 조사에 중요한 뇌 구조물의 식별 및 분리를 용이하게 합니다.
결론
- 이 연구는 분자 신경과학 연구에 중요한 마우스 뇌 해부를 위한 상세한 방법론을 제공합니다.
- 보존된 조직은 뇌 기능에 대한 이해를 심화하기 위한 전사체 연구에 사용할 수 있습니다.
- 신경 메커니즘에 대한 더 나은 이해 및 질병 이해에 대한 잠재적 응용에 대한 함의가 확장됩니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Precise anatomical dissection of mouse brain regions enables targeted molecular analysis critical for neuroscience target validation. This protocol supports phenotypic screening and mechanistic de-risking by isolating functionally relevant structures for downstream assays. Maintaining tissue integrity ensures reliable transcriptomic data for preclinical model development and biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through region-specific gene expression analysis.
- Operational Value: Provides anatomically defined samples for validating target engagement in disease-relevant systems.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular changes to specific brain structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for standardized assay development in neuropharmacology.
- Operational Value: Ensures reproducibility and quantitative outputs essential for screening campaign consistency.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple target classes and compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving region-specific molecular profiles.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions via consistent tissue preparation across studies.
- Translational Biomarker Alignment: Supports identification of region-specific biomarkers correlating with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization by enabling region-resolved molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via anatomically precise tissue isolation.
- Screening: Delivers assay-ready samples with preserved molecular integrity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative RNA expression readouts that facilitate cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through preserved structural and molecular context.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized dissection capability applicable across multiple neuroscience projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in brain region-specific studies.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability for multi-site neuroscience research programs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions through better target validation and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on region-specific molecular data from validated preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and microsurgical techniques for precise landmark identification.
- Dependent on instrumentation including fine curved scissors, forceps, and cooled dissection surfaces.
- Necessitates cross-team standardization of dissection protocols to ensure inter-laboratory reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different mouse strains or developmental stages.
- Limited by tissue degradation risks if dissection timing or temperature control is not maintained per protocol.
