Name: 외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: 배우세요 외상성 뇌 손상 후 쥐 뇌의 해마 뉴런을 레이저 캡처 현미절단으로 분리하여 유전자 발현 분석을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 특정 세포 유형에서 고품질 RNA를 확보하여 정량적 실시간 PCR 및 전체 게놈 마이크로어레이 분석을 가능하게 합니다.

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이 작품은 R01 NS052532 (HLH에), 무디스 재단, 그리고 마취과학과의 지원을 받고 있습니다. 우리는 로리 굵은 글꼴, 그들의 편집 지원 크리스틴 Courteau 집사와 크리스티 페리, 그리고 레이아웃 및 모든 그림, 테이블과 작품의 훌륭한 생산 크리스티 페리 감사드립니다.

1. 수술 절차 및 외상성 뇌 손상 유체 타악기 <ol><li> 모든 동물 실험이 처음 실험실 동물 (8 판, 국립 연구위원회)의 관리 및 이용 텍사스 의료 지점, Galveston, 텍사스와 건강 가이드의 국립 연구소의 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인됩니다. </li><li> 쥐 (업체 찰스 리버스 포틀랜드에서 얻은 성인 남성의 Sprague-Dawley 쥐, 400-500그램, 메인)은 케이지 당 두 자리 잡고 있으며이 일정한 조건 동식물 사육장에 먹이와 물 광고 libitum를 제공합니다 : 빛주기를 (600 시간에 1800 사용 시간), 온도 (21 ° C 23 ° C), 습도 (40 % ~ 50 %) 일주 전에. </li><li> 4퍼센트, isoflurane intubate 및 기계적 환기와 쥐를 마취 (NEMI 과학, 뉴 잉글랜드 의료 기기, Medway, MA)는 산소의 isoflurane 1.5-2.0 %를 쥐 : 공기 (70:30) 및 유체 - 타진 parasagittal 수 있도록 준비 부상으로 이전에 설명했다. 810 </li><li> 실험 설계에 따라 부상 후 적절한 시점에서 쥐를 희생. 신속하게, 머리를 제거 드라이 아이스에 즉시 고정 및 저장 -80에서 50 ML 관 ° C 또는 냉동 sectioning에 대한 10월에 포함 할 바로 ​​진행합니다. </li></ol> 2. Sectioning와 쥐의 뇌의 착색 <ol><li> 일정한 온도에서 보관하는 경우 즉시 사용하지 않는 뇌 조직은 한 달에 최대 -80 ° C에서 보관 할 수 있습니다. -80에서 고정되어 두뇌는 ° 후 sectioning에 -20 ° C에 해동 C, 그리고 다시 냉동 두 번째 해동 후 품질 RNA를 얻을하지 않습니다. 뇌가 해동 10월에 장착하고 sectioned되면, 슬라이드는 24 시간 이내에 물들과 착색 한 시간에 30 분 이내에 LCM에 사용되어야합니다. 이 양질의 RNA를 보장합니다. LCM 후, LCM 캡에서 캡처 한 세포가 일주일에 -80 ° C에서 용해 버퍼에 저장 될 수 있지만, RNA는 최고 품질을 보장​​하기 위해 적시에 격리해야합니다. &lt;이/ 리&gt; <li> 전에 뇌를 sectioning에, RNase-해치와 그라 이오 스탯를 흔들고 ETOH (각 뇌 사이의 일회용 블레이드를 교체)와 브러쉬를 청소. </li><li> -80 ° C 냉장고에서 50 ML 튜브의 뇌를 검색, -22 ° C 약 10 분에 관 해동의 온도에 그라 이오 스탯에 넣습니다. 거즈에 무대로 튜브와 장소, 최대 복부 측면에서 뇌를 제거합니다. </li><li> 면도날 사용하여 광 chiasm의 소뇌와 앞 부분에 불과 뱃 부리 장식이있는 뇌의 뒤쪽 부분을 제거하는 뇌를 갈라. 10월 장착 매체 (조직 테크)와 cryomold을 입력하고 앞 측면으로 금형에 뇌를 넣으십시오. 가 (약 10 분) 화이트집니다 때까지 뇌 세포가 장착 매체에 고정 할 수 있습니다. </li><li> 10월과 뇌에 표본 디스크 (조직 테크)를 고정. 금형의 뇌를 제거합니다. 표본 머리에 뇌를 삽입하고 나사를 조입니다. </li><li> disposa를 삽입경, 낮은 프로파일 칼 홀더에 블레이드 (피셔 과학)과 레버를 조입니다. </li><li> 10월의 외부 층을 제거하는 20 μm의 뇌를 부러 뜨리 시작합니다. hippocampal 지역에 도달하면 10 미크론 다이얼​​을 설정합니다. 조직 섹션 (피셔 과학)에 유리 슬라이드 나 플러스 유리 슬라이드를 삽입하여 코로나 시리얼 부분을 수집합니다. sectioning가 완료 될 때까지 슬라이드는 RNase 무료 염색의 랙에 -20 ° C에서 보존되어 있습니다. </li><li> 조직 섹션 처리 유리에서 모든 RNases를 제​​거하려면, 모든 착색 용기를 닦아하고 Eliminase (피셔 과학)와 실린더를 졸업하고 밀리 Q 물에 씻어. RNase 무료 물과 모든 솔루션을 준비하고 cresyl 보라색 (시그마 - 알드리치)과 플루오로 - 파란 (조직을 화학)를 사용하기 전에 필터를 0.2 μm로 얼룩을 필터링합니다. </li><li> 30 초에 RT에서 뇌 부분을 해동하고 75% ETOH (1 분)에 수정 프로그램입니다. </li><li> 고정 후 단일 부상 뉴런의 LCM를 들어, RNase없는 물 (1 분)에 슬라이드를 헹굼, 1 % cresyl 보라색 (15-20 초)로 counterstain, RNase 무료 물 (2 × 30 초)에 헹구고, 플루오로 - 샤오 뤼 (4 분)와 얼룩, RNase없는 물 (3 × 1 분)에 헹굼 RNase 무료 물 (30 초), 100 % ETOH (30 초) 및 크실렌 (2 × 3 분)로 만든 95 % ETOH과 탈수. </li><li> 고정 후 뉴런의 swaths의 LCM를 들어, RNase 무료 물 (1 분)에 슬라이드를 씻어, 1 % cresyl 보라색 (1 분)와 얼룩, (3 × 1 분)에 대한 RNase 무료 물에 헹구고, 95 %의 탈수 ETOH (2 × 30 초), 100 % ETOH (2 × 30 초) 및 크실렌 (2 × 3 분). </li><li> 공기는 LCM하기 전에 15 분을위한 연기 후드의 모든 부분을 건조. 사람들이 방에서 방으로 이동해야 할 경우 슬라이드는 dessicant 늘어서 슬라이드 상자에, 위로, 섹션면에게 저장할 수 있습니다. 섹션 건조 후 LCM 즉시 수행되는 경우에는 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. LCM은 30 분에서 1 시간으로 제한해야합니다. 다음 섹션에서, 우리는 EA이다 세포의 지속적인 swaths을 캡처하는 방법 첫번째 설명siest이 기술을 배우는 사람들을 위해 습득합니다. 그럼 우리가 정확하게 하나의 뉴런을 캡처하는 방법에 대해 설명합니다. 우리의 절차에서 우리는 degenerating의 뉴런의 플루오로 - 제이드 - 마커 대한 친화력에 의해 죽어 뉴런을 식별합니다. 플루오로 - 제이드 - 부정적인 세포는 뉴런을 생존 할 수 추정하고 있습니다. </li></ol> 3. 레이저 캡처 Microdissection (LCM) hippocampal 뉴런의 풍부한 인구의 swaths의 LCM <ol><li> LCM은 적외선 다이오드 레이저 (생명 기술)와 PixCell 거짓말 현미경을 사용하여 수행됩니다. </li><li> 수직 위치로 중심 조이스틱을 조정합니다. 회전 및 위치에 4​​X 목표를 잠그십시오. </li><li> 현미경 단계의 중심에서 슬라이드를 놓고 해마의 영역보기에 될 때까지 수동으로 조정할 수 있습니다. 초점 이미지를 가지고 조립 및 고급 초점 조정을 사용합니다. </li><li> 컨트롤러의 진공 버튼을 눌러 진공 척을 활성화합니다. PL에 10X 목표를 회전 잠금에이스. 굵고 정밀한 조정하여 다시 초점을 맞 춥니 다. </li><li> CapSure 카세트 모듈과 위치 부하 선 위치에서 모자에 CapSure 매크로 LCM 캡 (생명 기술)로드합니다. 캡 주변의 모자 배치 팔과 위치를 회전합니다. 카세트 모듈에서 CapSure 캡을 제거하는 모자 배치 팔을 올립니다. </li><li> 슬라이드 위에 모자 배치 팔을 회전하여 슬라이드 위에 팔을 아래로 내려 가서,이 슬라이드에 뚜껑을 게재합니다. 미세 초점을 조정하고 세포가 뚜껑에 검은 색 원 안에 있는지 확인하기 위해 조이스틱을 이동합니다. 모든 세포 캡처이 검은 색 원 안에 있어야합니다. </li><li> 레이저 매개 변수를 설정합니다. 먼저, 컨트롤러의 레이저 사용하도록 설정 버튼을 누르십시오. 레이저 목표 지점은 컴퓨터 모니터에서보기 분야의 분홍색 점으로 표시됩니다. </li><li> 75 MW, 1.0-2.0 밀리 초에 대한 최적의 셀 캡처 필요에 따라 - 레이저 초점을 맞출 65의 전원과 기간을 조정 작은에 레이저 스폿 사이즈를 (7.5 μm)로 설정합니다. </li><li> 테에레이저 ST, 픽업 할 셀이없는 곳 지역으로 레이저 자리를 이동하려면 조이스틱을 사용합니다. 엄지 손가락 스위치를 사용하여 레이저를 발사 해요. 보이는 어두운 반지 레이저가 발사 된 명확한 지역을 둘러싸고 있는지 거리에 녹은 폴리머 지점에서 레이저 자리를 이동하고 확인하기 위해 조이스틱을 사용합니다. </li><li> 세포를 캡처하려면 캡처 세포의 영역 위에 레이저 자리를 이동하려면 조이스틱을 사용합니다. 엄지 손가락 스위치를 사용하여 레이저를 발사 해요. 세포의 넓은 지역을 캡처 레이저를 발사하면서 조이스틱을 이동합니다. 레이저가 발사 될 때 그 대상 세포의 표면에 캡에있는 열가소성 폴리머 필름을 녹아. 폴리머 따라서 미래의 분자 응용 프로그램 샘플의 무결성을 보장 RNA, DNA 나 단백질을 변경하지, 레이저 방사선을 흡수. </li><li> 관심의 모든 세포를 발사 한 후 캡 배치 팔을 들어 올린다. 캡처 세포는 조직 섹션에서 분리하고 CapSure 캡을 준수합니다. 나머지 조직과 누락 된 셀이 마주됩니다뷰의 분야에서 였죠. 캡에있는​​ 세포는 또한 슬라이드의 빈 부분에있는 뚜껑을 배치하여 볼 수 있습니다. </li><li> 모자 배치 팔을 들어 캡틴 역을 언로드하는 데 회전 할 수 있습니다. 역에 캡을 절감하고 이전 위치로 다시 모자 배치 팔을 회전 할 수 있습니다. </li><li> 플랫폼을 따라 캡 위에 CapSure 삽입 도구를 밀어 넣습니다. 플랫폼에서 도구를 들어. 캡 부착 된 상태로 유지됩니다. 살짝 원치 않는 조직을 멀리 세척 할 수있는 CapSure 깨끗한 패드에 뚜껑을 터치합니다. </li><li> RNAqueous 마이크로 절연 키트에서 얻은 용해 버퍼 100 μl로 가득 0.5 ML RNase 무료 튜브에 뚜껑을 놓으십시오. 세포를 lyse하는 데 30 초 동안 즉시 소용돌이 캡. 42에서 샘플을 배양 ° -80시 30 분, 동결에 대한 C ° C RNA 격리까지. </li></ol> 해마의 단일 FJ + 뉴런의 LCM <ol start="15"><li> 하나의 세포를 캡처하려면, CapSure 카세트 모듈과 positi에 CapSure HS LCM 캡을로드로드 라인 위치에서 캡 있습니다. 모자 배치 팔을 회전 캡 주위 위치. 카세트 모듈에서 CapSure 캡을 제거하는 모자 배치 팔을 올립니다. </li><li> 레이저 초점을 맞출 및 단일 세포의 최적의 세포 캡처에 대한 0.45-0.50 밀리 초에 65 -75 MW에 레이저 파워와 기간을 조정 작은에 레이저 스폿 크기 (7.5 μm)을 설정합니다. </li><li> 슬라이드 위에 모자 배치 팔을 회전하여 슬라이드를 향해 팔을 내려. 이 슬라이드에 뚜껑을 게재합니다. Capsure HS 캡 표면은 LCM 동안 샘플 상승에 자리 잡고 있습니다. </li><li> 하나의 FJ + 세포를 통해 레이저를 이동하려면 조이스틱을 사용합니다. 캡처되는 모든 세포는 캡에 작은 검은 색 링 내에 존재해야합니다. 엄지 손가락 스위치를 사용하여 레이저를 발사 해요. </li><li> 검은 색 원 지역 내의 모든 세포를 레이저로 발사 된 경우, 모자 배치 팔을 들어 올린다. 캡처 세포는 조직 섹션에서 분리하고 CapSure HS 캡을 준수합니다. </li><li> 마이크로의 다른 슬라이드를 삽입합니다단계를 극복하고 HS 캡이 가득 될 때까지 FJ + 세포를 수집합니다. 용해 버퍼의 40-50 μl로 가득 0.5 ML RNase 무료 관에 뚜껑을 놓으십시오. 세포를 lyse하는 데 30 초 동안 즉시 소용돌이 캡. 42에서 샘플을 배양 ° -80시 30 분, 동결에 대한 C ° C RNA 격리까지. </li></ol> 4. LCM 샘플에서 총 RNA 절연가 (이 섹션은 단지 비디오 프리젠 테이션에 설명 될 것이다) <ol><li> 세포의 총 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 RNAqueous - 마이크로 키트 (Ambion)를 사용하여 절연되어 있습니다. 모든 시약 및 세탁 솔루션이 키트에 제공됩니다. 필터에 용해 용액 버퍼 30 μl를 추가하여 사전 젖은 마이크로 필터 카트리지 어셈블리. 5 분 후, 10,000 × g에서 30 초 동안 필터를 원심 분리기. </li><li> 샘플 lysate에 LCM 첨가제의 3 μl를 추가 피펫은 혼합하고 원심 분리기합니다. </li><li> 샘플 lysate 100 % ETOH (1 / 2 볼륨)의 52 μl를 추가, 피펫은 혼합하고, 필터에 lysate를 전송하는열. </li><li> 열에 RNA를 바인딩하기 위해 1 분에 10,000 × g에서 필터 열을 원심 분리기. 한 샘플에 대해 여러 개의 모자가있는 경우, 별도로 동일한 열을 통해 각 lysate를 돌리다. </li><li> RNAqueous 마이크로 키트에 설명 된대로 RNA 격리 절차를 완료합니다. </li><li> DNase 처리 등 키트에 설명 된 LCM RNA 샘플의 DNase의 불 활성화를 수행 -80에서 RNase 무료 튜브 및 매장 ° C.로 RNA를 전송 </li></ol> 5. RNA의 정량화 및 다운 스트림 응용 RNA 품질과 정량화의 평가는 애질런트 Bioanalyzer는 제조업체의 프로토콜에 따라 피코 키트 (애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA)에서 시약을 사용하여 수행됩니다. <ol><li> 총 RNA는 애질런트 Bioanalyzer 2100 (애질런트 테크놀로지스)에서 분석합니다. 이 소프트웨어는 각각의 샘플까지 F에 RNA 무결성 번호 (린)를 지정하여 농도와 RNA 샘플의 무결성을 평가ROM 1-10. 1-5 저하 RNA를 나타냅니다과 7-10은​​ 좋은 품질의 RNA를 나타냅니다. </li><li> Sybr - 녹색 화학을 사용하여 개별 Taqman의 assays 또는 RT2 프로파일 러 배열, 비 저하 그대로 RNA는 리얼 타임 PCR에 사용됩니다. RNA는 mRNA의 microarray 분석 및 microRNA의 microarray 분석에 사용할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 사람들이 관심 충돌이 없다는 점 선언합니다.

이 LCM 기술은 외상성 뇌 손상의 분자 메커니즘을 이해하는 중요한 발전을 할 수있게되었습니다. 8,10,11,12,13 우리는 쥐 해마의 독특한 하위 지역은 유전자 발현 프로파일을 가지고 있다는 것을 입증하는이 기술을 활용하는 최초의 조사로 말입니다 부상의 선택적 보안 취약점과 상관 관계. 우리의 연구는 우리가 아니라 몇 십 등의 레이저 캡처 세포에서 qPCR에 의해 유전자 발현을 수량화하고 600 촬영 셀처럼 몇의 게놈 전체의 microarray 분석을 수행 할 수 있다는 수 있다는 보여 주었다. LCM은 다양한 신경과 neuropsychiatric 장애에 연루 것으로 알려져있는 다른 뇌 영역의 유사한 연구에 귀중한 도구가 될 것입니다. 예를 들어, LCM을 사용하여 연구들에 연루 보상 회로에 관여하는 핵 accumbens의 게놈 전체의 프로파일 연구를 substantia nigra, 14 도파민 뉴런에서 파킨슨 병의 pathogenesis에 빛을 버리고 왔으며ubstance 남용 장애. 15 Neuronal 이질성은 게놈 수준 16에서 반영되어 있으며 임상 실험에서 외상성 뇌 손상에 대한 실험 치료의 성공의 부족에 참여할 수 있습니다. 따라서, 우리의 목표는 외상성 뇌 손상 후 neuronal 생존에 영향을 미치는 중요한 요소를 조사하기 위해이 기술을 활용하는 것입니다. 죽음과 인접 외상성 뇌 손상 후 hippocampal 뉴런을 생존의 최근 게놈 전체의 프로파일 연구는 세포 죽음의 유전자에 세포 생존의 표현 수준의 비율을 반영하는 휴대 가감 저항기는 외상성 뇌 손상 후 세포의 운명을 조절하는 것이 좋습니다. 이러한 지속적인 연구 적극적으로 세포 생존 가감 저항기에 영향을 미칠 수 pharmacotherapeutic 전략의 설계 및 개발에 기여하는 것입니다. 또한, 현재 외상성 뇌 손상 후 hippocampal 뉴런의 잠재적 인 치료 약물 치료의 효과를 추적하고 모니터링 할 수 LCM 사용합니다. 따라서, 우리의 연구는 주어진주의 RNase 무료 처리 기술과 일부를 보여기존 프로토콜의 수정, 그건 정확한 정량 유전자 발현 분석을위한 LCM에서 고품질의 RNA 샘플을 얻을 수 있습니다. 그러나 LCM 기술과 관련된 몇 가지 함정이 있습니다. 예를 들어, microglia 오염없이 만 neuronal 세포를 수집하는 것은 거의 불가능 할 수 있습니다. 해마의 피라미드 세포 레이어에는, 세포의 95 %가 glial 및 다른 세포 유형의 작은 비율을 남겨두고 피라미드 세포와 10 %의 interneurons 될이 인구의 90 %를 뉴런. 8,17 것으로 추산되었습니다 우리의 연구에서 18 우리는 플루오로 - 비취 특히 뇌 조직 만 부상 뉴런에 이름표를 형광 염료를 사용합니다. GFAP에 대한 표시입니다 다른 얼룩이 microglia를 착색 할 필요가 것입니다. 만 플루오로 - 비취 스테인드 하나 neuronal 몸을 수집 19 뉴런의보다 동질적인 인구를 보장합니다. 문제 해결 필요할 수 있습니다 또 다른 일반적인 문제는 원이 더 있다는 것입니다 없음레이저가 발사 될 때 t는 정의. 이 문제가 발생하면 레이저 설정을 확인하고 필요에 따라 힘과 시간을 조정할 필요가 있습니다. 또한 캡이 조직에 평면 배치하고 팔에 제대로 장착되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. LCM 기술 설명서를 참조하거나 기술 지원을 호출하는 것은 때때로 필요합니다. LCM 및 RNA 격리 후, RNA의 품질은 항상 이전의 유전자 발현 분석에 bioanalyzer을 사용하여 평가해야한다. 레이저 절단 (생명 기술, Leica 마이크로 시스템즈) 및 (Zeiss) 악기를 catapulting 레이저를 포함한 현재 시장에서 레이저 캡처 장비의 여러 종류가 있습니다. 우리 LCM 시스템은 세포의 작은 숫자를 캡처에 적합합니다. 기타 높은 처리량 및 더 많은 자동화 된 시스템은 게놈 특히 proteomic 분석을위한 세포의 큰 숫자를 얻기위한 더 적당 할 수 있습니다. 사실, 이러한 자동화 된 시스템을 사용하여 LCM은 PR의 분석을위한 큰 잠재력을 가지고식별 셀 또는 셀의 풍부한 인구의 otein 표현. 20 또한, LCM은 우리가 가장 이질적인 조직의 복잡성에 관계없이 정의 된 셀 유형의 유전자 발현을 조사 할 수 있도록 immunolabeled 세포, 21 유전자 발현 분석을 용이하게 할 수 있습니다. 따라서, LCM은 세포의 단일 또는 풍부한 인구의 첨단 분자 연구를위한 훌륭한 도구입니다.

이종 조직의 유전자 발현 분석은 항상 문제가되었습니다,.이 약 5,000 다른 세포 유형을 가진 포유류의 뇌에 특히 사실이다 전에 레이저 캡처 microdissection (LCM) 기술, 외상성 뇌 손상의 효과 게놈 연구의 발전 4 생체에서 다른 neuronal 세포 유형의뿐만 아니라 glial 및 immunomodulatory 세포를 지원뿐만 아니라 구성 뇌 세포의 혼합 인구의 유전자 발현 분석을 기반으로했다. 그 결과 복잡한 유전자 발현 프로파일이 이기종 조직에서 얻은, 그리고 부상을 유발 세포 신호의 자주 충돌 패턴은 외상성 뇌 손상 5.의 사전 임상 연구에서 효과가 입증 된 치료 전략의 인간 임상 실험에 실패에 대해 하나의 설명이 될 수 있습니다 쥐 엉덩이에서 뉴런의 위험에 노출 된 인구에 부상을 유발 유전자 표현의 명확한 이해를 구하려면pocampus, 우리가 처음 Emmert - 벅 외에 의해보고 LCM의 기술,. 3 그 후, 우리는 정량 실시간 PCR과 microarray 분석을 사용하여 뉴런과 mRNA 프로파일위한 단일 뉴런의 풍부한 인구를 효율적으로 캡처이 microdissection 기술을 수정 및 최적화를 채택 . 게놈 분석을위한 뇌 조직의 냉동 섹션에서 mRNA의 무결성을 유지하기 위해, 우리는 고정, 염색 및 냉동 쥐 뇌 섹션에서 뉴런의 빠른 캡쳐를위한 기존의 프로토콜을 수정했습니다. 식별 및 부상자와 죽어 hippocampal 뉴런의 격리를 들어, 우리는 또한 LCM에 대한 플루오로 - 제이드의 착색 기술을 최적화. 플루오로 - 샤오 뤼는 apoptotic 및 괴사 세포 죽음을 구분하지 않습니다. 따라서, degenerating의 뉴런의 모든 종류의이 얼룩. 6,7에 의해 감지 할 수 있습니다 여기, 우리는 하나의 죽어 또는 생존 뉴런의 수영장뿐만 아니라 강화 populati의 swaths를 얻기 위해 우리 실험실에서 사용되는 프로토콜을 설명서로 다른 neuronal 세포 유형 (외상성 뇌 손상 후 유전자 발현 분석을위한 예 CA1-CA3 뉴런)의 기능. 저희 연구실에서 수행 유체 타악 뇌 손상에 대한 절차는 Shimamura 외., 8에 자세히 설명하고 앨더 외에 의해 목성에 출판 된 마우스의 측위 유체 - 타진 부상 프로토콜과 매우 유사 수 있습니다. 9 LCM 기술이 있기 때문에 DNA의 무결성에 최소한의 또는 전혀 효과가 표시되어, RNA와 조직에 단백질,이 정의 세포 유형의 분자와 단백질 분석을위한 훌륭한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>PixCell IIe 레이저 캡처</td><td>현미경 Life Technologies (Arcturus)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>플루오로-제이드</td><td>히스토-켐 Inc.</td><td></td><td></td>#1FJ</tr><tr><td>크레실 바이올렛 아세테이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>크실렌(조직학적 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 200 증거(조직학적 등급)</td><td>UTMB 약국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase free barrier 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus 레이저 캡처 미세해부 시스템 (Life Technologies)</a> <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss 레이저 미미해부 PALM 제품군 </a> <a href="http:// www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20DM6000%20B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td></tr></tbody></table>

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 microdissection

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

외상성 뇌 손상 후 장기인지 장애는 학습, 메모리 및 집행 기능에 대한 중요 중간 측두엽에있는 해마 - 지역의 부상을 유발 neurodegeneration와 연결되어 있습니다. 1,2 따라서 우리의 연구는 특정 neuronal의 유전자 발현 분석에 초점을 해마의 독특한 하위 지역의 인구. Emmert - 벅에 의해 1996 년에 도입 된 레이저 캡처 microdissection (LCM)의 기술, 외., 3 단일 세포의 유전자 발현 분석에 상당한 발전을 위해 허용 드높여 왔습니다 등이 포함 된 포유류의 뇌와 같은 이기종 조직에서 세포의 인구 기능 세포 유형의 수천 4. 우리는 LCM 및 외상성 뇌 손상의 pathogenesis을 기초 분자 메커니즘을 조사 할 외상성 뇌 손상의 잘 설립 쥐 모델을 (외상성 뇌 손상)을 사용합니다. 유체 - 타진 외상성 뇌 손상 후, 뇌는 즉시 드라이 아이스에 냉동, 미리 정해진 시간 이후 부상에서 제거됩니다와 그라 이오 스탯에 sectioning 준비. 쥐 두뇌은 즉시 10월과 sectioned에 포함하거나, -80에서 몇 개월 저장할 수 있습니다 ° C 레이저 캡처 microdissection에 대한 sectioning 전에. 또한, 우리는 circadian 리듬에 외상성 뇌 손상의 효과를 연구 할 LCM 사용합니다. 이를 위해, 우리는 포유류의 뇌의 마스터 클럭을 포함 suprachiasmatic 핵의 뉴런를 캡처합니다. 여기, 우리는 실시간 PCR 및 / 단일 식별 뉴런 (부상 및 degenerating, 플루오로 - 제이드 - 긍정적, 또는 손상되지 않은, 플루오로 - 제이드 - 제외) 및 후속 유전자 발현 분석을위한 hippocampal 뉴런의 풍부한 인구를 확보 할 수 LCM의 사용을 보여줍니다 또는 전체 - 게놈 microarrays. 이러한 LCM 가능 연구는 쥐 해마의 해부학 고유 한 영역의 선택적 취약성이 뚜렷한 지역에서 LCM 얻은 뉴런의 다른 인구의 서로 다른 유전자 발현 프로파일에 반영하는 공개했다. 우리의 단일 셀 연구, 어디에서 결과우리는 죽음과 인접 hippocampal 뉴런을 생존의 전사 프로파일을 비교 외상성 뇌 손상 후 세포 죽음과 생존을 조절 세포 생존 가감 저항기의 존재를 권장합니다.

첫 번째 LCM 연구에서, 우리는 외상성 뇌 손상 8. 그림 1A-1C에 자신의 취약점을 반영 유전자 발현 프로파일을 가지고있는 쥐의 해마의 기능 별개의 하위 지역을 (CA1과 CA3) 표시 할 수있었습니다은 (hippocampal 피라미드 뉴런의 레이저 캡처를 보여줍니다 CA1- CA3), 이전, 그리고 LCM 후 이가있는 이랑의 뉴런과 SCN의 뉴런. 피라미드, 과립 또는 각각 SCN의 뉴런의 클린 캡처, 매크로 뚜껑에 표시됩니다. 그림 2A-2B는 설명 플루오로 - 제이드 양의 피라미드 뉴런, 죽음과 LCM 이전과 이후, 플루오로 - 파란 부정적인 피라미드 뉴런을 생존. 죽어 나 뉴런을 생존의 깨끗한 캡처 LCM 캡에 캡처 된 세포를 확인하여 표시됩니다. LCM 후, 총 RNA는 TaqMan 또는 SYBR 녹색 화학 (그림 3A), 작은 focu를 사용하여 유전자 발현의 정량 실시간 PCR 분석을 포함한 분자 연구의 다양한 배열에 사용할 수 있습니다SYBR 녹색 프로브 (그림 3B) 또는 전체 게놈 microarray 연구 (그림 3C)와 PCR 배열을 SED. <img alt="그림 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> 1 그림. 쥐의 뇌에서 정의 된 세포 인구의 swaths의 레이저 캡처 microdissection은. 쥐의 뇌의 냉동 10 μm 코로나 섹션은 에탄올에 고정 nissl 얼룩 (cresyl 보라색)으로 물들과 LCM 준비되어 있습니다. 표시는 쥐 해마와 suprachiasmatic 핵의 사진 hippocampal 이가있는 이랑의 쥐 해마의 CA1-CA3 subfields에서 LCM과 매크로 캡의 시각화로 캡처 세포. A. 피라미드 뉴런 전후. B.의 과립 세포입니다. C. 정무 suprachiasmatic의 핵이 세 번째 뇌실의 양쪽에있는그리고 광 chiasma 위에 위치하고 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> 그림 2. 쥐 해마에서 하나의 뉴런의 레이저 캡처 microdissection. 표시는 CA3 뉴런 이전과 LCM 후 A. Degenerating, 플루오로 - 제이드 - 긍정적 (스테인드) hippocampal 뉴런 CA3와 B. 생존, 플루오로 - 제이드 - 제외 어 (흠없는)입니다. 캡처 된 셀 시각화 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot;/&gt; 그림 3. 총 RNA의 유전자 발현 분석은 레이저 캡처 뉴런으로부터 격리. SCN의 circadian 시계 유전자의 표현 A. 수량 실시간 PCR 데이터입니다. 초점을 맞춘 PCR 배열을 사용하여 apoptosis 관련 유전자의 표현을 보여주는 hippocampal 뉴런을 죽음과 생존의 유전자 표현의 B. 히트 . C. 애질런트 외상성 뇌 손상이나 외상성 뇌 손상 사기 상처를받은 쥐뿐만 아니라 뇌 손상 (neuronal 질소 산화물에 의해 유도 유전자의 최저 표현으로 설계된 재조합 adeno - 관련 siRNA 바이러스에서 hippocampal CA1-CA3 뉴런의 유전자 표현의 전체 - 게놈 microarray 분석 synthase와 글루타티온 퍼 옥시 데이즈-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

우리는 정량 실시간 PCR 및 / 또는 전체를 게놈 microarrays를 사용하여 후속 유전자 발현 분석을위한 부상을 쥐의 뇌의 냉동 섹션에서 hippocampal 뉴런 또는 단일 뉴런의 풍부한 인구를 얻기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

이 절차의 전반적인 목표는 후속 유전자 발현 분석을 위해 레이저 캡처 미세해부를 통해 동결 조직 절편에서 해마 뉴런과 단일 뉴런의 풍부한 집단을 얻는 방법을 입증하는 것입니다. 이것은 먼저 마취실에서 쥐를 마취함으로써 이루어집니다. 그런 다음 쥐를 삽관하고 기계적으로 인공호흡을 한 다음 정위 헤드 홀더에 넣어 쥐를 준비시킵니다.유체 타악기 뇌 손상에 대해 개두술을 수행합니다.두 번째 단계는 유체 타악기 뇌 손상을 관리하는 것입니다. 다음으로 뇌의 관상 절편을 저온 유지 장치에서 절단하고 퇴화 뉴런의 표지자인 플루로 보조제(fluro aid)나 미사일 염색인 리얼 바이올렛(real violet)으로 염색합니다. 마지막 단계는 레이저 캡처 미세 해부를 수행하고 단일 뉴런 또는 뉴런 풀을 수집하는 것입니다.최종적으로, 총 RNA는 포획된 세포에서 분리되고, 애질런트 바이오분석기를 사용하여 품질을 분석하고, 정량화되며, 정량적 real-time PCR 및 경로 집중 또는 게놈 와이드 마이크로어레이 분석과 같은 다운스트림 애플리케이션에 사용됩니다. 수동 미세 해부와 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 신경교세포나 면역조절세포와 같은 다른 뇌세포 유형이나 조직 절편에서 단일 뉴런의 풍부한 집단을 얻을 수 있다는 것입니다. 이를 통해 뇌 및 여러 세포 유형으로 구성된 다른 이종 조직에서 식별된 고유한 세포 유형에서 유전자 발현 분석을 수행할 수 있으며, 이 절차를 놓칠 수 있음을 입증할 수 있습니다.Debbie Boone, 우리 연구실 선임연구원. 먼저 유체 충격, 외상성 뇌 손상 또는 가짜 손상을 입은 쥐에서 얻은 뇌 조직을 영하 80도의 냉동고에서 회수하여 영하 22도의 냉동고로 옮깁니다. 뇌가 해동되는 동안 뇌를 단면 온도로 만들기 위해 10분 동안 저온 유지 장치를 사용합니다.에탄올이 함유된 RNA 잽으로 저온 유지 장치를 닦고 에탄올로 브러시를 청소합니다. 10분이 경과한 후 튜브에서 뇌를 제거하고 배쪽이 위로 향하게 하여 저온 유지 장치의 거즈 조각에 놓고 새 면도날을 사용하여 뇌를 잘라 뇌의 뒤쪽 부분을 제거합니다. 소뇌와 시신경 chiasm의 앞쪽 부분으로 쭉 뻗어 있습니다.극저온 주형에 OCT 장착 매체를 채우고 앞쪽이 아래로 향하게 하여 뇌를 주형에 넣습니다. 뇌 조직이 하얗게 변할 때까지 장착 매체에서 얼도록 합니다. 이 작업은 약 10분 정도 소요됩니다.이제 OCT로 표본 디스크를 뇌에 동결합니다. 그런 다음 곰팡이를 제거하십시오. 브레인이 부착된 디스크를 시편 헤드에 삽입하고 나사를 조입니다.일회용 로우 프로를 삽입file 칼날을 칼 홀더에 넣고 레버를 아래로 조입니다. OCT의 바깥층을 제거하기 위해 20미크론으로 뇌를 자르기 시작합니다. 해마 영역에 도달하면 미크론 다이얼을 10으로 설정합니다.유리 슬라이드 또는 플러스 유리를 배치하여 관상 연속 절편을 수집합니다. 조직 섹션으로 밉니다. 절편화가 완료될 때까지 섭씨 영하 20도의 RNA 자유 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다.섹션을 염색하기 전에 모든 염색 용기와 눈금이 매겨진 실린더를 ese로 닦고 milli Q 물로 헹굽니다. 모든 용액이 RNA 자유수로 준비되었는지, 크레탈 바이올렛 및 플루오로 옥 얼룩이 이전에 0.2 미크론 필터를 통과했는지 확인하십시오. 토르 뇌 절편을 실온에서 30초 동안 사용하고 75% 에탄올을 1분 동안 고정합니다.그런 다음 고정 후 뉴런 띠의 LCM에 대한 적절한 카운터 염색 또는 뉴런 띠의 LCM에 대한 개별 뉴런으로 진행하고, RNA 자유수에 슬라이드를 헹구어 1분 동안 1% 크레스트 바이올렛으로 염색합니다. RNA로 헹구고, 자유수, 각 1분씩 3회, 95% 에탄올로 2회, 각각 30초씩 탈수합니다. 그런 다음 100% 에탄올을 30초 동안 두 번, 자일렌을 3분 동안 두 번 두 번 사용합니다.염색 후 흄 후드의 모든 섹션을 15분 동안 건조시킨 다음 LCM으로 진행합니다. LCM이 수행됩니다. 적외선 다이오드 레이저가 있는 P 셀 2 E 현미경을 사용하여 먼저 중앙 조이스틱을 수직 위치로 조정합니다.그런 다음 Forex 목표를 회전하여 제자리에 고정합니다. 현미경 중앙에 염색된 해마 단면이 있는 슬라이드를 놓습니다.tage 그리고 해마 영역이 보일 때까지 수동으로 조정합니다. 코스를 사용하여 초점 조정을 찾으십시오.단면에 초점을 맞추려면 컨트롤러의 진공 버튼을 눌러 진공 척을 활성화하십시오. 그런 다음 10 x 대물렌즈를 회전하여 제자리에 고정합니다. 코스와 미세 조정으로 다시 초점을 맞춥니다.매크로 LCM 캡의 캡을 캡, 카세트 모듈에 로드하고 로드 라인 위치에 캡을 배치합니다. 캡 배치 암을 회전하고 캡 주위를 위치시킵니다. 그런 다음 캡 배치 암을 들어 올려 카세트 모듈에서 캡 캡을 제거합니다.캡 배치 암을 슬라이드 위로 회전한 다음 슬라이드 위로 내려 캡을 슬라이드에 놓습니다. 미세 초점을 조정하고 조이스틱을 움직여 캡의 검은색 원 안에 셀이 있는지 확인합니다. 캡처할 모든 셀은 이 검은색 원 안에 있어야 합니다.이제 레이저 매개변수를 설정합니다. 먼저 컨트롤러의 레이저 활성화 버튼을 누릅니다. 레이저 타겟 스폿은 분홍색으로 표시됩니다.의 시야에서 view 컴퓨터 모니터에서. 레이저 스폿 크기를 작게 설정하여 레이저에 초점을 맞추고 최적의 세포 캡처를 위해 필요에 따라 1-2밀리초 동안 출력과 지속 시간을 65-75밀리와트로 조정합니다. 레이저를 테스트하려면 조이스틱을 사용하여 레이저 스폿을 집어야 할 세포가 없는 영역으로 이동합니다.엄지 스위치를 사용하여 레이저를 발사합니다. 그런 다음 조이스틱을 사용하여 레이저 스폿을 용융된 폴리머 스폿에서 멀리 이동하고 레이저가 발사된 깨끗한 영역을 둘러싸고 보이는 어두운 링이 있는지 확인합니다. 세포를 캡처하려면 조이스틱을 사용하여 레이저 스폿을 셀 영역 위로 이동하여 레이저를 캡처하고 발사합니다.엄지 스위치를 사용하여 레이저를 발사하는 동안 조이스틱을 움직여 넓은 영역의 세포를 캡처합니다. 관심 있는 모든 셀을 발사한 후 캡 배치 암을 들어 올립니다. 포획된 세포는 조직 섹션에서 분리되어 캡에 부착됩니다.캡, 남은 조직 및 누락된 세포가 시야에서 볼 수 있습니다. 캡의 셀은 슬라이드의 빈 부분에 캡을 배치하여 볼 수도 있습니다. 캡 배치 암을 들어 올려 캡 언로드 스테이션으로 돌립니다.캡을 스테이션으로 내리고 캡 배치 암을 이전 위치로 다시 돌립니다. 삽입 도구의 캡을 플랫폼을 따라 캡에 밀어 넣습니다. 플랫폼에서 캡이 부착된 상태로 도구를 들어 올립니다.포스트잇의 접착 부분에 캡을 가볍게 터치하여 원치 않는 조직을 청소하십시오. RN 수성 마이크로 분리 키트에서 얻은 100마이크로리터의 용해 완충액으로 채워진 0.5ml RNA free 튜브에 캡을 넣습니다. 즉시 30초 동안 캡을 소용돌이치게 합니다.세포는 섭씨 42도에서 30분 동안 샘플을 배양하고 RNA가 분리될 때까지 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 고정 후 단일 손상된 뉴런의 LCM에 대한 염색 절차는 뉴런 띠에 대한 절차와 유사합니다. 그러나 일부 배양 시간은 다르며 헹굼 및 탈수 전에 4분 동안 불소로 유지되는 섹션은 염색 후 자세한 내용은 프로토콜의 텍스트 부분을 참조하십시오.다시 말하지만, 흄 후드의 모든 섹션을 15분 동안 자연 건조합니다. 단일 셀을 캡처하기 위해 LCM을 진행하기 전에 매크로 LCM 캡과 동일한 절차를 사용하여 HS LCM 캡을 캡 또는 카세트 모듈로 로드합니다. 다시 말하지만, 레이저 스폿 크기를 작게 설정하여 레이저에 초점을 맞추되, 이번에는 단일 세포의 최적 세포 캡처를 위해 레이저 출력과 지속 시간을 0.45-0.5밀리초 동안 65-75밀리와트로 조정합니다.캡 배치 암을 슬라이드 위로 돌리고 암을 슬라이드 쪽으로 내립니다. 슬라이드 위에 캡을 놓기 위해 capture HS 캡 표면은 샘플에서 높은 곳에 위치합니다. LCM 중에 조이스틱을 사용하여 레이저를 단일 Fluor 보조 양성 세포 위로 이동합니다.캡처되는 모든 셀은 캡의 작은 검은색 링 안에 있어야 하며, 엄지 스위치를 사용하여 레이저를 발사해야 합니다. 블랙 서클 영역 내의 모든 세포가 레이저 리프트로 발사되면 캡 배치 암, 포획된 세포가 조직 섹션에서 분리되어 포획 hs 캡에 부착됩니다. 이제 현미경 스테이지에 다른 슬라이드를 놓고 HS 캡이 가득 찰 때까지 플루로 보조 양성 세포를 수집합니다.그런 다음 40-50 마이크로 리터의 용해, 완충액, 와류 및 인큐베이터로 채워진 0.5 밀리리터 RNA 프리 튜브에 캡을 넣고 섭씨 영하 80도에서 다시 얼립니다. 그렇지 않은 경우, 프로토콜의 텍스트 부분에 있는 지침에 따라 RNA 분리를 수행합니다. 다음 이미지는 쥐 뇌의 10미크론 관상 동맥 절편이 얼어붙은 쥐의 뇌에서 특정 세포 집단의 띠를 레이저로 캡처한 현저한 해부를 보여줍니다.이 프로토콜에 따라 제조되었으며 크레탈 바이올렛 및 미사일 스테인으로 염색되었습니다. 이 이미지는 쥐 해마의 ca 1에서 ca 3 하위 필드까지의 초금속 뉴런을 보여줍니다. 여기서, 해마(hippocampal dentate gyrus)의 과립 세포가 포획되었습니다.마지막으로, 우리는 제3심실의 양쪽과 시신경기즈마 위에 위치한 양측 상부 카이즈마 핵에서 캡처한 뉴런 띠를 보여줍니다. SCN에는 몸 전체의 일주기 리듬을 제어하는 마스터 일주기 시계가 포함되어 있습니다. 다음 이미지는 쥐 해마에서 단일 뉴런의 레이저 캡처 현미해부를 보여줍니다.여기에 표시된 것은 퇴화하는 불소 양성 해마 ca 3 개의 뉴런, 생존 한 fluro aid 음성 ca 3 개의 뉴런, LCM 전후의 3 개의 뉴런이 LCM 캡에 시각화 된 것으로 표시됩니다. 다음 이미지는 레이저로 캡처한 뉴런에서 분리된 전체 RNA의 유전자 발현 분석을 보여주었습니다. 이 이미지는 SCN에서 일주기 시계 유전자 발현의 정량적 실시간 PCR 데이터를 보여줍니다.죽어가는 해마 뉴런과 살아남은 해마 뉴런의 유전자 발현에 대한 이 히트맵은 집속 PCR 어레이를 사용하여 세포사멸 관련 유전자의 발현 프로파일링을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 가짜 손상 TBI 또는 TBI와 뉴런 산화질소, 신타제 또는 글루타티온 과산화효소 1의 발현을 녹다운하도록 설계된 누운 아데노 관련 siRNA 바이러스를 받은 쥐의 1 내지 3개의 뉴런에서 유전자 발현에 대한 전체 게놈 ENT 마이크로어레이 분석에서 생성된 히트맵의 예를 보여줍니다. 둘 다 뇌 손상에 의해 유발된 유전자입니다. 이러한 기술은 뇌 손상 및 암을 포함한 많은 연구 분야의 과학자들이 이러한 질환의 동물 모델을 사용하여 특정 세포 집단의 게놈 단백체 및 대사 프로파일링을 수행할 수 있는 길을 열었습니다.예를 들어, 우리는 현재 이러한 기술을 사용하여 중독에 관여하는 것으로 알려진 전전두엽 피질(prefrontal cortex)과 측좌핵(nucleus accumbens) 뇌 영역에서 특정 세포 집단을 레이저로 캡처하고 있습니다.

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신경과학

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의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

마우스 뇌의 특정 영역별 RNA 발현 프로파일링을 위해서는 정밀하고 재현 가능한 조직 수집 전략이 필요합니다. 본 문서에서는 관상면 뇌 절단과 조직 코어러(corer) 보조 미세 절제술을 모두 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 결과 샘플에서 얻은 총 RNA의 수율과 품질은 상술한 방법의 유용성을 입증합니다.

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

인간 neuroprogenitor 세포 (NPC들)은 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 neurotrophins과의 조합의 존재에 신경이 풍부한 문화로 분화되었다. 신경 세포 마커는 면역 형광 염색으로 검출되었다. 뉴런의 순수한 인구를 분리하기 위해,의 NPC는 PEN 막 슬라이드에 차별화 된 레이저 캡처 미세 절제를 행 하였다.

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

개별 도파민 뉴런의 단리 또는 직접 또는 간접 면역과 복측 피개 영역은 레이저 미세 절제를 캡처하여 설명된다. 적외선 레이저를 이용하여 유리 슬라이드 조직으로부터 단리 및 적외선 및 자외선 레이저의 조합을 이용하여 막 slide에서 파라미터 논의된다.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

우리는 유전자와 예측에 관한 분석에 대 한 서로 다른 뇌 영역에서 뚜렷한 세포 인구의 샘플을 얻기 위해 레이저 캡처 서의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 쥐 두뇌의 특정 지역에서 외상 성 뇌 손상의 차동 효과의 연구를 수 있습니다.

외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정

여기, 우리 다운스트림 RNA 분석에 대 한 배수 채널 (TM)를 격리 하기 위한 재현성 레이저 캡처 기정 (LCM)에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. TM에 유전자 발현에 변화를 분석 하는 능력은 TM 관련 눈 질병의 근본적인 분자 메커니즘을 이해에 도움이 됩니다.

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

이 프로토콜은 레이저 포획 미세 분면을 사용하여 높은 정확도와 해부학 적 특성으로 편도체의 중앙 핵에서 단일 뉴런, 마이크로 글리아 및 성상 세포를 수집하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 이 세포의 전사체의 부분 집합을 측정하기 위하여 미세 유체 성 RT-qPCR의 우리의 사용을 설명합니다.

레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

우리는 여기서 쥐, 인간의 비강 충치의 후각 점막 조직 검사로 연구를 해왔하는 방법을 설명합니다. 이러한 biopsies은 뇌 질환의 분자 변이를 식별하거나 뇌 손상 / 질병의 동물 모델에 세포 이식을 위해 활용할 수 multipotent 성인의 줄기 세포를 분리하거나 사용할 수 있습니다.

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

배우세요 외상성 뇌 손상 후 쥐 뇌의 해마 뉴런을 레이저 캡처 현미절단으로 분리하여 유전자 발현 분석을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 특정 세포 유형에서 고품질 RNA를 확보하여 정량적 실시간 PCR 및 전체 게놈 마이크로어레이 분석을 가능하게 합니다.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

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