외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

이 절차의 전반적인 목표는 후속 유전자 발현 분석을 위해 레이저 캡처 미세해부를 통해 동결 조직 절편에서 해마 뉴런과 단일 뉴런의 풍부한 집단을 얻는 방법을 입증하는 것입니다. 이것은 먼저 마취실에서 쥐를 마취함으로써 이루어집니다. 그런 다음 쥐를 삽관하고 기계적으로 인공호흡을 한 다음 정위 헤드 홀더에 넣어 쥐를 준비시킵니다.유체 타악기 뇌 손상에 대해 개두술을 수행합니다.

두 번째 단계는 유체 타악기 뇌 손상을 관리하는 것입니다. 다음으로 뇌의 관상 절편을 저온 유지 장치에서 절단하고 퇴화 뉴런의 표지자인 플루로 보조제(fluro aid)나 미사일 염색인 리얼 바이올렛(real violet)으로 염색합니다. 마지막 단계는 레이저 캡처 미세 해부를 수행하고 단일 뉴런 또는 뉴런 풀을 수집하는 것입니다.

최종적으로, 총 RNA는 포획된 세포에서 분리되고, 애질런트 바이오분석기를 사용하여 품질을 분석하고, 정량화되며, 정량적 real-time PCR 및 경로 집중 또는 게놈 와이드 마이크로어레이 분석과 같은 다운스트림 애플리케이션에 사용됩니다. 수동 미세 해부와 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 신경교세포나 면역조절세포와 같은 다른 뇌세포 유형이나 조직 절편에서 단일 뉴런의 풍부한 집단을 얻을 수 있다는 것입니다. 이를 통해 뇌 및 여러 세포 유형으로 구성된 다른 이종 조직에서 식별된 고유한 세포 유형에서 유전자 발현 분석을 수행할 수 있으며, 이 절차를 놓칠 수 있음을 입증할 수 있습니다.

Debbie Boone, 우리 연구실 선임연구원. 먼저 유체 충격, 외상성 뇌 손상 또는 가짜 손상을 입은 쥐에서 얻은 뇌 조직을 영하 80도의 냉동고에서 회수하여 영하 22도의 냉동고로 옮깁니다. 뇌가 해동되는 동안 뇌를 단면 온도로 만들기 위해 10분 동안 저온 유지 장치를 사용합니다.

에탄올이 함유된 RNA 잽으로 저온 유지 장치를 닦고 에탄올로 브러시를 청소합니다. 10분이 경과한 후 튜브에서 뇌를 제거하고 배쪽이 위로 향하게 하여 저온 유지 장치의 거즈 조각에 놓고 새 면도날을 사용하여 뇌를 잘라 뇌의 뒤쪽 부분을 제거합니다. 소뇌와 시신경 chiasm의 앞쪽 부분으로 쭉 뻗어 있습니다.

극저온 주형에 OCT 장착 매체를 채우고 앞쪽이 아래로 향하게 하여 뇌를 주형에 넣습니다. 뇌 조직이 하얗게 변할 때까지 장착 매체에서 얼도록 합니다. 이 작업은 약 10분 정도 소요됩니다.

이제 OCT로 표본 디스크를 뇌에 동결합니다. 그런 다음 곰팡이를 제거하십시오. 브레인이 부착된 디스크를 시편 헤드에 삽입하고 나사를 조입니다.

일회용 로우 프로를 삽입file 칼날을 칼 홀더에 넣고 레버를 아래로 조입니다. OCT의 바깥층을 제거하기 위해 20미크론으로 뇌를 자르기 시작합니다. 해마 영역에 도달하면 미크론 다이얼을 10으로 설정합니다.

유리 슬라이드 또는 플러스 유리를 배치하여 관상 연속 절편을 수집합니다. 조직 섹션으로 밉니다. 절편화가 완료될 때까지 섭씨 영하 20도의 RNA 자유 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다.

섹션을 염색하기 전에 모든 염색 용기와 눈금이 매겨진 실린더를 ese로 닦고 milli Q 물로 헹굽니다. 모든 용액이 RNA 자유수로 준비되었는지, 크레탈 바이올렛 및 플루오로 옥 얼룩이 이전에 0.2 미크론 필터를 통과했는지 확인하십시오. 토르 뇌 절편을 실온에서 30초 동안 사용하고 75% 에탄올을 1분 동안 고정합니다.

그런 다음 고정 후 뉴런 띠의 LCM에 대한 적절한 카운터 염색 또는 뉴런 띠의 LCM에 대한 개별 뉴런으로 진행하고, RNA 자유수에 슬라이드를 헹구어 1분 동안 1% 크레스트 바이올렛으로 염색합니다. RNA로 헹구고, 자유수, 각 1분씩 3회, 95% 에탄올로 2회, 각각 30초씩 탈수합니다. 그런 다음 100% 에탄올을 30초 동안 두 번, 자일렌을 3분 동안 두 번 두 번 사용합니다.

염색 후 흄 후드의 모든 섹션을 15분 동안 건조시킨 다음 LCM으로 진행합니다. LCM이 수행됩니다. 적외선 다이오드 레이저가 있는 P 셀 2 E 현미경을 사용하여 먼저 중앙 조이스틱을 수직 위치로 조정합니다.

그런 다음 Forex 목표를 회전하여 제자리에 고정합니다. 현미경 중앙에 염색된 해마 단면이 있는 슬라이드를 놓습니다.tage 그리고 해마 영역이 보일 때까지 수동으로 조정합니다. 코스를 사용하여 초점 조정을 찾으십시오.

단면에 초점을 맞추려면 컨트롤러의 진공 버튼을 눌러 진공 척을 활성화하십시오. 그런 다음 10 x 대물렌즈를 회전하여 제자리에 고정합니다. 코스와 미세 조정으로 다시 초점을 맞춥니다.

매크로 LCM 캡의 캡을 캡, 카세트 모듈에 로드하고 로드 라인 위치에 캡을 배치합니다. 캡 배치 암을 회전하고 캡 주위를 위치시킵니다. 그런 다음 캡 배치 암을 들어 올려 카세트 모듈에서 캡 캡을 제거합니다.

캡 배치 암을 슬라이드 위로 회전한 다음 슬라이드 위로 내려 캡을 슬라이드에 놓습니다. 미세 초점을 조정하고 조이스틱을 움직여 캡의 검은색 원 안에 셀이 있는지 확인합니다. 캡처할 모든 셀은 이 검은색 원 안에 있어야 합니다.

이제 레이저 매개변수를 설정합니다. 먼저 컨트롤러의 레이저 활성화 버튼을 누릅니다. 레이저 타겟 스폿은 분홍색으로 표시됩니다.

의 시야에서 view 컴퓨터 모니터에서. 레이저 스폿 크기를 작게 설정하여 레이저에 초점을 맞추고 최적의 세포 캡처를 위해 필요에 따라 1-2밀리초 동안 출력과 지속 시간을 65-75밀리와트로 조정합니다. 레이저를 테스트하려면 조이스틱을 사용하여 레이저 스폿을 집어야 할 세포가 없는 영역으로 이동합니다.

엄지 스위치를 사용하여 레이저를 발사합니다. 그런 다음 조이스틱을 사용하여 레이저 스폿을 용융된 폴리머 스폿에서 멀리 이동하고 레이저가 발사된 깨끗한 영역을 둘러싸고 보이는 어두운 링이 있는지 확인합니다. 세포를 캡처하려면 조이스틱을 사용하여 레이저 스폿을 셀 영역 위로 이동하여 레이저를 캡처하고 발사합니다.

엄지 스위치를 사용하여 레이저를 발사하는 동안 조이스틱을 움직여 넓은 영역의 세포를 캡처합니다. 관심 있는 모든 셀을 발사한 후 캡 배치 암을 들어 올립니다. 포획된 세포는 조직 섹션에서 분리되어 캡에 부착됩니다.

캡, 남은 조직 및 누락된 세포가 시야에서 볼 수 있습니다. 캡의 셀은 슬라이드의 빈 부분에 캡을 배치하여 볼 수도 있습니다. 캡 배치 암을 들어 올려 캡 언로드 스테이션으로 돌립니다.

캡을 스테이션으로 내리고 캡 배치 암을 이전 위치로 다시 돌립니다. 삽입 도구의 캡을 플랫폼을 따라 캡에 밀어 넣습니다. 플랫폼에서 캡이 부착된 상태로 도구를 들어 올립니다.

포스트잇의 접착 부분에 캡을 가볍게 터치하여 원치 않는 조직을 청소하십시오. RN 수성 마이크로 분리 키트에서 얻은 100마이크로리터의 용해 완충액으로 채워진 0.5ml RNA free 튜브에 캡을 넣습니다. 즉시 30초 동안 캡을 소용돌이치게 합니다.

세포는 섭씨 42도에서 30분 동안 샘플을 배양하고 RNA가 분리될 때까지 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 고정 후 단일 손상된 뉴런의 LCM에 대한 염색 절차는 뉴런 띠에 대한 절차와 유사합니다. 그러나 일부 배양 시간은 다르며 헹굼 및 탈수 전에 4분 동안 불소로 유지되는 섹션은 염색 후 자세한 내용은 프로토콜의 텍스트 부분을 참조하십시오.

다시 말하지만, 흄 후드의 모든 섹션을 15분 동안 자연 건조합니다. 단일 셀을 캡처하기 위해 LCM을 진행하기 전에 매크로 LCM 캡과 동일한 절차를 사용하여 HS LCM 캡을 캡 또는 카세트 모듈로 로드합니다. 다시 말하지만, 레이저 스폿 크기를 작게 설정하여 레이저에 초점을 맞추되, 이번에는 단일 세포의 최적 세포 캡처를 위해 레이저 출력과 지속 시간을 0.45-0.5밀리초 동안 65-75밀리와트로 조정합니다.

캡 배치 암을 슬라이드 위로 돌리고 암을 슬라이드 쪽으로 내립니다. 슬라이드 위에 캡을 놓기 위해 capture HS 캡 표면은 샘플에서 높은 곳에 위치합니다. LCM 중에 조이스틱을 사용하여 레이저를 단일 Fluor 보조 양성 세포 위로 이동합니다.

캡처되는 모든 셀은 캡의 작은 검은색 링 안에 있어야 하며, 엄지 스위치를 사용하여 레이저를 발사해야 합니다. 블랙 서클 영역 내의 모든 세포가 레이저 리프트로 발사되면 캡 배치 암, 포획된 세포가 조직 섹션에서 분리되어 포획 hs 캡에 부착됩니다. 이제 현미경 스테이지에 다른 슬라이드를 놓고 HS 캡이 가득 찰 때까지 플루로 보조 양성 세포를 수집합니다.

그런 다음 40-50 마이크로 리터의 용해, 완충액, 와류 및 인큐베이터로 채워진 0.5 밀리리터 RNA 프리 튜브에 캡을 넣고 섭씨 영하 80도에서 다시 얼립니다. 그렇지 않은 경우, 프로토콜의 텍스트 부분에 있는 지침에 따라 RNA 분리를 수행합니다. 다음 이미지는 쥐 뇌의 10미크론 관상 동맥 절편이 얼어붙은 쥐의 뇌에서 특정 세포 집단의 띠를 레이저로 캡처한 현저한 해부를 보여줍니다.

이 프로토콜에 따라 제조되었으며 크레탈 바이올렛 및 미사일 스테인으로 염색되었습니다. 이 이미지는 쥐 해마의 ca 1에서 ca 3 하위 필드까지의 초금속 뉴런을 보여줍니다. 여기서, 해마(hippocampal dentate gyrus)의 과립 세포가 포획되었습니다.

마지막으로, 우리는 제3심실의 양쪽과 시신경기즈마 위에 위치한 양측 상부 카이즈마 핵에서 캡처한 뉴런 띠를 보여줍니다. SCN에는 몸 전체의 일주기 리듬을 제어하는 마스터 일주기 시계가 포함되어 있습니다. 다음 이미지는 쥐 해마에서 단일 뉴런의 레이저 캡처 현미해부를 보여줍니다.

여기에 표시된 것은 퇴화하는 불소 양성 해마 ca 3 개의 뉴런, 생존 한 fluro aid 음성 ca 3 개의 뉴런, LCM 전후의 3 개의 뉴런이 LCM 캡에 시각화 된 것으로 표시됩니다. 다음 이미지는 레이저로 캡처한 뉴런에서 분리된 전체 RNA의 유전자 발현 분석을 보여주었습니다. 이 이미지는 SCN에서 일주기 시계 유전자 발현의 정량적 실시간 PCR 데이터를 보여줍니다.

죽어가는 해마 뉴런과 살아남은 해마 뉴런의 유전자 발현에 대한 이 히트맵은 집속 PCR 어레이를 사용하여 세포사멸 관련 유전자의 발현 프로파일링을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 가짜 손상 TBI 또는 TBI와 뉴런 산화질소, 신타제 또는 글루타티온 과산화효소 1의 발현을 녹다운하도록 설계된 누운 아데노 관련 siRNA 바이러스를 받은 쥐의 1 내지 3개의 뉴런에서 유전자 발현에 대한 전체 게놈 ENT 마이크로어레이 분석에서 생성된 히트맵의 예를 보여줍니다. 둘 다 뇌 손상에 의해 유발된 유전자입니다. 이러한 기술은 뇌 손상 및 암을 포함한 많은 연구 분야의 과학자들이 이러한 질환의 동물 모델을 사용하여 특정 세포 집단의 게놈 단백체 및 대사 프로파일링을 수행할 수 있는 길을 열었습니다.

예를 들어, 우리는 현재 이러한 기술을 사용하여 중독에 관여하는 것으로 알려진 전전두엽 피질(prefrontal cortex)과 측좌핵(nucleus accumbens) 뇌 영역에서 특정 세포 집단을 레이저로 캡처