마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

본 실험 절차의 전반적인 목적은 장 점막 면역 체계 내에 위치한 M 세포에 의한 세균 섭취를 조사하는 것입니다. 본 절차의 첫 번째 단계는 마취된 마우스의 장 파이어판(Peyer's patches)을 노출시키고 결찰하는 것입니다. 그 후 결찰된 부위에 형광 세균을 주입합니다.

한 시간 후, pyres 패치를 절제합니다. 그 다음 조직 내 세포들을 투과화하고 M 세포 마커인 GP2로 염색합니다. 마지막으로, 공초점 현미경을 사용하여 샘플을 관찰하면 M 세포에 의해 transcytosis되는 박테리아를 시각화할 수 있습니다.

M 세포에 의한 박테리아 transcytosis의 분자적 기초에 대한 통찰을 제공하는 것 외에도, 이 방법은 다른 시스템에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 콜레라균과 미생물을 이용하여 염증성 장의 세포 투과성을 분석하는 데 활용될 수 있습니다. 멸균된 유리 스프레더를 사용하여 형광 박테리아를 LB agar 플레이트에 도말하고, 단일 콜로니가 보일 때까지 37 °C에서 배양합니다. 고체 agar에서 단일 콜로니를 채취하여 2 mL의 신선한 LB 배지에 접종합니다.

그 다음, 박테리아를 37 °C의 쉐이커에서 하룻밤 동안 배양합니다. 스타터 배양액이 성장하면, 박테리아 500 µL를 4.5 mL의 LB 배지에 옮기고, 이 새로운 배양액을 37 °C에서 3~4시간 동안 또는 600 nm에서의 흡광도(OD₆₀₀)가 1에 도달하여 박테리아 성장이 대수 증식기(log phase)에 진입할 때까지 배양합니다. 이 시점에서, 배양액을 4 °C에서 3000 ×g로 5분 동안 원심분리하여 박테리아를 수확합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠렛을 5 mL의 멸균 PBS로 세척합니다. 세척 단계를 반복한 후, 박테리아를 5 mL의 PBS에 재현탁합니다.

마우스를 지속적인 isof fluorine 마취 상태로 둔 후, 멸균 도구를 사용하여 마우스의 복부를 무균적으로 절개합니다. 소장을 노출시켜 PI's patches의 위치를 찾습니다. PI's patches를 찾으면, 멸균 봉합사를 사용하여 패치로부터 한쪽으로 약 5 mm 떨어진 지점에서 장을 결찰합니다.

시술 중 혈관이 절단되지 않도록 주의하십시오. 장을 결찰한 후, 주사기를 사용하여 약 10⁷ CFU의 세균 현탁액 50 µL를 장의 느슨한 쪽인 결찰된 pyres patch loop에 주입합니다. 그런 다음 실을 사용하여 장의 반대편을 결찰합니다.

클립으로 마우스의 복부를 폐쇄하고, 안락사시키기 전 한 시간 동안 마우스가 마취 상태를 유지하도록 합니다. 파이어스 패치(pyres patch)를 채취하려면 파이어스 패치를 조심스럽게 절제하십시오. 그 다음, 채취한 장 분절에 PBS를 여러 번 강하게 흘려보내 PI 패치의 정단면을 세척하고 과도한 점막액과 박테리아를 제거합니다.

PI 패치의 세척이 완료되면, 이를 24웰 플레이트의 웰에 넣고 cyto effects 또는 cyto perm 용액을 첨가합니다. 샘플을 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. PI 패치가 고정되면, 1 mL의 perm wash buffer에 5분 동안 담급니다.

이 세척 단계를 3회 반복합니다. 그런 다음 샘플을 1 mL의 블로킹 버퍼에 넣고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 블로킹 단계 이후, anti mouse GP two 단클론 항체를 최종 농도가 5 µg/mL가 되도록 첨가하고, M 세포를 염색하기 위해 샘플을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음으로, 이전과 동일하게 샘플을 세척합니다. 접합 항체를 추가하고 샘플을 얼음 위 암소에서 2시간 동안 배양합니다. 샘플 염색이 완료되면, PBS로 샘플을 부드럽게 세척합니다.

그 다음, 슬라이드 위에 원형 커버 글라스를 3~4장 놓고 pires 패치를 PBS 내 30% glycerol 용액 200 microliters에 매립합니다. 슬라이드 상의 샘플을 관찰하기 위해 DM IRE two 공초점 레이저 현미경 또는 Delta vision 복원 디콘볼루션 현미경을 사용합니다. 이 이미지에서, 녹색 GFP로 표지된 salmonella typhimurium이 정단 세포막의 적색으로 표시된 GP two에 의해 둘러싸여 있는 것을 확인할 수 있습니다.

회전된 이 이미지에서 박테리아가 하단부 정점 세포질 소포 내에 보이는 것을 확인할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 리게이션된 pys 장 Lu 분석법을 사용하여 M 세포에 의한 박테리아의 트랜스사이토시스(transcytosis)를 평가하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.