마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

Peyer의 패치를 다루는 전문 뿌리 - 관련 상피의 M 세포는 창자 - 관련 림프 조직에서 점막 immunosurveillance을위한 중요한 역할을한다. 여기 우리는 M 세포에 의해 세균 transcytosis에 대한 평가 방법을 설명

이 절차의 전반적인 목표는 장 점막 면역 체계 내에 위치한 M 세포의 박테리아 흡수를 검사하는 것입니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 마취된 마우스의 장작더미 패치를 노출시키고 접합하는 것입니다. 그런 다음 형광 박테리아를 결찰 부위에 주입합니다.

한 시간 후, 장작더미 밭이 제거됩니다. 그런 다음 조직의 세포를 투과하고 염색하여 M 세포 마커, GP 2를 만듭니다. 마지막으로, 컨포칼 현미경을 사용하여 샘플을 관찰하고 M 세포에 의한 transcytosis인 박테리아를 시각화할 수 있습니다.

m 세포에 의한 박테리아 transcytosis의 분자 기초에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도 dismissal을 다른 시스템에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 세포 투과성을 보조하는 데 사용할 수 있으며, 멸균 유리 살포기를 사용하여 염소 및 미생물을 사용하여 프레임 장에서 LB 오거 플레이트에 형광 박테리아를 줄무늬를 만들고 단일 콜로니가 보일 때까지 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 고체 오거에서 단일 콜로니를 선택하고 2ml의 새로운 LB 배지에 접종합니다.

그런 다음 박테리아를 셰이커에서 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 스타터 배양액이 성장하면 500마이크로리터의 박테리아를 4.5밀리리터의 LB 배지로 옮기고 이 새로운 배양물을 섭씨 37도에서 3-4시간 동안 또는 600나노미터의 광학 밀도가 1에 도달할 때까지 배양하여 박테리아 성장이 로그 단계에 있음을 나타냅니다. 이 시점에서, 배양액을 섭씨 4도에서 5분 동안 3000배 G로 원심분리하여 원심분리 후 박테리아를 수확하고, 스내트를 버리고 펠릿을 5밀리리터의 멸균 PBS로 세척한 후 세척 단계를 반복한 후 Resus는 5밀리리터의 PBS에 박테리아를 현탁시킵니다.

마우스를 지속적인 불소 마취 상태에 놓은 후 멸균 도구를 사용하여 마우스의 복부를 무균적으로 엽니다. 소장을 노출시키는 것으로 시작하고 PI의 패치를 찾습니다. PI의 패치가 발견되면 멸균 재봉사를 사용하여 패치의 한쪽 면으로 약 5mm 정도의 장을 접합합니다.

시술 중 혈관이 절단되지 않도록 주의하십시오. 장이 결찰되면 주사기를 사용하여 50마이크로리터의 박테리아 현탁액 약 10에서 7 CFU를 장의 느슨한 쪽에 있는 결찰된 장작더미 패치 루프에 주입합니다. 그런 다음 실을 사용하여 장의 다른 쪽을 접합합니다.

클립으로 마우스의 복부를 닫고 안락사시키기 전에 1시간 동안 마취 상태를 유지합니다. 장작더미 패치를 수확하려면 장작더미 패치를 조심스럽게 잘라냅니다. 그런 다음 적출된 장 부분을 통해 PBS를 여러 번 세게 세척하여 PI 패치의 정점 쪽을 세척하고 과도한 점막액과 박테리아를 제거합니다.

PI의 패치가 세척되면 24웰 플레이트의 웰에 넣고 사이토 효과 또는 사이토 펌 용액을 추가합니다. 얼음 위에서 샘플을 1시간 동안 배양합니다. P'S 패치가 고정되면 1ml의 펌 워시 버퍼에 5분 동안 담가둡니다.

이 세척 단계를 세 번 반복합니다. 그런 다음 샘플을 1ml의 블로킹 버퍼에 넣고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 차단 단계에 이어 안티 마우스 GP 2 단클론 항체를 밀리리터당 5마이크로그램의 최종 농도로 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양하여 M 세포를 염색합니다.

다음으로, 이전과 같이 샘플을 세척합니다. 접합 항체를 위한 2차 바닥을 추가하고 어두운 곳에서 2시간 동안 얼음 위에서 샘플을 배양합니다. 샘플이 염색되면 PBS에서 샘플을 부드럽게 세척합니다.

그런 다음 슬라이드에 3-4개의 원형 커버 유리를 놓고 PBS에 있는 30% 글리세롤 용액 200마이크로리터에 파이레스 패치를 삽입합니다. 슬라이드에서 DM IRE 2 컨포칼 레이저 현미경 또는 델타 비전 복원 디콘볼루션 현미경을 사용하여 샘플을 관찰합니다. 이 이미지에서 녹색 GFP로 표시된 Salmonella typhimurium은 정점 원형질막에 빨간색으로 표시된 GP 2로 둘러싸여 있는 것을 볼 수 있습니다.

이 회전된 이미지에서 박테리아는 정점 세포질 소포 내에서 볼 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 ligated pys intestinal Lu asay를 사용하여 M 세포에 의한 세균 transcytosis를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.