Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호

다음 실험의 전체적인 목표는 단층 보호 클러스터(monolayer protected clusters, MPCs)로 알려진 알킬레이트 안정화 금 나노입자를 합성하고, 이러한 재료를 아자린 단백질 단층 전기화학의 흡수 인터페이스로 사용되는 박막 어셈블리로 조립하는 것입니다. 이는 먼저 유기 리간드로 금 콜로이드를 보호하여 알칸 포스페이트(Alcan Pholate) 막으로 둘러싸인 금 나노입자를 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, MPC를 금 및 유리 기판에 고정하고 공유 결합으로 연결된 다층 박막으로 네트워크화하며, 그 성장은 광학 및 전기화학적 측정과 단면 현미경 분석을 통해 추적합니다.

그 다음, 전자 전달 단백질인 azarin을 계면에 흡착시키고 단백질 단분자층 전기화학 분석을 위해 순환 전압전류법(cyclic voltammetry)을 수행합니다. 결과에 따르면, 이 절차로 생성된 MPC 필름 계면은 MPC 필름을 기반으로 흡착된 단백질의 더욱 최적화된 전기화학적 분석을 가능하게 하며, 더 균질한 흡착 계면과 전통적인 거리 의존성이 없는 빠른 전자 전달 속도를 제공합니다. 전통적인 단백질 전기화학 분석과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 나노입자 필름으로 수식된 전극이 순환 전압전류법으로 측정 시 더욱 이상적인 전기화학적 거동을 보이는 흡착 계면을 제공한다는 점입니다.

합성 과정에는 중요한 시각적 신호가 포함되어 있고, 박막 구축 및 특성 분석에는 여러 복잡한 단계와 분석 기술이 수반되므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. NPC 박막은 MPC 층과 이작용기 연결 분자를 교대로 사용하는 딥 사이클(dip cycle) 방법을 통해 변형된 금 전극 또는 유리 슬라이드 위에 조립될 수 있습니다. 결과적으로, 이러한 층들은 원하는 박막 두께에 도달할 때까지 전기화학적 또는 광학적으로 추적할 수 있습니다.

적절한 환기 시설이 갖춰진 흄 후드 내에서 금 클러스터를 합성하기 위해, 먼저 tetra oxide ammonium bromide 1.1 g을 toluene 30 mL에 녹입니다. sodium borah hydride 0.38 g을 약 18 mega ohms 초순수 20 mL에 녹인 후, 얼음 위에서 최소 30분 동안 냉각시킵니다. 다음으로, 초순수 5 mL를 추가로 사용하여 hydrogen tetra chloro orating water 용액을 tetra ide ammonium bromide toluene 용액으로 정량 전이합니다. 수용성 금 용액을 비수성 용액으로 상전이시키기 위해, 캡을 가볍게 닫고 30분 동안 격렬하게 교반합니다.

따라서 진한 오렌지색의 수층과 투명한 비수층이 잘 혼합됩니다. 투명한 수층과 진한 오렌지색의 비수층을 모두 분별 깔때기로 옮깁니다. 수층은 버리고 비수층은 깨끗한 플라스크에 데칸테이션하여 옮깁니다.

수소 tetrachloroaurate를 포함하는 비수성 용액에 C six를 2:1의 비율로 첨가합니다. 붉은 오렌지색에서 옅은 노란색의 거의 무색인 용액으로 색이 변하며 gold one 폴리머가 형성될 때까지 30분 동안 교반합니다. 반응 혼합물을 단열 얼음 수조로 옮기고 교반하며 0 °C에서 최소 30분 동안 냉각합니다. thighs가 존재하는 상태에서 gold one을 금속 금으로 환원시키기 위해, 냉각된 sodium borohydride 용액을 반응 혼합물에 정량적으로 빠르게 첨가합니다.

첨가 즉시 단분자층 보호 금 클러스터(monolayer protected gold clusters, MPCs)의 진한 검은색 용액이 형성됩니다. 다음 날까지 0 °C에서 밤새 반응물을 교반하십시오. 반응 혼합물을 분별 깔때기로 옮깁니다.

수층은 폐액 비커에 버리고 회전 증발기로 처리하십시오. 비수성 톨루엔 층을 거의 완전히 건조될 때까지 증발시키면 플라스크에 진한 검은색 슬러지가 남습니다. 아세토니트릴을 첨가하여 MPC를 침전시키고, 고무 피팅이 달린 중간 기공도의 글래스 프리트와 아스피레이터가 연결된 사이드암 플라스크를 사용하여 용액을 하룻밤 동안 방치하십시오.

진공 여과를 통해 MPC를 수집하고 다량의 acetonitrile으로 헹굽니다. 샌드위치 셀을 전기화학적으로 조립한 후, 0.1 M 황산과 0.01 M 염화칼륨 용액 내에서 100 mV/s의 속도로 0.2~0.9 V, 0.2~1.2 V 및 0.2~1.35 V의 전위 창에서 순환 전압-전류법(CV)을 수행하여 금 기판을 세척합니다. 인산칼륨 완충액(KPB) 내에서 Ag/AgCl 대비 0.1~0.4 V의 전위 창을 100 mV/s로 스캔하는 표준 조건에서 CV를 수행하여, 세척된 순수 금 기판의 전기 이중층 충전 전류를 측정합니다.

완충액을 버리고 초순수와 에탄올로 두 번 충분히 헹굽니다. 세척된 금 기판을 에탄올에 녹인 5 mM C six 용액 약 300 µL에 노출시킨 후, 정렬된 C six SAM이 형성되도록 하룻밤 동안 방치합니다. 셀에서 C six 용액을 버리고 에탄올과 초순수로 두 번 충분히 헹굽니다.

표준 조건에서 SAM의 충전 전류를 측정합니다. KPB를 버리고 초순수와 에탄올로 두 번 충분히 헹굽니다. 충전 전류가 현저히 감소해야 합니다.

순수 금 측정 단계 이후, SAM으로 수식된 금 기판을 에탄올에 녹인 5 mM NDT 용액 약 300 µL에 노출시키고 1시간 동안 방치하여 C6 SAM 내에 NDT 연결 분자들이 상호 분산되도록 합니다. NDT 용액을 제거하고 에탄올과 초순수로 각각 두 번씩 충분히 헹군 다음, 다이메테인(diam methane)으로 한 번 더 헹굽니다. 질소 가스를 천천히 버블링하여 교반하면서 금 기판을 다이메테인 기반의 MPC 용액에 1시간 동안 노출시킵니다.

이것은 필름 어셈블리의 앵커링 MPC 층입니다. MPC 용액을 버리고 다시 디클로로메탄, 초순수 및 KPB로 순차적으로 헹굽니다. 표준 조건에서 MPC 층의 충전 전류를 측정합니다.

KPB를 버리고 초순수와 DIAM methane으로 충분히 헹굽니다. 금 기판을 5 mM NDT DIAM methane 용액 약 300 µL에 노출시킨 후, 질소 가스를 천천히 버블링하며 20분 동안 교반합니다. NDT를 버리고 DIAM methane으로 철저히 헹구어 두 번째 MPC 층을 증착합니다.

필름 어셈블리를 DIAM methane의 MPC 용액에 다시 담그고, 질소 가스를 천천히 버블링하여 1시간 동안 교반하며 방치합니다. 그 후, 표준 조건에서 MPC 층의 충전 전류를 다시 측정하고 동일한 절차를 사용하여 다시 헹굽니다. 필요한 경우 MPC 층을 추가로 증착합니다.

네트워크화된 MPC 필름이 완성되면, MPC 필름 어셈블리에 AZ 단백질을 흡착시키기 위해 KPB로 변형된 기판을 헹굽니다. KPB에 녹인 5~10 µM 농도의 AZ 용액 약 150 µL를 E chem 샌드위치 셀에 주입하고, 캡을 닫은 상태로 냉장 보관하며 최소 1시간 동안 방치합니다. ECM 셀이 실온으로 돌아오면 KPB로 충분히 헹군 뒤, ECM 셀을 KPB로 다시 채우고 질소 가스로 10분 동안 버블링합니다.

-0.25 V에서 0.25 V 사이의 전위 창에서 CV와 같은 단층 전기화학 연구를 수행합니다. DIAM methane으로 수정된 KPB Rinse A 3M PT MS 유리 슬라이드를 초당 100 mV의 속도로 스캔하고, 이를 저속 쉐이커로 교반하며 DIAM methane의 MPC 용액에 1시간 동안 담가둡니다. 이 과정을 통해 sane의 ME captan 말단 그룹에 MPC가 고정되어 박막 조립의 첫 번째 MPC 층이 완성됩니다.

슬라이드를 디메틸메탄으로 충분히 헹구고, 질소 가스로 건조시킨 후, 디메틸메탄 내의 NDT 용액에 슬라이드를 담근 후 UV-vis 스펙트럼을 측정합니다. 슬라이드를 MPC 용액에 넣고 쉐이커에서 저속으로 흔들어주며 1시간 동안 반응시킵니다. 이로써 필름 어셈블리의 두 번째 MPC 층 형성이 완료됩니다.

슬라이드를 DIAM 메탄으로 충분히 헹구고, 질소 가스로 건조시킨 후 슬라이드의 UV-vis 스펙트럼을 측정합니다. 필름 어셈블리에 MPC 층이 추가로 흡착됨에 따라 스펙트럼 전반의 흡광도가 증가해야 합니다. 3M PT MS로 수식된 유리 슬라이드 위에 조립된 MPC 필름을 표준 현미경 슬라이드에 부착합니다.

에폭시 수지 embed eight 12를 준비하고 최소 12시간 동안 점도가 높아지도록 둡니다. 빔 캡슐을 에폭시 수지로 채운 후 MPC 필름 샘플 위에 뒤집어 놓습니다. 캡슐에 압력을 가해 기포가 캡슐 상단으로 올라오게 하여, 에폭시 수지와 MPC 필름 샘플 사이에 밀봉 상태를 형성합니다.

60°C에서 최소 18시간 동안 중합시킨 후, 마운팅된 슬라이드를 실온으로 냉각합니다. 패스트 필름에 부착된 MPC가 포함된 블록을 쉽게 제거하기 위해, 200°C의 알루미늄 주조 핫플레이트에서 마운팅된 슬라이드를 20 seconds 동안 가열합니다. 보석용 톱을 사용하여 빔 캡슐 블록에서 필름이 포함된 샘플을 잘라내고, 제거된 부분을 MPC 필름 면이 실리콘 내부를 향하도록 위로 하여 실리콘 평면 몰드에 넣습니다.

실리콘 웰을 상온에서 에폭시 수지로 채우고 60 °C에서 최소 18시간 동안 중합시킵니다. 그 후 샘플을 상온으로 냉각합니다. 다이아몬드 나이프를 사용하여 Leica UCT 울트라 마이크로톰으로 나이프 날과 수직이 되도록 60에서 80 nm 두께의 얇은 샘플 섹션을 절단합니다. 절단된 섹션을 400 mesh 구리 그리드 위의 Formvar 카본 지지 필름 위에 올리고, 표시된 MPC 필름 어셈블리의 단면 TEM 이미지를 촬영합니다.

MPC와 NDT 용액에 교대로 노출시키는 총 5회의 침지 사이클을 통한 MPC 박막 성장의 이중층 충전 전류 모니터링 결과입니다. 충전 전류는 각 침지 사이클마다 체계적으로 증가합니다. 이는 박막에 MPC 층이 추가되고 있음을 나타냅니다.

여기에 4.4 mM 인산칼륨 완충액에서 -0.25V에서 +0.25V의 전위 창을 사용하여 100 mV/s로 스캔하여 수집한 MPC 필름 어셈블리에 대한 전형적인 순환 전압-전류 곡선(cyclic voltammogram)이 제시되어 있습니다. 3M PT MS로 수정된 유리 슬라이드 상에서 디올 결합 MPC 필름 성장을 모니터링한 대표적인 UV-vis 스펙트럼이 여기에 표시되어 있습니다. 딥 사이클(dip cycle)은 유리 슬라이드를 NDT 링커 용액에 노출시킨 후, 이어서 MPC 용액에 노출시키는 과정으로 구성됩니다.

이후 딥핑을 반복할 때마다 박막의 두께가 증가하며 이에 따라 흡광도가 동시에 증가합니다. 이 그림은 DIA가 결합된 MPC 필름 어셈블리의 투과 전자 현미경 단면 이미지 분석 결과를 보여줍니다. 삽입도는 필름 어셈블리 TEM 분석에 사용된 hexa methol 기능화 MPC의 전형적인 TEM 이미지를 보여줍니다.

Image J를 사용하여 MPC의 평균 금 코어 직경을 측정한 결과 약 2 nm인 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 산화환원 단백질의 흡착 및 후속 전기화학 분석을 위한 인터페이스 역할을 하는 MPC 금 나노 입자 박막을 합성, 특성 분석 및 조립하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 박막 조립 공정은 MPC 합성 절차와 내부 입자 연결 메커니즘을 조절함으로써 다양한 종류의 단백질 흡착에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다.

이 방법은 변형된 합성 플랫폼에 대한 단백질 흡착의 전기화학적 특성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 전자 전달 모델링 시스템, 바이오센싱 체계 및 합성 생체 적합성 재료의 개발에도 적용될 수 있습니다.