Name: Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 배우세요 단층 보호 클러스터(MPC) 합성 및 박막 조립을 통한 단백질 전기화학 분석법을 알아보세요. 금 나노입자 기반 전극 계면에서 아주린 및 사이토크롬 c의 전자 이동 역학을 연구하는 혁신적인 기술입니다.

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우리는 기꺼이 국립 과학 재단 (CHE - 0847145), 그리고 넉넉한이 연구를 지원하기위한 헨리 드레이 퓨 스를 교사 학술 상 프로그램을 인정합니다. 우리는 특별히 크리스틴 데이비스, 크로스 - 단면 영상과 함께 그녀의 도움 리치몬드 대학에서 생물의학과 현미경 및 이미징 이사를 인식하고 싶습니다. 특별 감사는 Drs에 주어집니다. T. 레오폴드, R. Kanters, D. 켈로그, R. 밀러, 그리고 W. 사례뿐만 아니라, 러스 콜린스, 필 조셉, 캐롤린 마크, 맨디 Mallory와 존 Wimbush - 모든이 대학에서 가능한 학부생 연구를하다 리치몬드의. 감사합니다 아주 개인은 레오폴드의 연구실에있는 모든 현재, 과거와 미래의 대학 연​​구자들에게 주어집니다.

1. Hexanethiolate Monolayer 보호 금 클러스터 합성 Hexanethiolate 작용 monolayer 보호 황금 클러스터 (MPCs)은 같은 끊을 225 (C6) 75 평균 구조를 생산하는 황금 두더지 비율 2시 1분 1 hexanethiol (C6). 부르 스트 반응에 4-9 특정 수정할 다음과 같은 합성 아르 리간드 유형, 특정 thiol - 투 - 황금 비율, 온도 및 반응 전달 속도, 또는 포스트 합성 트리 트먼트, 9-11은 각각 다양한 핵심 크기와 기능 보호 단체와 MPCs의 다양한 범위를 얻을 수 있습니다. 4 MPC의 대략적인 (을 다양한 alkanethiol 그룹으로 작용 MPCs의 평균) 작곡은 양성자 (1 H) 요오드 - 분해 시료의 핵 자기 공명 (NMR) 분석에 의해 결정하실 수 있습니다. <ol><li> 적절한 연기 후드의 환기와 톨루엔의 30 ML 1.1 g의 tetraoctylammonium의 브로마이드 (TOABr)를 해산. </li><li> 18 MΩ ultrapurified 물 (H 2 O UP)의 ~ 20 ML에서 0.38 g의 나트륨 borohydride (NaBH 4) 디졸브 최소한 30 분 이상 얼음 진정 수 있습니다. </li><li> UP H 2 O 중 ~ 20 ML에서 0.31 g 수소 tetrachloroaurate (HAuCl 4) 분해하고 양적 솔루션 혼합물은 추가를 사용하여 TOABr - 톨루엔 용액으로 환승 ~ UP H 2 O 5 ML을 수성 금을 위상 전송하기 위해서는 nonaqueous 솔루션에 솔루션입니다. 번제 오렌지 수성 맑은 nonaqueous 단계가 잘 혼합되도록 가볍게 30 분 덮인 동안 엄격하게 저어. </li><li> 분리 깔때기에 대한 명확한 수성과 번제 오렌지 nonaqueous 단계를 모두 전송합니다. 수성 (아래) 레이어와 가만히 따르다 깨끗한 플라스크로 nonaqueous (상단) 레이어를 폐기하십시오. </li><li> nonaqueous 솔루션 HAuCl 4 2시 1분의 비율 C6을 추가합니다. 같은 엷은 노란색, 거의 무색의 용액으로 붉은 오렌지색의 컬러 변화로 감지 끊을 (I) 폴리머를 형성 30 분 저어. </li><li> 0 ° C 감동과 함께 최소 30 분 절연 얼음 욕조와 진정 반응 혼합물을 전송합니다. </li><li> 양적 빠르게 즉시 이외에 MPCs의 두꺼운 검은 솔루션을 형성 thiols의 면전에서 금속 황금색의 Au를 (I) 줄이기 위해 반응 혼합물에 차게 NaBH 4 솔루션을 추가합니다. 0 하룻밤 반응을 저어 ° C. </li><li> , 분리 깔때기에 반응 혼합물을 전송 쓰레기 비커에 수성 (아래) 레이어를 삭제하고, 로타리 술병에 큰 검은 슬러지를 떠나 근처 완료 건조하는 nonaqueous (위) 톨루엔 레이어를 증발. </li><li> acetonitrile를 추가하고 밤새 앉아 있도록하여 MPCs을 촉진. </li><li> 고무 부품 및 흡인기와 사이드 무장 플라스크와 중간 다공성의 유리 프릿을 사용하여 진공 여과에 의해 MPCs를 수집하고 acetonitrile의 풍부한 양의 린스. </li><li> 공기 건조 MPCs는, 제품의 무게를 전송 전자 현미경 (TEM)과 NMR 분석에 의해 특성, 그리고 저장소가 나중에 사용하기 위해 덮힌 수 있습니다. formvar / 구리 그리드 (400 메쉬) 및 80-100 kV에서 TEM 악기를 운영에 대한 탄소 지원 영화에 톨루엔에 용해 드롭 주조 MPCs하여 TEM 이미지를 얻습니다. 평균 코어 크기는 같은 이미지 J (프리웨어)와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 추정 수 있습니다. </li></ol> 2. 필름 어셈블리 : 단백질 Monolayer의 전기에 대한 Dithiol 연결된 MPC 필름 조립 골드 기판 처음 electrochemically 몇 번 결국 dithiol 연결된 MPC 필름 어셈블리를 형성 반복되는 '딥 사이클 "을 만들길 dithiol 연결 분자와 C6 수정 MPCs의 솔루션을 번갈아에 immersing하기 전에 청소 및 C6 SAM과 수정 . 마찬가지로 이전의 연구에서 설명된 2가 녹농균 azurin (AZ) 단백질의 원래 플라스미드가 우아하게 라이스 대학과 AZ의 박사 코리 윌슨에 의해 주어졌다는 리치몬드 교수, 박사 조나단의 대학 정화와 동결 건조된 분말로 제공된 이후 자외선 볼 수 (UV - VIS) 분석에 의해 확인된대로 5-10 μm의 솔루션을 만드는 데 4.4 MM 인산 칼륨 완충액 (KPB, 산도 = 7.0, μ = 10 ㎜)과 rehydrated했습니다 Dattelbaum. <ol><li> 첫째 Lucite 리테이너 플레이트, 작업 전극으로 금 기판, 금 작업 전극에 황동 전기 접촉, 먼저 고무 가스켓, Viton 전극 영역을 정의하는 O - 링 : 아래쪽에서 위쪽으로 다음과 같은 순서로 전기 (echem) 샌드위치 셀을 조립 (0.32 cm 2), 유리 세포 기관, 초 고무 가스켓, 둘째 Lucite 리테이너 플레이트. 전체 세포는 스레드 봉에​​ 정신이 없는데, 조심스럽게 날개 너트를 강화합니다. 세포는 1 M KCl 포화, 자세 / AgCl 참조 와이어 및 PT 보조 전극 와이어와 유리 배럴을 전시하고 상업적으로 구입 기준 전극과 함께 장착되어 있습니다. </li><li> Electrochemically 청소 일0.2에서 0.9 V 가능성 Windows에서 0.2-1.2 V, 및 0.2-1.35를 주기적 voltammetry (CV)를 수행하여 전자 골드 기판 V (대 자세 / AgCl, KCl) 100 0.1 MH 2 솔루션에 MV / s의 4 SO 및 0.01 M의 KCl. </li><li> 0.1에서 0.4 V (대 자세 / AgCl, KCl) 100 스캔 KPB에서 MV / s의 1. 삭제를 KPB에 잠재적인 윈도우를 포함한 "표준 약관"에 CV를 수행하여 세척 베어 금 기판의 충전 전류를 측정하고 린스 연속와 H 2 H 2 O UP O, 에탄올 (EtOH), 그리고 EtOH UP. </li><li> EtOH 5 MM의 C6 솔루션 ~ 300 μl로 청소 황금 기판을 폭로하고 주문 C6 SAM을 형성 밤새 앉아 수 있습니다. 세포에서 C6 솔루션을 취소하고 H 2 O, EtOH, 그리고 UP H 2 O. UP, EtOH로 연속 린스 </li><li> 표준 조건에서 SAM의 충전 전류를 측정합니다. KPB을 취소하고 H 2 H 2 O UP O, EtOH, 그리고 EtOH UP와 연속 린스. 충전 전류는 현저하게 베어 금 측정 (2.3 단계)의 감소에서해야 1. </li><li> EtOH에서 1,9 - nonanedithiol (뉴펀들랜드 서머 타임) 솔루션 5 mm의 ~ 300 μl에 SAM 수정된 골드 기판을 폭로하고 C6 SAM 내의 분자를 연결 interdisperse 뉴펀들랜드 서머 타임에 1 시간을 위해 앉아 수 있습니다. 뉴펀들랜드 서머 타임 솔루션을 취소하고 H 2 O UP H 2 O, EtOH, 그리고 메틸렌 클로라이드 (CH 2 망할 CIA 2) UP, EtOH로 연속 철저하게 린스. </li><li> 천천히 1 시간에 대한 N 2 가스 버블링하여 CH 2 MPC 솔루션 동요와 함께 망할 CIA 2 (~ 1 MG / ML)로 골드 기판을 폭로. 필요한 경우 더 CH이 망할 CIA 2 증발 MPC 솔루션을 교체하십시오. 이것은 영화 어셈블리의 고정 MPC 층입니다. MPC 솔루션을 폐기하고 다시 CH 2 H 2 O UP 망할 CIA 2 및 KPB와 연속 린스. </li><li> 표준 조건에서 MPC 층의 충전 전류를 측정합니다. KPB을 취소하고 H 2 O 및 CH 2 망할 CIA 두 UP와 연속 린스. </li><li> 천천히 20 분에 대한 N 2 가스 버블링하여 CH 2 교반과 망할 CIA 2 5 MM의 뉴펀들랜드 서머 타임 솔루션 ~ 300 μl에 금을 기판을 폭로. </li><li> 뉴펀들랜드 서머 타임과 CH 2 망할 CIA 2와 린스 철저하게 폐기하십시오. 영화 어셈블리의 두 번째 MPC 계층을 입금하는 단계 2.7 및 2.8을 반복합니다. </li><li> 추가 MPC 레이어, 단계 2.9과 2.10을 입금하기 위해서는 반복됩니다. 각 추가 MPC 계층과 충전 전류에 상응하는 증가가 관찰됩니다. </li><li> 네트워크 MPC 영화가 완료되면, KPB와 필름 수정 기판 린스. AZ 단백질은 echem 샌드위치 셀로 KPB의 ~ 5-10 μm의 AZ 솔루션 ~ 150 μL를 주입하고 뒤덮힌 최소한 1 시간을 위해 냉장 앉아 있도록하여 MPC 필름 조립에 adsorbed 수 있습니다. </li><li> 냉장고에서 echem 세포를 제거하고 근처 상온으로 돌아갑니다 수 있습니다. 철저하게 10 분에 대한 N 2 가스 KPB, KPB와 리필 echem 세포 및 거품 KPB와 린스. </li><li> 단백질 monolayer 전기 연구가 0.25로 -0.25 V에서 잠재 창에서 이력서로 수행되는 V (대 자세 / AgCl, KCl) 100 스캔 뮤직 비디오 / KPB에서 초. </li></ol> 3. 필름 조립 : 광학 추적 Dithiol 연결된 MPC 필름 조립 사전 광학 평가를위한 MPC 필름을 성장하는 유리 슬라이드 섹션은 피라 냐가 솔루션 (CAUTION! 2시 1분는 4 H 2 O 2 SO H 2 집중되어)로 사전 세척 및 (3 mercaptopropyl) trimethoxysilane (3 MPTMS로 취급됩니다 .) 1-2 MPC 필름은 다음 이러한 수정 유리에 모였습니다 이전에 위에서 설명한 "딥 사이클"기법을 사용하여 슬라이드. <ol><li> CH이 망할 CIA 2 3 MPTMS 수정 유리 슬라이드를 씻어과 낮은 속도로 흔드는에 agitating 동안 CH 2 MPC 솔루션 망할 CIA 2 (~ 1 MG / ML) 1 시간을 위해 그것을 놓으십시오. 이것은 실란의 mercaptans의 endgroups에 MPCs를 고정하여 영화 어셈블리의 첫 번째 MPC 레이어를 완료합니다. CH이 망할 CIA 2, N 2 가스로 건조와 철저하게 슬라이드를 씻어. 슬라이드의 UV - VIS 스펙트럼을 (400-1000 nm의에서) 가지고, CH 2 망할 CIA 2 다시 린스. </li><li> 낮은 속도로 흔드는에 agitating 동안 1 시간에 대한 채널이 망할 CIA 2 5 MM의 뉴펀들랜드 서머 타임 솔루션에있는 슬라이드를 삽입합니다. CH이 망할 CIA 2와 슬라이드를 씻어. </li><li> 낮은 속도로 흔드는에 agitating 동안 1 시간에 대한 MPC 솔루션에있는 슬라이드를 삽입합니다. 이것은 영화 어셈블리의 두 번째 MPC 레이어를 완료합니다. CH이 망할 CIA 2, N 2 가스로 건조와 철저하게 슬라이드를 씻어과 슬라이드의 UV - VIS 스펙트럼을 (400-1000 nm의에서) 받아. 추가 MPC 레이어는 필름 어셈블리에 adsorbed대로 스펙트럼에 걸쳐 흡광도가 증가한다. </li><li> 추가 MPC 레이어, 세인트를 입금EPS 3.2-3.3이 반복됩니다. </li></ol> 4. Monolayer의 특성은 교차 단면 전송 전자 현미경에 의한 골드 클러스터 필름 어셈블리를 보호 TEM 크로스 섹션이 다시 포함 EN 얼굴 임베디드 영화 2. 12 이것은 먼저 깨끗한 표준 현미경에 3 MPTMS 수정 유리 슬라이드에 조립 MPC 필름을 부착하여 이루어집니다 의해 준비가되어 있도록 퍼가기 812 에폭시 수지를 사용하여 슬라이드 아래의 절차를 수행하는 동안 처리를 향상되었습니다. 높은 온도가 영화 내에서 MPCs를 분해되므로 적용 열과 함께주의를 사용하십시오. <ol><li> 혼합 비율은 812 에폭시 수지를 삽입하고 적어도 12 시간에 대한 진하게 수 있습니다. </li><li> 에폭시 수지와 "00"BEEM 캡슐을 입력하고 MPC 필름 샘플 (섹션 3 준비)의 상단에 반전. 거품은 에폭시 수지와 MPC 필름 샘플 사이에 인감을 생성, 캡슐의 상단에 상승 있도록 캡슐에 장소 압력. 60 이상 18 시간을위한 중합 허용 ° C 그리고 실내 온도에 탑재된 슬라이드를 냉각. </li><li> 열 ° C 연결된 MPC EN 얼굴 영화와 블록의 제거를 용이하게하기 위해 200 주조 알루미늄 철판에서 20 초에 대한 슬라이드를 마운트. </li><li> 보석의 본을 사용하여 BEEM 캡슐 블록의 필름을 포함하는 샘플을 잘라요. </li><li> 물론 실리콘의 내부를 만나게 MPC 필름 면을 실리콘 아파트 금형에 다시 삽입 제거 부분. 실온에서 에폭시 수지와 잘 실리콘을 채워 60 적어도 18 시간을위한 중합 수 있도록 ° C. 실내 온도 샘플을 좋았어. </li><li> 칼의 가장자리에 수직 섹션을 잘라 다이아몬드 나이프를 사용하여 Leica UCT ultramicrotome에서 60-80 nm의 얇은 샘플 섹션을 구합니다. </li><li> 장소 formvar / 구리 그리드 (400 메쉬)에 탄소 지원 필름 섹션을 얇게하고 MPC 필름 어셈블리 준비 크로스 섹션의 TEM 이미지를 가져가라. </li></ol> 5. 대표 결과 : <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig1.jpg"> 5 마른주기 (MPC와 뉴펀들랜드 서머 타임 솔루션 노출을 교대)의 총 MPC 필름 성장 전류 모니터링 충전 1 개의 더블 레이어를 그림. 충전 전류는 (그림 2) 필름 MPC의 "레이어"를 추가, 각 수영 사이클과 함께 체계적으로 증가했다. 주기적 voltammograms는 V이 (대 자세 / AgCl, KCl) 4.4 MM의 인산 칼륨 버퍼에 MV / S (산도 = 7.0, μ = 10 ㎜) 100 스캔 0.1에서 0.4로 잠재적인 윈도우를 사용하여 수집되었습니다. ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB 마크, NT 로렌스, ML Trawick, 그리고 MC 레오폴드, Langmuir 26 일 (1), 560-569의 허가 Reprinted. 저작권 2010 미국 화학 학회. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig2.jpg"> 그림 2 dithiol 연결된 MPC 필름 어셈블리에 adsorbed AZ 단백질의 (A) 도식 표현. (B) MPC 필름 어셈블리에 adsorbed AZ에 대한 일반적인 순환 voltammogram는 V이 (대 자세 / AgCl, KCl) 4.4 MM의 인산 칼륨 버퍼 (산도가 = 7.0에서 100 MV / s의 스캔 -0.25에서 0.25로 가능성이 윈도우를 사용하여 수집 μ = 10 ㎜). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig3.jpg"> 3 MPTMS 수정 유리 슬라이드에 dithiol 연결된 MPC 영화 성장의 그림 3 UV - VIS 대표 스펙트럼 모니터링. 딥 사이클 링커 솔루션 MPC 솔루션에 노출을 따라 뉴펀들랜드 서머 타임에 유리 슬라이드의 노출로 구성되어 있습니다. 필름 두께의 성장과 동시 흡광도 증가의 각 후속 딥 결과입니다. 딥 사이클 증가로 표면 plasmon 밴드는 점차 ~ 520 nm의에서 정의됩니다. ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB 마크, NT 로렌스, ML Trawick, 그리고 MC 레오폴드, Langmuir 26 일 (1), 560-569의 허가 Reprinted. 저작권 2010 미국 화학 학회. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig4.jpg"> dithiol - 연결된 MPC 필름 어셈블리의 그림 4 전송 전자 현미경 (TEM) 교차 단면 이미지 분석. 삽입 : 영화 어셈블리에서 사용 hexanethiolate 작용 MPCs의 일반적인 TEM 이미지. TEM 분석 이미지 J 분석을 사용하여 ~ 2 nm의 수 MPCs의 평균 골드 코어 직경을 결정. ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB 마크, NT 로렌스, ML Trawick, 그리고 MC 레오폴드, Langmuir 26 일 (1), 560-569의 허가 Reprinted. 저작권 2010 미국 화학 학회.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

단백질 monolayer의 전기는 산화 환원 단백질과 합성 흡착 플랫폼 사이의 상호 작용을 연구하는 데 효과적인 기술이다. 이 전략의 효과 그러나, 분자 수준의 제어 높은 수준의 흡착 인터페이스를 엔지니어 수있는 능력에 따라 달라집니다. 이 프로토콜에서 만든 MPC 기반 플랫폼보다 동질적인 단백질 흡착 환경 세를 제공하고 alkanethiolate SAMs를 고용 전통 PME 시스템에 비해 더 멀리 둘 이상의 동부 표준시를 촉진하실 수 있습니다 특별히 설계 플랫폼을 나타냅니다. 전기 인터페이스와 MPC 영화 어셈블리의 장점은 다양한 크기 및 표면 화학 / 기능, 각종 다양한 nanomaterials하고,뿐만 아니라 다른 전극 구성의 다른 산화 환원 단백질의 다재 다능한하고 적응성이다. 예를 들어, 설명 절차는 쉽게 조립에 통합 MPCs의 가장 바깥쪽 레이어에 간단한 자리 교환 반응을 이용하여 시토크롬 C (cyt C)의 동부 표준시 연구에 적응합니다. cyt C가<...

<table border="1"><tr><th> 시약 및 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> Tetraoctylammonium의 브로마이드 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 294,136 </td></tr><tr><td> 나트륨 borohydride </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 213,462 </td></tr><tr><td> 수소 tetrachloroaurate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 254169 - 5G </td></tr><tr><td> 1 Hexanethiol </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 234,192 </td></tr><tr><td> 전송 전자 현미경 </td><td> JEOL </td><td> 1010 </td></tr><tr><td> 핵 자기 공명 분광계 </td><td> Bruker 이동한다 </td><td> 300 MHz의 </td></tr><tr><td> 구리 그리드 (400 메쉬)에 Formvar / 탄소 지원 필름 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> FCF400 - 잘라내기 </td></tr><tr><td> 골드 기판 </td><td> 증발 금속 영화 주식 회사 </td><td> 사용자 정의 </td></tr><tr><td> AG / AgCl 참조 전극 </td><td> Microelectrodes 주식 회사 </td><td> MI - 401F </td></tr><tr><td> Potentiostats </td><td> CH 인 스트 루먼트 주식 회사 </td><td> CHI650A, CHI610B </td></tr><tr><td> 1,9 - Nonanedithiol </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> N29805 </td></tr><tr><td> (3 mercaptopropyl) trimethoxysilane </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 175,617 </td></tr><tr><td> 자외선 분광 표시 </td><td> 애질런트 </td><td> 8453 </td></tr><tr><td> 퍼가기 812 에폭시 수지 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 14,120 </td></tr><tr><td> &quot;00&quot;BEEM 캡슐 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 70000 - B </td></tr><tr><td> 실리콘 몰드 플랫 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 70,900 </td></tr><tr><td> 다이아몬드 나이프 </td><td> Diatome </td><td> 21 ULE, S12801 </td></tr></table>

monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 monolayer의 전기에 대한 골드 nanoparticle 필름을 보호

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

콜로이드 골드는 단백질 monolayer의 전기 (PME)의 흡착 플랫폼 역할을 필름 어셈블리로 합성하고 이후 통합됩니다 monolayer 보호 금색 클러스터 (MPCs)라는 alkanethiolate 리간드로 보호 nanoparticles. PME는 전자 송금 (동부 표준시) 반응을위한 산화 환원 파트너로서 역할을 수정 전극에서 흡착 플랫폼을 confining하여 산화 환원 단백질의 전기 특성을 공부를위한 모델 시스템으로 활용됩니다. 연구는이 자연의 황금 nanoparticle 필름 어셈블리가 더 균일한 단백질 흡착 환경을 제공하고 alkanethiol 자기 조립 monolayers (SAM)로 수정보다 전통적인 시스템에 비해 거리 의존하지 않고 동부 표준시를 촉진하는 것으로 나타났습니다. 1-3이 종이 MPCs에서 hexanethiolate 리간드가 수정된 부르 스트 반응 4를 사용하여 합성 및 자외선 가시 (UV - VIS) 분광, 전송 전자 현미경 (TEM), 그리고 양자 (1 H) 핵 자기 공명 (NMR)과 특징과 작용. MPC 필름은 MPC의 레이어와 dithiol 연결 분자를 교대의 &quot;딥 사이클&quot;메서드를 사용하여 SAM 수정된 골드 전극 인터페이스에서 조립됩니다. 금 전극에 영화의 성장은 시스템의 전류를 충전 더블 레이어의 변경 사항을 측정하여 electrochemically 추적됩니다. 실란 수정된 유리 슬라이드에 조립 유사한 영화는 예상 필름 두께를 제공합니다 영화의 성장과 교차 단면 TEM 분석의 광학 모니터링하실 수 있습니다. 필름 조립하는 동안, MPC의 리간드 보호 조작뿐만 아니라 내부의 연동 메커니즘은 서로 다른 흡착 메커니즘을 가지고 산화 환원 단백질과 인터페이스, 쉽게 적응 아르 네트워크 필름에 대한 수 있습니다. 예를 들어, 모나스 녹농균이라는 박테리아 azurin (AZ)는 hexanethiolate MPCs 및 시토크롬 C (cyt C) MPC 계면 층을 수정 카르복실산에 electrostatically 움직일 수의 dithiol 링크된 영화에 hydrophobically adsorbed 수 있습니다. 이 보고서에서는, 우리는 독점적 AZ 시스템 필름 프로토콜에 중점을두고 있습니다. MPC 플랫폼에서 수정된 합성 단백질의 흡착과 관련된 조사는 biomolecules과 인간이 만든 물질 사이의 상호 작용에 대한 이해를 더하고, 결과적으로 바이오 센서 구조, 동부 표준시 모델링 시스템 및 합성 biocompatible 물질의 개발을 원조 수 있습니다. 5-8

monolayer 보호 클러스터 (MPCs)로 알려진 Alkanethiolate 안정화 황금 colloids은 합성 특징과 같은 간단한 산화 환원 단백질의 단백질 monolayer의 전기에 대한 흡착 인터페이스로 박막에 모였습니다<em&gt; 녹농균</em&gt; azurin (AZ)와 시토크롬<em&gt; C</em&gt; (cyt<em&gt; C</em&gt;).

Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호

알칸티올레이트(alkanethiolate) 리간드로 보호된 콜로이드 금 나노입자인 단분자층 보호 금 클러스터(monolayer protected gold clusters, MPCs)를 합성한 후...

다음 실험의 전체적인 목표는 단층 보호 클러스터(monolayer protected clusters, MPCs)로 알려진 알킬레이트 안정화 금 나노입자를 합성하고, 이러한 재료를 아자린 단백질 단층 전기화학의 흡수 인터페이스로 사용되는 박막 어셈블리로 조립하는 것입니다. 이는 먼저 유기 리간드로 금 콜로이드를 보호하여 알칸 포스페이트(Alcan Pholate) 막으로 둘러싸인 금 나노입자를 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, MPC를 금 및 유리 기판에 고정하고 공유 결합으로 연결된 다층 박막으로 네트워크화하며, 그 성장은 광학 및 전기화학적 측정과 단면 현미경 분석을 통해 추적합니다.그 다음, 전자 전달 단백질인 azarin을 계면에 흡착시키고 단백질 단분자층 전기화학 분석을 위해 순환 전압전류법(cyclic voltammetry)을 수행합니다. 결과에 따르면, 이 절차로 생성된 MPC 필름 계면은 MPC 필름을 기반으로 흡착된 단백질의 더욱 최적화된 전기화학적 분석을 가능하게 하며, 더 균질한 흡착 계면과 전통적인 거리 의존성이 없는 빠른 전자 전달 속도를 제공합니다. 전통적인 단백질 전기화학 분석과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 나노입자 필름으로 수식된 전극이 순환 전압전류법으로 측정 시 더욱 이상적인 전기화학적 거동을 보이는 흡착 계면을 제공한다는 점입니다.합성 과정에는 중요한 시각적 신호가 포함되어 있고, 박막 구축 및 특성 분석에는 여러 복잡한 단계와 분석 기술이 수반되므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. NPC 박막은 MPC 층과 이작용기 연결 분자를 교대로 사용하는 딥 사이클(dip cycle) 방법을 통해 변형된 금 전극 또는 유리 슬라이드 위에 조립될 수 있습니다. 결과적으로, 이러한 층들은 원하는 박막 두께에 도달할 때까지 전기화학적 또는 광학적으로 추적할 수 있습니다.적절한 환기 시설이 갖춰진 흄 후드 내에서 금 클러스터를 합성하기 위해, 먼저 tetra oxide ammonium bromide 1.1 g을 toluene 30 mL에 녹입니다. sodium borah hydride 0.38 g을 약 18 mega ohms 초순수 20 mL에 녹인 후, 얼음 위에서 최소 30분 동안 냉각시킵니다. 다음으로, 초순수 5 mL를 추가로 사용하여 hydrogen tetra chloro orating water 용액을 tetra ide ammonium bromide toluene 용액으로 정량 전이합니다. 수용성 금 용액을 비수성 용액으로 상전이시키기 위해, 캡을 가볍게 닫고 30분 동안 격렬하게 교반합니다.따라서 진한 오렌지색의 수층과 투명한 비수층이 잘 혼합됩니다. 투명한 수층과 진한 오렌지색의 비수층을 모두 분별 깔때기로 옮깁니다. 수층은 버리고 비수층은 깨끗한 플라스크에 데칸테이션하여 옮깁니다.수소 tetrachloroaurate를 포함하는 비수성 용액에 C six를 2:1의 비율로 첨가합니다. 붉은 오렌지색에서 옅은 노란색의 거의 무색인 용액으로 색이 변하며 gold one 폴리머가 형성될 때까지 30분 동안 교반합니다. 반응 혼합물을 단열 얼음 수조로 옮기고 교반하며 0 °C에서 최소 30분 동안 냉각합니다. thighs가 존재하는 상태에서 gold one을 금속 금으로 환원시키기 위해, 냉각된 sodium borohydride 용액을 반응 혼합물에 정량적으로 빠르게 첨가합니다.첨가 즉시 단분자층 보호 금 클러스터(monolayer protected gold clusters, MPCs)의 진한 검은색 용액이 형성됩니다. 다음 날까지 0 °C에서 밤새 반응물을 교반하십시오. 반응 혼합물을 분별 깔때기로 옮깁니다.수층은 폐액 비커에 버리고 회전 증발기로 처리하십시오. 비수성 톨루엔 층을 거의 완전히 건조될 때까지 증발시키면 플라스크에 진한 검은색 슬러지가 남습니다. 아세토니트릴을 첨가하여 MPC를 침전시키고, 고무 피팅이 달린 중간 기공도의 글래스 프리트와 아스피레이터가 연결된 사이드암 플라스크를 사용하여 용액을 하룻밤 동안 방치하십시오.진공 여과를 통해 MPC를 수집하고 다량의 acetonitrile으로 헹굽니다. 샌드위치 셀을 전기화학적으로 조립한 후, 0.1 M 황산과 0.01 M 염화칼륨 용액 내에서 100 mV/s의 속도로 0.2~0.9 V, 0.2~1.2 V 및 0.2~1.35 V의 전위 창에서 순환 전압-전류법(CV)을 수행하여 금 기판을 세척합니다. 인산칼륨 완충액(KPB) 내에서 Ag/AgCl 대비 0.1~0.4 V의 전위 창을 100 mV/s로 스캔하는 표준 조건에서 CV를 수행하여, 세척된 순수 금 기판의 전기 이중층 충전 전류를 측정합니다.완충액을 버리고 초순수와 에탄올로 두 번 충분히 헹굽니다. 세척된 금 기판을 에탄올에 녹인 5 mM C six 용액 약 300 µL에 노출시킨 후, 정렬된 C six SAM이 형성되도록 하룻밤 동안 방치합니다. 셀에서 C six 용액을 버리고 에탄올과 초순수로 두 번 충분히 헹굽니다.표준 조건에서 SAM의 충전 전류를 측정합니다. KPB를 버리고 초순수와 에탄올로 두 번 충분히 헹굽니다. 충전 전류가 현저히 감소해야 합니다.순수 금 측정 단계 이후, SAM으로 수식된 금 기판을 에탄올에 녹인 5 mM NDT 용액 약 300 µL에 노출시키고 1시간 동안 방치하여 C6 SAM 내에 NDT 연결 분자들이 상호 분산되도록 합니다. NDT 용액을 제거하고 에탄올과 초순수로 각각 두 번씩 충분히 헹군 다음, 다이메테인(diam methane)으로 한 번 더 헹굽니다. 질소 가스를 천천히 버블링하여 교반하면서 금 기판을 다이메테인 기반의 MPC 용액에 1시간 동안 노출시킵니다.이것은 필름 어셈블리의 앵커링 MPC 층입니다. MPC 용액을 버리고 다시 디클로로메탄, 초순수 및 KPB로 순차적으로 헹굽니다. 표준 조건에서 MPC 층의 충전 전류를 측정합니다.KPB를 버리고 초순수와 DIAM methane으로 충분히 헹굽니다. 금 기판을 5 mM NDT DIAM methane 용액 약 300 µL에 노출시킨 후, 질소 가스를 천천히 버블링하며 20분 동안 교반합니다. NDT를 버리고 DIAM methane으로 철저히 헹구어 두 번째 MPC 층을 증착합니다.필름 어셈블리를 DIAM methane의 MPC 용액에 다시 담그고, 질소 가스를 천천히 버블링하여 1시간 동안 교반하며 방치합니다. 그 후, 표준 조건에서 MPC 층의 충전 전류를 다시 측정하고 동일한 절차를 사용하여 다시 헹굽니다. 필요한 경우 MPC 층을 추가로 증착합니다.네트워크화된 MPC 필름이 완성되면, MPC 필름 어셈블리에 AZ 단백질을 흡착시키기 위해 KPB로 변형된 기판을 헹굽니다. KPB에 녹인 5~10 µM 농도의 AZ 용액 약 150 µL를 E chem 샌드위치 셀에 주입하고, 캡을 닫은 상태로 냉장 보관하며 최소 1시간 동안 방치합니다. ECM 셀이 실온으로 돌아오면 KPB로 충분히 헹군 뒤, ECM 셀을 KPB로 다시 채우고 질소 가스로 10분 동안 버블링합니다.-0.25 V에서 0.25 V 사이의 전위 창에서 CV와 같은 단층 전기화학 연구를 수행합니다. DIAM methane으로 수정된 KPB Rinse A 3M PT MS 유리 슬라이드를 초당 100 mV의 속도로 스캔하고, 이를 저속 쉐이커로 교반하며 DIAM methane의 MPC 용액에 1시간 동안 담가둡니다. 이 과정을 통해 sane의 ME captan 말단 그룹에 MPC가 고정되어 박막 조립의 첫 번째 MPC 층이 완성됩니다.슬라이드를 디메틸메탄으로 충분히 헹구고, 질소 가스로 건조시킨 후, 디메틸메탄 내의 NDT 용액에 슬라이드를 담근 후 UV-vis 스펙트럼을 측정합니다. 슬라이드를 MPC 용액에 넣고 쉐이커에서 저속으로 흔들어주며 1시간 동안 반응시킵니다. 이로써 필름 어셈블리의 두 번째 MPC 층 형성이 완료됩니다.슬라이드를 DIAM 메탄으로 충분히 헹구고, 질소 가스로 건조시킨 후 슬라이드의 UV-vis 스펙트럼을 측정합니다. 필름 어셈블리에 MPC 층이 추가로 흡착됨에 따라 스펙트럼 전반의 흡광도가 증가해야 합니다. 3M PT MS로 수식된 유리 슬라이드 위에 조립된 MPC 필름을 표준 현미경 슬라이드에 부착합니다.에폭시 수지 embed eight 12를 준비하고 최소 12시간 동안 점도가 높아지도록 둡니다. 빔 캡슐을 에폭시 수지로 채운 후 MPC 필름 샘플 위에 뒤집어 놓습니다. 캡슐에 압력을 가해 기포가 캡슐 상단으로 올라오게 하여, 에폭시 수지와 MPC 필름 샘플 사이에 밀봉 상태를 형성합니다.60°C에서 최소 18시간 동안 중합시킨 후, 마운팅된 슬라이드를 실온으로 냉각합니다. 패스트 필름에 부착된 MPC가 포함된 블록을 쉽게 제거하기 위해, 200°C의 알루미늄 주조 핫플레이트에서 마운팅된 슬라이드를 20 seconds 동안 가열합니다. 보석용 톱을 사용하여 빔 캡슐 블록에서 필름이 포함된 샘플을 잘라내고, 제거된 부분을 MPC 필름 면이 실리콘 내부를 향하도록 위로 하여 실리콘 평면 몰드에 넣습니다.실리콘 웰을 상온에서 에폭시 수지로 채우고 60 °C에서 최소 18시간 동안 중합시킵니다. 그 후 샘플을 상온으로 냉각합니다. 다이아몬드 나이프를 사용하여 Leica UCT 울트라 마이크로톰으로 나이프 날과 수직이 되도록 60에서 80 nm 두께의 얇은 샘플 섹션을 절단합니다. 절단된 섹션을 400 mesh 구리 그리드 위의 Formvar 카본 지지 필름 위에 올리고, 표시된 MPC 필름 어셈블리의 단면 TEM 이미지를 촬영합니다.MPC와 NDT 용액에 교대로 노출시키는 총 5회의 침지 사이클을 통한 MPC 박막 성장의 이중층 충전 전류 모니터링 결과입니다. 충전 전류는 각 침지 사이클마다 체계적으로 증가합니다. 이는 박막에 MPC 층이 추가되고 있음을 나타냅니다.여기에 4.4 mM 인산칼륨 완충액에서 -0.25V에서 +0.25V의 전위 창을 사용하여 100 mV/s로 스캔하여 수집한 MPC 필름 어셈블리에 대한 전형적인 순환 전압-전류 곡선(cyclic voltammogram)이 제시되어 있습니다. 3M PT MS로 수정된 유리 슬라이드 상에서 디올 결합 MPC 필름 성장을 모니터링한 대표적인 UV-vis 스펙트럼이 여기에 표시되어 있습니다. 딥 사이클(dip cycle)은 유리 슬라이드를 NDT 링커 용액에 노출시킨 후, 이어서 MPC 용액에 노출시키는 과정으로 구성됩니다.이후 딥핑을 반복할 때마다 박막의 두께가 증가하며 이에 따라 흡광도가 동시에 증가합니다. 이 그림은 DIA가 결합된 MPC 필름 어셈블리의 투과 전자 현미경 단면 이미지 분석 결과를 보여줍니다. 삽입도는 필름 어셈블리 TEM 분석에 사용된 hexa methol 기능화 MPC의 전형적인 TEM 이미지를 보여줍니다.Image J를 사용하여 MPC의 평균 금 코어 직경을 측정한 결과 약 2 nm인 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 산화환원 단백질의 흡착 및 후속 전기화학 분석을 위한 인터페이스 역할을 하는 MPC 금 나노 입자 박막을 합성, 특성 분석 및 조립하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 박막 조립 공정은 MPC 합성 절차와 내부 입자 연결 메커니즘을 조절함으로써 다양한 종류의 단백질 흡착에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다.이 방법은 변형된 합성 플랫폼에 대한 단백질 흡착의 전기화학적 특성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 전자 전달 모델링 시스템, 바이오센싱 체계 및 합성 생체 적합성 재료의 개발에도 적용될 수 있습니다.

synthesis-assembly-characterization-monolayer-protected-gold

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 스텐실 인쇄 및 석판뿐만 아니라 미세하게 패턴에 대한 배양 세포에 방법을 통해 micropattern과 나노 다공성 금 박막에 대한 기술을보고합니다. 또한, 우리는 물질과 주사 전자 및 형광 현미경 기술을 이용하여 배양 된 세포의 형태를 특성화하는 이미지 분석 방법을 설명합니다.

세포 물질의 상호 작용 연구를위한 나노 기공 골드 패턴의 미세

템플릿 무료 기판에 거시적 인 나노 입자 - 리간드 단층 영화를 기능화 및 자기 조립, 단순 강력하고 확장 성있는 기술은이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

템플릿이없는 기판에 육안 나노 입자 - 리간드 단층 필름을 기능화 및 자기 조립 기술

CdS 또는 ZnS의 반도체 쉘로 코팅된 균일한 금 나노 입자의 합성이 수행됩니다. 반도체 코팅은 먼저 황화은 쉘을 증착하고 은 양이온을 아연 또는 카드뮴 양이온으로 교환하여 수행됩니다.

합성, 특성 및 하이브리드 금 / CD 및 금 /은 ZnS 코어 / 쉘 나노 입자의 작용 화

실버 나노 큐브와 하위 10 나노 갭 플라즈몬 나노 크기의 패치 안테나의 제조의 콜로이드 합성을위한 프로토콜을 제시한다.

플라즈몬과 나노 포토닉스의 응용 프로그램에 대한 Nanopatch 안테나의 콜로이드 합성

우리는 콜 로이드 석판 기법을 사용 하 여 정기적 금 nanocup 배열의 제조를 설명 하 고 nanoplasmonic 영화의 중요성을 논의.

콜 로이드 리소 그래피를 사용 하 여 정기적 금 Nanocup 배열의 제작

이 프로토콜 세부 큰 지역에 따라 제어 하 고 사용자 정의 나노 영화를 만들기 위해 사용할 수 있는 새로운 나노 제조 기술에서 출장 금속 필름의 dewetting의 자기 조립.

큰 면적 기판 기반 Nanofabrication 출장 Dewetting 통해 제어 하 고 사용자 정의 금 나노 입자의

양과성 금 나노 입자는 많은 생물학적 응용 프로그램에서 사용될 수있다. 리간드의 이진 혼합물에 의해 코팅된 금 나노입자를 합성하는 프로토콜과 이들 입자의 상세한 특성화가 제시된다.

합성 및 암화 금 나노 입자의 특성화

여기, 우리는 예를 들어 시 토 크롬 보3  를 사용 하 여 단일 리의 지질 막에 걸쳐 양성자 전 좌의 분자 메커니즘을 연구 하는 프로토콜 제시. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법, 단일 소포, 포함 하는 단일 또는 여러 효소의 루멘에서 pH 변화를 결합 수 있습니다 감지 되며 개별적으로 분석.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

이 작업은 레이저 조사 금 나노 입자에서 tBLM으로의 열 전달의 동적 비 침습적 모니터링을 달성하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 시스템은 tBLM 전반에 걸쳐 전도도 변화의 실시간 측정을 위해 임피던스 분광기를 결합하고, 열 생산을 위해 금 나노 입자 조명을 구동하는 수평 집중 레이저 빔을 결합합니다.

금 나노 입자와 지질 막 사이의 열 전달을 모니터링하는 테더링 된 바이 레이어 지질 멤브레인

유기 용매에서 ~12nm 직경의 금 나노 입자 (Au 나노 입자)를 합성하기위한 프로토콜이 제시된다. 금 나노 입자는 응집을 방지하기 위해 올리라민 리간드로 덮여있다. 금 나노 입자는 톨루엔과 같은 유기 용매에서 용해됩니다.

금 나노 입자 합성

본 프로토콜은 새로운 자가핵형성 억제 메커니즘 기반 금 나노입자 합성 기술을 사용하여 세포에서 메탈로티오네인 태그가 부착된 단백질을 검출하기 위한 클로너블 전자 현미경 표지 기술을 설명합니다.

잘 보존된 미세 구조를 가진 단백질 국소화 분석을 위한 세포에서 EM-Visible Gold Nanoparticles의 직접 합성

배우세요 단층 보호 클러스터(MPC) 합성 및 박막 조립을 통한 단백질 전기화학 분석법을 알아보세요. 금 나노입자 기반 전극 계면에서 아주린 및 사이토크롬 c의 전자 이동 역학을 연구하는 혁신적인 기술입니다.

Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호

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