분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 효모 세포 내의 핵 하부 구조를 정량적으로 측정하고, 성장 조건의 변화나 돌연변이에 의해 이것이 어떤 영향을 받는지를 확인하는 것입니다. 이를 위해 자동형광을 최소화하는 조건에서 효모 세포를 대수 성장기까지 배양합니다. 그 다음, 세포를 성장 챔버에 넣어 현미경으로 관찰합니다.

그 후, 세포 내 서로 다른 형광 표지 구조 간의 거리를 측정하기 위해 이미지를 촬영합니다. 이를 통해 효모 배양 과정 중 영양 조건의 변화에 따라 비핵 조직에 차이가 발생한다는 결과가 도출됩니다. 이 방법은 서브핵 조직 또는 염색질과 유전자 조절 사이의 상호작용에 관한 후성유전학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

물고기 및 효모 실험은 먼저 에든버러 최소 배지(Edinburgh minimal medium, EMM) 또는 자가 형광을 줄이기 위해 염화암모늄이 첨가된 EMM을 준비하는 것으로 시작하며, 이때 고압증기멸균(autoclave) 대신 다른 방법을 사용합니다. 0.2 µm 필터를 사용하여 포도당 용액을 멸균한 후, 고압증기멸균된 배지에 첨가합니다. 30 mL 튜브에 담긴 3 mL의 EMM에 물고기 및 효모 세포를 접종합니다.

YEA 풍부 배지가 도포된 한천 배지에서 갓 배양한 세포를 튜브에 넣고 캡을 가볍게 닫은 후, 225 RPM, 30 °C의 진탕 배양기에서 배양합니다. 매일 아침과 저녁으로 birka chamber를 이용하여 세포 수를 측정하고 적절한 밀도로 희석함으로써, 이틀 동안 세포를 로그 성장기(log phase) 상태로 유지합니다. 실험 당일에,

세포는 질소 결핍 상태의 초기 로그 단계(early log phase)여야 합니다. 서면 프로토콜에 설명된 절차에 따라, 먼저 튜브를 2분간 원심분리한 후 180도 회전시켜 추가로 2분간 원심분리하여, 1.5 mL Eppendorf 튜브 바닥에 세포를 하나의 펠렛으로 수집하십시오(최대 1.5 RCF). 상층액을 10~15 µL만 남기고 모두 제거한 후, 남은 배지에 세포를 재부유시키고 1 mg/mL 농도로 필터 멸균된 렉틴(lectin) 분주액을 첨가하십시오.

커버 글라스의 모서리에 렉틴 용액 5 µL를 가하고, 렉틴 방울에 배양액 5 µL를 추가합니다. S pom 기저 세포의 성장 챔버를 만들기 위해, 깨끗한 슬라이드 위에 EMM 5 µL를 피펫으로 분주하고 배양액이 담긴 커버 글라스를 배지 위로 70도 각도로 기울여 뒤집은 다음, EMM 위로 수직으로 떨어뜨려 실리콘 그리스로 가장자리를 밀봉합니다. 200 µL 팁의 넓은 쪽 끝을 자르고 좁은 쪽 끝을 2 mL 주사기에 부착합니다.

주사기에 실리콘 그리스를 약 1ml 채웁니다. 주사기의 피스톤을 부드럽게 밀어 커버글라스의 가장자리에 실리콘을 얇게 도포하여 배양 챔버를 밀봉합니다. 먼저 명시야 이미징(Brightfield Imaging)을 사용하여 세포의 위치를 찾고 굴착을 시작합니다.

공초점 현미경을 위한 선명한 이미지를 얻습니다. Plan Apochromat 63배 오일 대물렌즈와 16라인 평균 평면 스캔 설정이 적용된 Zeiss LSM 700 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다. 0.8 µm의 광학 절편을 얻기 위해 영역 단위를 1:1.1로 설정합니다.

Alexa 488 및 mCherry 또는 GFP를 검출하는 레이저로 세포를 스캔하십시오. 각 배수구당 60개의 세포를 측정할 수 있도록 충분한 이미지를 기록하십시오. 신선한 세포가 들어 있는 새로운 배양 챔버로 교체하십시오.

60분 동안 이미징을 수행한 후, Zeen Light Edition 프로그램을 사용하여 이미지를 열고 동일한 초점 평면 내 서로 다른 형광체 신호 사이의 거리를 측정합니다. 측정 도구를 열고 빛의 강도와 대비를 조절하여 방추사 극체와 핵막과 같은 각 형광 신호의 중심을 확인한 다음, 그 사이의 거리를 측정합니다. 측정된 데이터를 메모장 시트로 옮깁니다.

T-검정이나 맨-휘트니 순위합 검정(Mann-Whitney Rank sum test)과 같은 통계 소프트웨어 또는 검정 방법을 사용하여 서로 다른 균주 및 처리군 간의 세포 내 거리 평균값 또는 중앙값을 비교하십시오. 본 예시에서는 PJ 1 18 5 균주를 EMM에서 배양한 후, 샘플을 이미징을 위해 성장 챔버에 넣었습니다. 그다음 PJ 1 18 5의 일부 분취액을 사용하였습니다.

배양액을 EMMN으로 옮기고 15분 동안 배양한 후, 샘플을 이미징을 위한 성장 챔버에 넣었습니다. 측정 도구를 사용하여 궤적과 방추사 극체 사이의 거리 및 궤적과 핵막 사이의 거리를 측정했습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 질소 결핍 세포에서는 질소가 있는 상태에서 성장한 세포와 비교했을 때, 유전자 클러스터가 핵막에서 멀어져 방추사 극체 쪽으로 이동하는 거리에 통계적으로 유의미한 차이가 있었습니다.

GFP와 SBP 사이의 거리를 측정한 데이터는 정규 분포를 보였으므로, T-test를 사용하여 평균 거리를 비교할 수 있었습니다. 두 평균값 사이에 유의미한 차이가 있었습니다. GFP와 NM 사이의 거리를 측정한 데이터는 정규 분포를 보이지 않았으므로, Mann-Whitney 순위합 검정을 사용하여 중앙값 거리를 비교했습니다.

이 절차를 수행한 결과, 두 중앙값 사이에 유의미한 차이가 있었습니다. 유전자 발현 수준이 핵 내 구조의 변화와 어떻게 상관관계가 있는지에 대한 추가적인 질문에 답하기 위해 실시간 PCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.