분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 효모 세포의 핵 하부 조직과 성장 조건 또는 돌연변이의 변화에 의해 어떻게 영향을 받는지 정량적으로 측정하는 것입니다. 이는 효모 세포를 성장시켜 자가형광을 최소화하는 조건에서 위상을 기록함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포를 현미경으로 볼 수 있도록 성장 챔버에 넣습니다.

그런 다음 세포에서 서로 다른 형광 표지 구조 사이의 거리를 측정하기 위해 이미지를 촬영합니다. 비핵 조직의 차이를 보여주는 결과가 얻어졌으며, 이는 효모 배양의 성장 중 영양 조건의 변화에 따라 달라집니다. 이 방법은 subar 조직 또는 염색질과 유전자 조절 사이의 상호 작용에 대한 epie 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Toul 생선 및 효모는 오토클레이브가 아닌 자가형광을 줄이기 위해 염화암모늄과 함께 Edinburgh 최소 배지 또는 EMM 및 EMM을 준비하는 것으로 시작합니다. 0.2 미크론 필터를 사용하여 포도당 용액을 멸균하고 오토클레이브 매체에 추가합니다. 30ml 튜브에 3ml의 EMM을 물고기와 효모 세포로 접종합니다.

풍부한 배지의 한천 플레이트에서 갓 자란 YEA는 튜브를 가볍게 덮고 225 RPM 및 30 °C의 셰이커에서 세포를 배양합니다. 매일 아침과 저녁에 버카 챔버로 세포를 세고 적절한 밀도로 희석하여 이틀 동안 세포를 로그 상태로 유지합니다. 실험 당일.

세포는 질소 직원에게 초기 로그 단계여야 합니다. 세포는 서면 프로토콜에 설명된 절차를 말하며, 먼저 튜브를 2분 동안 회전시킨 다음 180도 회전하여 추가로 2분 동안 회전하여 튜브 원심분리기 바닥에 있는 하나의 펠릿, 최대 1.5RCF의 eend orph tube에 1.5ml의 세포를 수집합니다. 10 내지 15 마이크로리터의 상층액을 제외한 모든 물질을 제거하고 나머지 배지에 세포를 재현탁시키며, 이는 1밀리리터 필터의 분취량으로 멸균된 렉틴입니다.

커버 유리의 모서리에 5마이크로리터의 렉틴 용액을 추가하고 렉틴 드롭에 5마이크로리터의 배양을 추가합니다. S pom base cell의 성장 챔버를 만들려면 깨끗한 슬라이드에 5마이크로리터의 EMM을 피펫팅하고 배지 위에 70도 각도로 배양액이 있는 커버 유리를 뒤집고 EMM에 위에서 아래로 떨어뜨려 가장자리를 실리콘 그리스로 밀봉합니다. 200마이크로리터 팁의 넓은 쪽 끝을 자르고 좁은 쪽 끝을 2밀리리터 주사기에 부착합니다.

주사기에 약 1ml의 실리콘 그리스를 채웁니다. 주사기의 피스톤을 부드럽게 밀어 커버 유리의 가장자리에 미세한 실리콘 선을 바르고 성장 챔버를 이미지화합니다. 먼저 Brightfield Imaging을 사용하여 세포를 찾고 발굴합니다.

컨포칼 현미경 검사를 위한 선명한 사진을 얻을 수 있습니다. 우리는 플랜 아포치 크로맷 63배 오일 대물 렌즈와 16라인 평균 평면 스캔 설정을 갖춘 Zeiss LSM 700 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다. 면적 단위를 1에서 1.1로 설정하여 0.8미크론의 광학 슬라이스를 얻습니다.

Alexa 4 88 및 mCherry 또는 GFP를 감지하는 레이저로 셀을 스캔합니다. 각 드레인에 대해 60개의 셀에서 측정을 수행하기에 충분한 이미지를 기록합니다. 새로운 세포가 있는 새로운 성장 챔버로 전환합니다.

60분 동안 이미징한 후 Zeen Light Edition 프로그램에서 이미지를 열어 동일한 초점면에서 서로 다른 형광단의 신호 간 거리를 측정합니다. 측정 도구를 열고 광도와 대비를 조정하여 각 형광 신호의 중심(예: 스핀들 극체 및 핵막)을 식별하고 이들 사이의 거리를 측정합니다. 데이터를 메모장 시트로 전송합니다.

통계 소프트웨어 또는 T-검정 또는 Man Whitney Rank 합계 검정과 같은 검정을 사용하여 서로 다른 균주와 치료 간의 평균 또는 중앙값 세포 내 거리를 비교합니다. 이 예시에서, 균주, PJ 1 18 5는 EMM에서 성장되었고, 샘플은 이미징을 위해 성장 챔버에 배치되었다. 그런 다음 PJ 1 18 5의 분수.

배양물을 EMMN으로 옮기고 15분 동안 배양한 후 이미징을 위해 샘플을 성장 챔버에 넣었습니다. 측정 도구는 궤적과 스핀들 극체 사이, 궤적과 핵막 사이의 거리를 측정하는 데 사용되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 질소가 부족한 세포에서 핵막에서 방추극체로 이동하는 유전자 클러스터가 질소에서 성장한 세포와 비교하여 통계적으로 유의미한 차이가 있었습니다.

GFP와 SBP 사이의 거리를 측정하는 데이터는 정규 분포를 가졌으므로 평균 거리는 T-검정을 사용하여 비교할 수 있습니다. 두 평균값 사이에는 상당한 차이가 있었습니다. GFP와 NM 사이의 거리를 측정하는 데이터는 정규 분포를 갖지 않았으므로 중앙 거리는 man Whitney 순위 합계 테스트를 사용하여 비교되었습니다.

이 절차에 따라 두 중앙값 사이에 상당한 차이가 있었습니다. 유전자 발현 수준이 핵 이하 조직의 변화와 어떤 상관 관계가 있는지에 대한 추가 질문에 답하기 위해 Real-Time PCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.