단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 세포 수준에서 mitogen activated protein 발현량을 정량화하는 것입니다. 이를 위해 STL1 프로모터의 제어를 받으며 hog1 map kinase의 활성화에 특이적인 형광 발현 리포터 quadruple Venus를 보유한 효모 균주를 제작하였습니다. 형광 단백질 발현은 실시간 형광 관찰을 용이하게 하기 위해 현미경 상에서 세포에 직접 스트레스를 가하는 살아있는 세포 현미경 분석법이나, 마이크로 튜브에서 세포에 스트레스를 가한 후 특정 시점에 단백질 합성을 차단하는 유세포 분석법을 통해 정량화할 수 있습니다.

cyclo heximide를 첨가하면 라이브 셀 현미경으로 한 번에 소수의 세포만 분석할 수 있지만, 개별 세포의 운명을 직접 관찰하고 다른 세포 특성과 상관관계를 분석할 수 있습니다. 반면, 유세포 분석법은 한 번에 수많은 세포에서 mitogen activated protein 발현을 평가할 수 있게 해줍니다. 이 방법은 유전자 발현 조절에 어떤 단백질이 관여하는지와 같은 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 비록 이 방법이 효모 경로에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 적절한 리포터(Reporter)의 가용 여부에 따라 다른 신호 전달 폭포(signaling cascade)에도 적용될 수 있습니다.

라이브 셀 현미경 관찰을 위해 세포를 준비하려면, 먼저 5 mL의 합성 배지에 효모를 접종한 후 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 하룻밤 배양한 배양액의 OD 600을 측정하고, 이를 5 mL의 합성 배지로 희석하여 OD 600이 0.05가 되도록 맞춥니다. 희석된 배양액을 30 °C에서 최소 4시간 동안 더 배양합니다.

다음으로, 갓 준비한 covalent a 용액 약 200 µL를 웰 슬라이드에 필터링하여 넣습니다. 30분 후, con a 용액을 제거하고 웰에 물 150 µL를 추가합니다. 이제 물을 제거하고 세포를 준비하는 동안 웰을 건조시킵니다.

세포 배양액의 OD 600을 다시 측정한 후, 세포를 희석하여 1.5 milliliter 마이크로 튜브에 OD 600이 0.02인 세포 배양액 300 microliters가 되도록 분주합니다. 워터 배스에서 45초 동안 세포를 초음파 처리합니다. 마이크로 튜브를 짧게 볼텍싱한 후, 다시 한번 초음파 처리와 볼텍싱을 반복합니다.

이제 웰 슬라이드에 세포 200 µL를 추가하고, 세포가 웰 바닥에 가라앉을 때까지 약 30분 동안 기다린 후 슬라이드를 현미경 위에 놓습니다. 다음으로, 기록할 형광 채널과 두 개의 명시야 이미지를 위한 조명 설정을 선택하며, 적절한 세포 분할(segmentation)이 가능하도록 명시야 설정 중 하나를 초점 평면보다 약 3 µm 아래로 조정합니다. 그런 다음 타임랩스 측정을 위한 시간 간격을 설정하고 이미징을 위한 시야(field of view)를 선택합니다.

이제 몇 프레임 동안 획득을 시작한 다음, 획득을 일시 중지하고 갓 준비한 0.6 molar 염화 나트륨 배지 100 µL를 첨가하십시오. 그 후 이미징을 재개하여 유세포 분석 측정을 위해 세포를 준비합니다. 먼저 5 mL의 합성 배지에 효모를 접종하고 30 °C에서 밤새 배양하십시오. 다음 날 아침, 밤새 배양한 배양액의 OD 600을 측정한 후, 세포 현탁액을 5 mL의 합성 배지에 희석하여 OD 600을 0.1로 맞춥니다.

배양액을 30 °C에서 최소 4시간 동안 배양하여 OD 600 값이 0.2에서 0.4에 도달하도록 합니다. 그 다음, 시간 0에서 측정할 각 시점별로 1.5 mL 마이크로 튜브에 갓 조제한 0.6 M 염화나트륨 100 µL를 넣습니다. 각 마이크로 튜브에 세포 200 µL를 첨가하고 30 °C에서 흔들어 섞으며 배양합니다.

그 다음, 각 실험 시점마다 신선하게 준비한 cyclo heximide 30 µL를 마이크로 튜브 하나에 첨가합니다. 마이크로 튜브를 배양하는 동안, 각 마이크로 튜브에 대응하는 팍스 튜브(fax tube) 하나에 PBS 400 µL를 첨가합니다. 배양이 끝난 후, 마이크로 튜브를 짧게 볼텍싱하고, 방금 시연한 것처럼 워터 배스(water bath)에서 1분 동안 세포를 초음파 처리합니다.

그런 다음 각 마이크로 튜브에서 100 µL의 세포 배양액을 유세포 분석기의 해당 팩스 튜브에 넣습니다. 적절한 들뜸 및 검출 설정을 로드하고, 발현되지 않은 샘플과 완전히 발현된 샘플을 테스트하여 검출기 감도 범위 내에 있는지 확인합니다. 마지막으로, 각 샘플에 대해 10,000개의 세포를 측정하는데, 이때의 이미지는 TL1 프로모터의 제어 하에 quadruple venous 단백질 발현 리포터를 보유하고 웰 슬라이드 바닥에 부착된 효모 세포가 스트레스 배지를 직접 첨가하여 자극된 상태입니다.

방금 시연한 바와 같이, 세포를 10분 간격으로 약 2시간 동안 관찰하였으며, 자극 부여 전후의 이미지를 획득하였습니다. 활성화된 세포 동안 리포터의 형광 발현에 주목하십시오. 이러한 이미지에 포함된 정량적 정보를 추출하기 위해서는 여기서 복잡한 이미지 분석 과정이 수행되어야 합니다.

효모 정량 분석 플랫폼을 통해 얻은 결과가 제시되어 있습니다. 각각의 빨간색 추적선은 단일 세포의 평균 형광 강도의 시간적 변화를 나타냅니다. 파란색 선은 동일한 웰의 서로 다른 다섯 가지 시야에서 획득한 5개의 타임랩스 동영상 중 20개 프레임 동안 분할 및 추적된 500개 이상의 세포에 대한 중앙값을 보여주며, 연한 파란색 영역은 특정 시점에서 측정된 모든 강도의 25백분위수와 75백분위수를 나타냅니다. 유세포 분석법을 통해 동일한 리포터의 발현 역학을 연구하기 위해, 5~10분 간격의 서로 다른 시점에 효모 세포 배양액에 Cycloheximide를 첨가하였습니다.

해당 약물은 새로운 단백질의 합성을 차단하지만, 이미 발현된 형광 단백질의 성숙 과정에는 영향을 주지 않습니다. 따라서 히스토그램이 오른쪽으로 이동하는 것으로 시각화된 단백질 발현은 Cycl H 처리 시점에서 정량화할 수 있으며, 이를 통해 형광 단백질 성숙과 관련된 문제를 해결할 수 있습니다. 이 그래프에서는 현미경 또는 유세포 분석법(flow cytometry)으로 측정한 발현 리포터의 역동성을 비교하였습니다. 현미경 측정 시에는 스트레스 배지 처리 후 30분에서 40분이 지나야 형광 신호가 증가하는 반면, 유세포 분석 측정 결과에서는 자극 후 10분에서 15분 사이에 이미 단백질이 생성되었음을 명확히 나타내어 형광 단백질의 성숙 속도가 느림을 입증합니다.

두 기술 모두 이러한 간단한 실험에서 단일 세포 정보에 접근할 수 있게 해주지만, 세 번의 생물학적 반복 실험 간의 변동성은 현미경이나 유세포 분석법으로 관찰된 단일 세포 반응의 큰 변동성에 비해 작습니다. 이러한 절차를 마친 후, 유전자 발현의 임계값이 무엇인지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 해당 반응 측정과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 현미경이나 유세포 분석법을 이용해 단일 세포 수준에서 단백질 발현을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.