단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 세포 수준에서 미토겐 활성화 단백질 발현을 정량화하는 것입니다. 이를 달성하기 위해, STL one promoter에 의해 제어되는 형광 발현 리포터 quadruple Venus를 함유하고 돼지 1 맵 키나아제의 활성화에 특이적인 효모 균주를 생성하였다. 형광 단백질 발현은 형광의 실시간 발현을 용이하게 하기 위해 현미경에 세포를 직접 가하는 라이브 셀 현미경 검사 분석 또는 유세포 분석으로 정량화할 수 있으며, 이 경우 세포는 마이크로 튜브에서 가해지고 주어진 시간에 단백질 합성이 차단됩니다.

cyclo heide를 추가하면 한 번에 몇 개의 세포만 라이브 셀 현미경으로 분석할 수 있지만 개별 세포의 운명을 직접 관찰하고 다른 세포 특성 유세포 분석과 상관시킬 수 있으며 한 번에 많은 수의 세포에서 mitogen 활성화 단백질 발현을 평가할 수도 있습니다. 이 방법은 어떤 단백질이 유전자 발현 조절에 관여하는지와 같은 신호 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 효모 경로에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 적절한 발현의 가용성에 따라 다른 신호 캐스케이드에도 적용할 수 있습니다. 기자.

생체 세포 현미경 검사를 위해 세포를 준비하려면 먼저 5ml의 합성 배지에 효모를 접종한 다음 하룻밤 동안 섭씨 30도에서 세포를 성장시킵니다. 다음날 아침, 하룻밤 배양의 OD 600을 측정한 다음 하룻밤 배양을 5밀리리터의 합성 배지에 넣어 0.05의 OD 600으로 희석합니다. 희석된 배양물을 섭씨 30도에서 최소 4시간 동안 더 성장시킵니다.

다음으로, 약 200마이크로리터의 갓 준비된 conna valent 용액을 우물 슬라이드로 여과합니다. 30분 후 용액을 제거하고 우물에 150마이크로리터의 물을 추가합니다. 이제 물을 제거하고 세포가 준비되는 동안 우물을 말리십시오.

세포 배양의 OD 600을 다시 측정 한 다음 세포를 희석하여 0.02의 OD 600 및 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에서 300 마이크로 리터의 세포 배양을 얻는다. 수조에서 45초 동안 세포를 초음파 처리합니다. 마이크로 튜브를 간단히 소용돌이친 다음 세포를 다시 초음파 처리하고 소용돌이치게 합니다.

이제 200마이크로리터의 세포를 웰 슬라이드에 추가한 다음 세포를 약 30분 동안 웰 바닥에 가라앉힌 후 슬라이드를 현미경에 놓습니다. 다음으로, 기록할 형광 채널과 두 개의 명시야 이미지에 대한 조명 설정을 선택하고 적절한 세포 분할을 허용하기 위해 초점면 아래 약 3미크론의 명시야 설정 중 하나를 조정합니다. 그런 다음 타임랩스 측정을 위한 시간 간격을 설정하고 이미징을 위한 시야를 선택합니다.

이제 몇 프레임 동안 획득을 시작한 다음 수집을 일시 중지하여 새로 준비된 0.6몰 염화나트륨 배지 100마이크로리터를 추가하고 이미징을 재개하여 유세포 분석으로 측정할 세포를 준비합니다. 먼저 효모에 5ml의 합성 배지를 접종하고 섭씨 30도에서 밤새 세포를 성장시킵니다. 다음날 아침, 하룻밤 배양의 OD 600을 측정한 다음 세포 현탁액을 5ml의 합성 배지에 넣어 OD 600을 0.1의 OD 600으로 희석합니다.

섭씨 30도에서 최소 4시간 동안 배양물을 성장시켜 0.2에서 0.4의 OD 600에 도달합니다. 그런 다음 시간 0에서 측정할 각 시점에 대해 1.5ml 마이크로 튜브에 새로 준비된 100마이크로리터의 0.6몰 염화나트륨을 추가합니다. 각 마이크로 튜브에 200마이크로리터의 세포를 추가하고 섭씨 30도에서 진탕하면서 배양물을 배양합니다.

그런 다음 각 실험 시점에서 갓 준비한 cyclo heide 30마이크로리터를 마이크로 튜브 중 하나에 추가합니다. 마이크로 튜브가 배양하는 동안 각 마이크로 튜브에 대해 하나의 해당 팩스 튜브에 400마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 배양 후, 마이크로 튜브를 잠시 와류로 처리 한 다음 세포를 초음파 처리하고 방금 시연 된 것처럼 1 분 동안 수조를 추가합니다.

그런 다음 각 마이크로 튜브에서 100마이크로리터의 세포 배양을 세포 분석기의 흐름에서 해당 팩스 튜브에 추가합니다. 적절한 excitation 및 detection 설정을 로드하고 비발현 및 완전 발현 샘플을 테스트하여 detector 감도 범위에 속하는지 확인합니다. 마지막으로, 이 이미지에 있는 각 견본을 위한 10의 000의 세포를 측정하고, TL 1개의 발기인의 통제의 밑에 표정 리포터 4배 정맥 단백질을 품고 좋은 활주의 바닥에 붙어 있던 효모 세포는 긴장 매체의 직접적인 판에 의해 자극되었다.

방금 시연한 바와 같이, 세포는 10분 간격으로 약 2시간 동안 모니터링되었으며, 자극 편집 전과 후에 이미지를 획득했습니다. 주목하라, 활성화된 세포 동안 보고의 형광 발현. 이러한 이미지에 포함된 정량적 정보를 추출하려면 여기에서 복잡한 이미지 분석 프로세스를 수행해야 합니다.

효모 quant 분석 플랫폼으로 얻은 결과를 보여줍니다. 각 빨간색 흔적은 단일 세포의 평균 형광 강도의 시간적 변화를 나타냅니다. 파란색 선은 동일한 웰에서 5개의 서로 다른 시야에서 획득한 5개의 타임랩스 영화의 20개 프레임에 걸쳐 분할 및 추적된 500개 이상의 세포의 중앙값을 나타내며, 연한 파란색 영역은 유세포 분석으로 동일한 리포터의 발현 역학을 연구하기 위해 주어진 시점에서 측정된 모든 강도의 25번째 및 75번째 백분위수를 나타내며, Cycloheximide를 효모에 첨가했습니다 서로 다른 시점에서 5분에서 10분 간격으로 세포를 배양합니다.

이 약물은 새로운 단백질의 합성을 차단하지만 이미 발현된 형광 단백질의 성숙은 교란되지 않습니다. 그러므로, 히스토그램의 우측 변위에 의해 시각화된 단백질 발현은 Cycl H edition 시점에서 정량화될 수 있으며, 이는 형광 단백질 성숙과 관련된 문제를 우회할 수 있습니다. 이 그래프에서는 현미경 검사 또는 유세포 분석으로 측정된 표정 리포터의 역학을 비교하는 반면, 현미경 검사로 측정한 스트레스 매질의 판화 후 30-40분 후에 형광 신호가 상승하는 동안, 유세포 분석 측정은 자극 후 10-15분 사이에 단백질이 이미 생성되었음을 명확하게 나타내며 형광 단백질의 느린 성숙을 보여줍니다.

두 기술 모두 이러한 간단한 실험을 위한 단일 세포 정보에 액세스할 수 있으며, 3개의 생물학적 복제물 간의 변동성은 현미경 또는 유세포 분석에 의한 단일 세포 반응에서 관찰된 큰 변동성에 비해 작습니다. 이러한 절차에 따라 유전자 발현의 역치와 같은 추가 질문에 답하기 위해 이러한 반응 측정과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 유세포 분석 현미경을 사용하여 단일 세포 수준에서 단백질 발현을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.