Name: 단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 배우세요 단일 효모 세포에서 MAPK 유도 유전자 발현을 실시간 현미경 및 유세포 분석으로 정량화하는 방법을. 이 기법은 세포 신호 전달 및 유전자 발현 조절 연구에 활용됩니다.

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저자는 마티아스 베드로와 이러한 방법이 개발되었다 취리히의 ETH에서 생화학 연구소에서 자신의 그룹을 감사합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원되었다.

1. 현미경 측정 <ol><li> 효모와 합성 배지 5 ㎖를 접종한다. </li><li> 하룻밤 30 ° C에서 세포를 성장. </li><li> 다음날 아침 밤새 문화의 OD 600을 측정합니다. </li><li> 600 0.05 과다 복용 5 ㎖ 합성 배지에서 하룻밤 문화를 희석. </li><li> 최소 4 시간 동안 30 ° C에서 희석 문화를 성장. </li><li> 준비 3 배 합성 배지 (0.6 M) NaCl 용액 집중. </li><li> PBS에서 인 Concanavalin A (CONA)의 1 ㎎ / ㎖의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 여과 액 ~ 잘 슬라이드에 CONA 용액 200 μL. </li><li> 30 분 동안 서 보자. </li><li> CONA 솔루션을 제거합니다. </li><li> 웰에 150 μL의 H 2 O를 추가합니다. </li><li> H 2 O를 제거 </li><li> 세포 배양의 OD 600을 측정합니다. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 튜브에 = 0.02 OD 600에서 세포 배양의 300 μl를 준비합니다. </li><li> 45 초 동안 수욕에서 초음파 처리 셀. </li><li> 소용돌이 짧게 마일crotube. </li><li> 45 초 동안 수욕에서 초음파 처리 셀. </li><li> 간단히 소용돌이 모세관. </li><li> 우물에 세포 배양 200 μl를 추가합니다. </li><li> 세포가 우물의 바닥에 정착하도록 30 분을 기다립니다. </li><li> 현미경에 잘 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 기록 될 채널에 대한 형광 조명 세팅을 선택한다. </li><li> (: 세포의 적절한 분할 수 있도록 초점면 아래의 3 μm의 약간 초점의 하나) 두 명 시야 이미지의 조명 설정을 선택합니다. </li><li> 시간 경과 측정 시간 간격을 선택 </li><li> 이미지 뷰의 필드를 선택합니다. </li><li> 몇 프레임의 인수를 시작합니다. </li><li> 0.6 M의 NaCl 매체의 100 μl를 추가 인수를 일시 중지합니다. </li><li> 영상을 다시 시작합니다. </li></ol> 2. 유동 세포 계측법 측정 <ol><li> 효모와 합성 배지 5 ㎖를 접종한다. </li><li> 하룻밤 30 ° C에서 성장. </li><li> 측정OD 하룻밤 문화의 600 다음날 아침. </li><li> 600 0.1 과다 복용 5 ㎖ 합성 배지에서 하룻밤 문화를 희석. </li><li> OD 0.2 ~ 0.4의 600에 도달하기 위해 최소 4 시간 동안 30 ° C에서 성장. </li><li> H 2 O에서 사이클로 헥시 미드 용액을 1 ㎎ / ㎖를 준비 </li><li> 준비 3 배 합성 배지 (0.6 M) NaCl 용액 집중. </li><li> 측정 할 때마다 포인트 0.6 M의 NaCl 매체의 100 μL와 하나의 1.5 ML 마이크로 튜브를 준비합니다. </li><li> 시간 0에서, 각각의 마이크로 튜브에 세포 배양 200 μl를 추가합니다. </li><li> 30 ℃에서 진탕 배양한다 </li><li> 시간 t에서, 마이크로 튜브에 30 μL의 사이클로 헥시 미드를 추가합니다. </li><li> 원하는 모든 시점에 2.11 단계를 반복합니다. </li><li> 적어도 45 분 동안 모든 마이크로 튜브를 품어 떨고와 30 ° C에서 최대 3 시간. </li><li> 400 ㎕의 PBS와 FACS 튜브를 준비합니다. </li><li> 1 분 동안 수욕에서 초음파 처리 셀. </li><li> 간단히 소용돌이 모세관. </li><li> 아들1 분 동안 수욕 세포 icate. </li><li> 간단히 소용돌이 모세관. </li><li> 각 모세관에서의 대응 FACS 튜브에 100 ㎕의 세포 배양을 추가합니다. </li><li> 검출을위한 488 nm의 여기 레이저와 30분의 530 nm의 대역 통과 필터를 선택합니다. </li><li> 테스트가 아닌 표현과 완전히 그들이 검출기 감도 범위에 빠지고 있는지 확인하기 위해 샘플을 표현. </li><li> 획득 한 각 샘플에 대한 10,000 세포를 측정한다. </li></ol>

<ol><li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li>
<li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Wu, J. -Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li>
<li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li>
<li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li>
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<li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).</li>
<li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li>
<li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li>
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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

현미경 사용 CONA와 잘 치료는 세포의 적절한 이미징을 보장하는 필수 단계이다. CONA은 PBS (5 ㎎ / ㎖)에서 낮은 용해도를 갖기 때문에, 여과 처리 수는 여과되지 않은 용액에 존재하고 촬상 방해 큰 응집물의 제거. 세포는 처리 된 표면에 비교적 강하게 부착하고 유도 용액의 첨가는 자극 전후 지속적인 추적을 허용 세포의 현지화를 방해해서는 안된다. 세포는 정 유량 7,15을 실시 하였다이 치료는 또한 마이크로 유체 소자 채널 또는 흐름에 적용될 수있다. 확실히이 제대로 처리 후에 물로 세정하지 않으면 용액 CONA이 세포에 직접 결합 및 유리 표면에 강한 결합을 형성하는 것을 방해 아마도 때문에, 세포는 유리에 적절히 부착되지 것이다. 세척 단계 후, 잘은 3 건조 남아있을 수 있습니다 -띄게 유리 세포의 결합에 영향을주지 않고 세포를 첨가하기 전에 4 시간. 형광 채널에 대한 노출 시간의 선택은 실...

전달 폭포를 통해 신호는 종종 단백질의 발현에 절정. 이 발현 프로파일의 특성화는 생물학적 경로의 기능을 이해하는데 중요한 요소이다. 위로 통제 단백질과 그들의 활성화의 역학의 스펙트럼의 식별은 마이크로 어레이, 북부 오 또는 서부 오 1-3와 같은 다양한 기술에 의해 달성 될 수있다. 그러나, 이러한 기술은 세포의 전체 모집단의 응답을 평균. 단백질 발현의 미세 조절을 이해하기 위해, 단일 세포 수준에서 측정을 수집하는 것이 바람직하다. 이상적으로, 이러한 측정은 기본 경로의 수학적 모델을 개발하는 의무가 정량적 데이터를 제공해야합니다. 현미경 및 유동 세포 계측법 이상적으로 이러한 양적 단일 세포 측정을 제공하기 위해 적합한 두 가지 기술이다. 형광 단백질과 단백질의 내생 태그는 B 수전자 발현 레벨 4를 정량화하는 데 사용됩니다. 단백질의 말단에 큰 형광 부분의 첨가는 비 기능을 렌더링 할 수 있기 때문에 그러나, 형광 구조체의 발현을 구동 프로모터에 따라 특정 식 기자를 생성하는 것이 더욱 바람직하다. 이 기자의 단백질은 셀룰러 시스템에 외생 적이며, 따라서 세포에서 일어나고있는 신호 이벤트에 영향을주지 않습니다. 현미경 및 유동 세포 계측법 모두 널리 효모 신호 분야에서 사용되어왔다. 예로서, 콜먼 - 러너와 동료는 상관 관계, 하나의 세포, 효모 짝짓기 신호 전달 캐스케이드 5의 노이즈를 정량화하기 위해 현미경으로 구체적이고 구조적으로 표현 기자 짝짓기의 표현, ACAR 및 규제 네트워크를 연구하는 유동 세포 계측법을 사용하는 동료 GAL 6 유전자의 발현을 제어한다. 이전 연구 7에서, 우리는 combinati을 사용했습니다높은 삼투압 글리세롤 효모 신진에서 (HOG) 경로에서 표현의 출력을 연구하는이 두 기술에. 이 미토 겐 활성화 단백질 키나제 (MAPK) 경로는 하이퍼 삼투압 스트레스에 의해 트리거된다. 그것은 약 300 유전자의 발현 결과 전사 프로그램을 유도하는 세포의 핵으로 옭 Hog1 MAPK의 활성화를 초래한다. 이 과정을 연구하기 위해, 우리는 배 금성 형광 단백질 (P의 STL1-QV)의 발현을 구동 STL1 프로모터 (Hog1 활동 8에 대한 응답으로 구체적으로 유도하는 유전자)를 기반으로 식 기자를 설계했다. 측정은 형광 기자를 표현하는 인구의 비율과 중간 스트레스 수준 (0.1 M의 NaCl)에서 세포의 두 집단의 존재를 발견 유동 세포 계측법. 우리는 더 이상이 문제를 조사하기 위해 현미경을 사용하고 단백질 발현이 노이즈가 고유 요인 (9)에 의해 지배 된 것을 발견했다. 우리는 기LD 더욱 Hog1 활동의 유사한 수준의 세포가 현저하게 상이한 발현 결과를 표시 할 수 있다는 것을 관찰한다. 이 두 기술의 조합은 우리가 스트레스 반응 유전자의 느린 리모델링이 하나의 셀 레벨 7의 발현 결과에 영향을 방법을 설명 할 수있었습니다. 이 논문에서, 우리는 현미경에 의한 단백질 발현의 정량의 예를 들어 하이퍼 삼투 충격에 의해 유도 된 P STL1-QV 기자의 표현을 사용하고 유동 세포 계측법. 0.2 M의 NaCl 스트레스 대상이 같은 변형은 두 가지 방법으로 연구 하였다. 이것은 우리가 이러한 상호 보완적인이 두 기술의 몇 가지 주요 차이점을 강조 할 수 있습니다.

<table><tr><tbody><td colspan="4">시약</td></tr><tr><td>효모 질소 염기</td>중<td>CYN6202</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSM 아미노산 혼합</td><td>용Medium</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>독성</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus</td></tr><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>현미경 제어 소프트웨어</td><td>Micro-manager</td><td>Ver 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>배양 챔버</td><td>LIS</td><td>The Box</td><td></td></tr><tr><td>형광 광 source</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD</td><td>FACS calibur</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator 욕조</td><td>Telesonic</td><td>TUC-150</td><td></td></tr><tr><td>8-웰 슬라이드 </td><td>Thermo Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Matrical bioscience</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 효모 세포에서 mapk 유도 표현의 시간적 정량화

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

단일 세포 수준에서의 유전자 발현의 정량화는 집단 수준에서 수행되는 측정에 가려진 신규 규제 메커니즘을 폭로. 두 가지 방법 현미경을 기반으로 유동 세포 계측법은 이러한 데이터를 취득 할 수있는 방법을 보여주기 위해 제공됩니다. 효모에서 고 삼투압 글리세롤 MAPK 경로의 활성화시에 유도 된 형광 리포터의 발현은 예로서 사용된다. 각 방법의 구체적인 장점은 강조 표시됩니다. 계측법 다수의 셀 (10000)을 측정하고 형광 단백질의 성숙 느린 동역학 독립적 단백질 발현의 역학의 직접적인 측정을 제공 흐른다. 현미경으로 살아있는 세포의 영상이 적은 세포에서 기자의 성숙 형태의 측정에 한정 대조적입니다. 그러나,이 기술에 의해 생성 된 데이터 세트는 여러 기자의 조합 및 시공간 정보에 매우 풍부 감사 될 수각각의 세포에서 얻은. 이 두 가지 측정 방법의 조합은 신호 전달 경로에 의해 단백질 발현의 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

현미경 사용 발현 리포터 P STL1-QV (ySP9 7) 베어링 효모 세포는 잘 슬라이드 하단에 부착되고, 현미경하에 넣었다. 세포 이미징 세션 도중에 직접 우물에 응력 매체의 첨가에 의해 자극 하였다. 이것은 우리가 통로 유도하기 전에 세포의 몇 가지 이미지를 획득하고 자극 후 자신의 운명을 수행 할 수 있습니다. 본 경우에, 세포를 10 분의 시간 간격으로 1 ~ 2 시간 동안 관찰 하였다.도 1a는 유도 및도 1b 전에 비 - 형광 세포의 이미지가 발현 리포터가 가지는 2 시간 스트레스 후에 동일한 셀에게 표시 유도 된 형광되고있다. 이러한 이미지에 존재하는 정량적 정보를 추출하기 위해 복잡한 이미지 분석 처리가 수행되어야한다. 그것은 I의 객체를 정의하는 세포의 분할을 포함한다마법사, 다음에 하나의 프레임에서 이러한 객체의 추...

유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 세포 수준에서 mitogen activated protein 발현량을 정량화하는 것입니다. 이를 위해 STL1 프로모터의 제어를 받으며 hog1 map kinase의 활성화에 특이적인 형광 발현 리포터 quadruple Venus를 보유한 효모 균주를 제작하였습니다. 형광 단백질 발현은 실시간 형광 관찰을 용이하게 하기 위해 현미경 상에서 세포에 직접 스트레스를 가하는 살아있는 세포 현미경 분석법이나, 마이크로 튜브에서 세포에 스트레스를 가한 후 특정 시점에 단백질 합성을 차단하는 유세포 분석법을 통해 정량화할 수 있습니다.cyclo heximide를 첨가하면 라이브 셀 현미경으로 한 번에 소수의 세포만 분석할 수 있지만, 개별 세포의 운명을 직접 관찰하고 다른 세포 특성과 상관관계를 분석할 수 있습니다. 반면, 유세포 분석법은 한 번에 수많은 세포에서 mitogen activated protein 발현을 평가할 수 있게 해줍니다. 이 방법은 유전자 발현 조절에 어떤 단백질이 관여하는지와 같은 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 비록 이 방법이 효모 경로에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 적절한 리포터(Reporter)의 가용 여부에 따라 다른 신호 전달 폭포(signaling cascade)에도 적용될 수 있습니다.라이브 셀 현미경 관찰을 위해 세포를 준비하려면, 먼저 5 mL의 합성 배지에 효모를 접종한 후 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 하룻밤 배양한 배양액의 OD 600을 측정하고, 이를 5 mL의 합성 배지로 희석하여 OD 600이 0.05가 되도록 맞춥니다. 희석된 배양액을 30 °C에서 최소 4시간 동안 더 배양합니다.다음으로, 갓 준비한 covalent a 용액 약 200 µL를 웰 슬라이드에 필터링하여 넣습니다. 30분 후, con a 용액을 제거하고 웰에 물 150 µL를 추가합니다. 이제 물을 제거하고 세포를 준비하는 동안 웰을 건조시킵니다.세포 배양액의 OD 600을 다시 측정한 후, 세포를 희석하여 1.5 milliliter 마이크로 튜브에 OD 600이 0.02인 세포 배양액 300 microliters가 되도록 분주합니다. 워터 배스에서 45초 동안 세포를 초음파 처리합니다. 마이크로 튜브를 짧게 볼텍싱한 후, 다시 한번 초음파 처리와 볼텍싱을 반복합니다.이제 웰 슬라이드에 세포 200 µL를 추가하고, 세포가 웰 바닥에 가라앉을 때까지 약 30분 동안 기다린 후 슬라이드를 현미경 위에 놓습니다. 다음으로, 기록할 형광 채널과 두 개의 명시야 이미지를 위한 조명 설정을 선택하며, 적절한 세포 분할(segmentation)이 가능하도록 명시야 설정 중 하나를 초점 평면보다 약 3 µm 아래로 조정합니다. 그런 다음 타임랩스 측정을 위한 시간 간격을 설정하고 이미징을 위한 시야(field of view)를 선택합니다.이제 몇 프레임 동안 획득을 시작한 다음, 획득을 일시 중지하고 갓 준비한 0.6 molar 염화 나트륨 배지 100 µL를 첨가하십시오. 그 후 이미징을 재개하여 유세포 분석 측정을 위해 세포를 준비합니다. 먼저 5 mL의 합성 배지에 효모를 접종하고 30 °C에서 밤새 배양하십시오. 다음 날 아침, 밤새 배양한 배양액의 OD 600을 측정한 후, 세포 현탁액을 5 mL의 합성 배지에 희석하여 OD 600을 0.1로 맞춥니다.배양액을 30 °C에서 최소 4시간 동안 배양하여 OD 600 값이 0.2에서 0.4에 도달하도록 합니다. 그 다음, 시간 0에서 측정할 각 시점별로 1.5 mL 마이크로 튜브에 갓 조제한 0.6 M 염화나트륨 100 µL를 넣습니다. 각 마이크로 튜브에 세포 200 µL를 첨가하고 30 °C에서 흔들어 섞으며 배양합니다.그 다음, 각 실험 시점마다 신선하게 준비한 cyclo heximide 30 µL를 마이크로 튜브 하나에 첨가합니다. 마이크로 튜브를 배양하는 동안, 각 마이크로 튜브에 대응하는 팍스 튜브(fax tube) 하나에 PBS 400 µL를 첨가합니다. 배양이 끝난 후, 마이크로 튜브를 짧게 볼텍싱하고, 방금 시연한 것처럼 워터 배스(water bath)에서 1분 동안 세포를 초음파 처리합니다.그런 다음 각 마이크로 튜브에서 100 µL의 세포 배양액을 유세포 분석기의 해당 팩스 튜브에 넣습니다. 적절한 들뜸 및 검출 설정을 로드하고, 발현되지 않은 샘플과 완전히 발현된 샘플을 테스트하여 검출기 감도 범위 내에 있는지 확인합니다. 마지막으로, 각 샘플에 대해 10,000개의 세포를 측정하는데, 이때의 이미지는 TL1 프로모터의 제어 하에 quadruple venous 단백질 발현 리포터를 보유하고 웰 슬라이드 바닥에 부착된 효모 세포가 스트레스 배지를 직접 첨가하여 자극된 상태입니다.방금 시연한 바와 같이, 세포를 10분 간격으로 약 2시간 동안 관찰하였으며, 자극 부여 전후의 이미지를 획득하였습니다. 활성화된 세포 동안 리포터의 형광 발현에 주목하십시오. 이러한 이미지에 포함된 정량적 정보를 추출하기 위해서는 여기서 복잡한 이미지 분석 과정이 수행되어야 합니다.효모 정량 분석 플랫폼을 통해 얻은 결과가 제시되어 있습니다. 각각의 빨간색 추적선은 단일 세포의 평균 형광 강도의 시간적 변화를 나타냅니다. 파란색 선은 동일한 웰의 서로 다른 다섯 가지 시야에서 획득한 5개의 타임랩스 동영상 중 20개 프레임 동안 분할 및 추적된 500개 이상의 세포에 대한 중앙값을 보여주며, 연한 파란색 영역은 특정 시점에서 측정된 모든 강도의 25백분위수와 75백분위수를 나타냅니다. 유세포 분석법을 통해 동일한 리포터의 발현 역학을 연구하기 위해, 5~10분 간격의 서로 다른 시점에 효모 세포 배양액에 Cycloheximide를 첨가하였습니다.해당 약물은 새로운 단백질의 합성을 차단하지만, 이미 발현된 형광 단백질의 성숙 과정에는 영향을 주지 않습니다. 따라서 히스토그램이 오른쪽으로 이동하는 것으로 시각화된 단백질 발현은 Cycl H 처리 시점에서 정량화할 수 있으며, 이를 통해 형광 단백질 성숙과 관련된 문제를 해결할 수 있습니다. 이 그래프에서는 현미경 또는 유세포 분석법(flow cytometry)으로 측정한 발현 리포터의 역동성을 비교하였습니다. 현미경 측정 시에는 스트레스 배지 처리 후 30분에서 40분이 지나야 형광 신호가 증가하는 반면, 유세포 분석 측정 결과에서는 자극 후 10분에서 15분 사이에 이미 단백질이 생성되었음을 명확히 나타내어 형광 단백질의 성숙 속도가 느림을 입증합니다.두 기술 모두 이러한 간단한 실험에서 단일 세포 정보에 접근할 수 있게 해주지만, 세 번의 생물학적 반복 실험 간의 변동성은 현미경이나 유세포 분석법으로 관찰된 단일 세포 반응의 큰 변동성에 비해 작습니다. 이러한 절차를 마친 후, 유전자 발현의 임계값이 무엇인지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 해당 반응 측정과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 현미경이나 유세포 분석법을 이용해 단일 세포 수준에서 단백질 발현을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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