단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

이 최적화된 단일 분자 RNA 제자리 혼성화(in situ hybridization, smFISH)의 전반적인 목표는 발아 효모의 식물 성장 및 감수분열 동안 세포별로 개별 RNA 분자를 검출하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 세포 내 RNA 국소화에서 유전자 발현의 세포 간 다양성을 보여주므로 유전자 조절을 연구하는 강력한 기술입니다. smFISH에 의해 밝혀질 수 있는 고유한 정보 외에도 이 기술의 주요 장점은 일단 최적화되면 강력하고 재현성이 높다는 것입니다.

이 프로토콜의 시연을 위해 감수분열 배양이 사용됩니다. 3% 포름알데히드의 배양물을 고정하려면 2밀리리터 미세원심분리기 튜브에 37% 포름알데히드 160마이크로리터에 배양물 1840마이크로리터를 첨가합니다. 약 5회 뒤집어 섞습니다.

튜브를 실온에서 20분 동안 롤러 드럼에 놓습니다. 20분 후 섭씨 4도에서 밤새 교대로 고정을 계속합니다. 다음 날에는 먼저 200밀리몰의 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체(VRC)를 섭씨 65도에서 최소 10분 동안 해동하여 소화를 준비합니다.

분해 마스터 믹스를 준비하려면 먼저 2125마이크로리터의 버퍼 B를 15ml 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 따뜻한 VRC를 5초 동안 소용돌이치게 하여 완전히 재현탁시키고 15ml 튜브에 200마이크로리터의 VRC를 추가합니다. 혼합물은 밝은 갈색을 띤 녹색으로 나타나야 합니다.

감수분열 샘플을 21, 000 x g에서 실온에서 1분 30초 동안 원심분리합니다. 상등액을 조심스럽게 흡입하고 펠릿을 방해하지 않도록 진공 팁을 펠릿의 반대쪽에 놓습니다. 1.5 ml의 저온 완충액 B에 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 세포를 재현탁시킵니다.

21, 000 x g에서 1분 30초 동안 원심분리기. 진공 흡입으로 액체의 대부분을 제거하고 약 100 마이크로 리터를 남겨 둡니다. 1 밀리리터의 콜드 버퍼 B에 세포를 재현탁합니다.샘플을 원심 분리하고 액체를 제거한 다음 1 밀리리터의 콜드 버퍼 B에 세포를 다시 현탁시킵니다.

21, 000 x g에서 1분 30초 동안 원심분리기. 피펫팅으로 액체를 완전히 흡입합니다. 425 마이크로 리터의 소화 마스터 믹스와 와류에 세포를 잠시 재현탁시킵니다.

5마이크로리터의 자이몰리아제를 튜브에 넣고 2-3초 동안 섞습니다. 튜브를 롤러 드럼에 놓고 섭씨 30도에서 15-30분 동안 소화합니다. 15 분 후, 매 5 분마다 현미경 검사로 세포를 확인하고 세포의 약 80 %가 불투명하고 굴절되지 않는 것처럼 보일 때 소화를 중지하십시오.

376 x g에서 튜브를 3분 동안 원심분리합니다. 상등액을 완전히 제거하십시오. 1ml의 buffer B로 1-2회 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 세포를 부드럽게 재현탁합니다.

튜브를 원심분리하고 버퍼를 제거합니다. 1ml의 70% 에탄올에 세포를 부드럽게 재현탁시키고 실온에서 3시간 반에서 4시간 동안 배양합니다. 혼성화 절차를 시작하려면 376 x g에서 3분 동안 세포 튜브를 원심분리합니다.

튜브에서 500 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 제거합니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 남은 세포를 재현탁시키고 세포를 저접착 튜브로 옮깁니다. 샘플을 저접착 튜브로 옮기는 것은 후속 포름아미드 세척 중에 과도한 세포 손실을 방지하는 데 중요합니다.

저접착 튜브를 원심분리하고 모든 에탄올을 제거합니다. 10% 포름아미드 세척 완충액 1ml를 튜브에 넣고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁시킵니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 혼성화 용액을 준비하는 동안 세포를 약 20분 동안 실온에서 설정하도록 합니다.

샘플을 원심분리하고 상등액을 유해 폐기물로 제거합니다. 각 혼성화 용액을 튜브에 최소 50마이크로리터를 추가하고 튜브를 튕겨 혼합합니다. 섭씨 30도의 롤러 드럼에서 어둠 속에서 최소 16시간 동안 배양합니다.

혼성화가 완료되면 세포관을 호일로 덮인 상자에 넣어 빛으로부터 보호합니다. 376 x g에서 3분 동안 샘플을 원심분리합니다. 피펫팅으로 상층액을 유해 폐기물로 제거합니다.

1ml의 10% 포름아미드 세척 완충액에 샘플을 2-3회 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다. 세포관을 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 덮인 상자에 다시 넣고 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후 샘플을 원심분리합니다.

피펫팅으로 상층액을 유해 폐기물로 제거하고 약 50 마이크로 리터를 남겨 둡니다. 1ml의 DAPI 용액에 샘플을 두세 번 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다. 다시 한 번, 세포 튜브를 호일로 덮인 상자에 넣고 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다.

샘플을 원심분리하고 피펫팅으로 상층액을 완전히 제거합니다. 즉시 이미지화되지 않는 샘플의 경우, 효소 없이 50마이크로리터의 GLOX 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 피펫을 위아래로 3-4회 혼합합니다.

이미지화할 준비가 될 때까지 섭씨 4도의 호일로 덮인 상자에 보관하십시오. 즉시 이미징되는 샘플의 경우 효소와 함께 15-20마이크로리터의 GLOX 완충액을 첨가하십시오. 5마이크로리터를 피펫으로 커버 슬립에 끼우고 커버 슬립을 슬라이드에 놓습니다.

커버 슬립이 놓인 슬라이드 위에 실험실용 물티슈를 놓습니다. 와이프를 부드럽게 눌러 슬라이드를 설정합니다. 현미경실로 옮기기 위해 알루미늄 호일로 덮인 상자에 슬라이드를 넣습니다.

이 프로토콜은 두 개의 mRNA 동형을 발현하는 NDC80 유전자의 발현을 검사하는 데 사용되었습니다. 긴 디코딩되지 않은 전사체 동형은 짧은 동형에 비해 400 염기쌍 5 소수 확장을 가지고 있습니다. 두 세트의 프로브가 설계되었습니다.

CF 590 세트는 긴 동형의 고유한 5개 프라임 영역에 결합하고 Q 670 세트는 두 동형의 공통 영역에 결합합니다. 최적화된 조건에서 두 프로브 세트 모두에 대해 뚜렷한 smFISH 스폿이 명확하게 식별되었습니다. 두 개의 프로브 세트는 식물 성장 및 감수 분열 중 NDC80 발현을 연구하는 데 사용되었습니다.

식물 세포에서는 Q 670 프로브 세트의 강력한 신호가 감지되었지만 CF 590 프로브 세트에서는 감지되지 않았습니다. 대조적으로, 두 프로브 세트의 강력한 신호는 감수분열 전구기에서 감지되었으며 대부분의 스폿은 공동 국소화 신호를 가졌습니다. 노던 블롯 분석은 긴 동형이 감수 분열에서 특이적으로 발현되는 것을 확인했습니다.

식물 세포는 세포당 5개의 짧은 동형 전사체의 중앙값을 갖는 것으로 밝혀진 반면, 감수분열 전구 세포에서는 중앙값이 세포당 4개의 전사체로 크게 떨어졌습니다. 감수분열 전구기(meiotic prophase)에서 세포당 긴 동형체 전사체의 중앙값은 21개였으며 세포의 100%가 전사체를 발현했습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 72시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 먼저 최적의 신호 대 잡음비를 달성하는 데 필요한 분해 시간과 smFISH 프로브의 농도를 최적화하는 것이 중요합니다. 또한 뉴클레아제 활성을 방지하기 위해 소화 및 야간 혼성화 중에 VRC를 추가하는 것을 잊지 마십시오. 이러한 발전을 통해 이 기술은 연구자들이 동적 유전자 조절과 세포 내 RNA 국소화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 발아 효모 감수분열에서 단일 분자 RNA FISH를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.