Name: 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 배우세요 단일 분자 형광 제자리 교잡법(smFISH)을 이용하여 효모의 무성 생장 및 감수 분열 동안 RNA 분자를 정량 분석하는 방법입니다. 이 기법은 유전자 발현의 세포 간 변동성과 아세포 RNA 국소화를 밝혀내어 유전자 조절 연구에 강력한 도구를 제공합니다.

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우리 앤 Dodson 감사와 스테파니 하인리히 smFISH 프로토콜을 최적화 하는 방법에 대 한 조언 위한 Xavier Darzacq 분석 플랫폼, Haiyan 황 통계 분석에 대 한 제안에 대 한 도움말. 이 작품은 십 센트의 3 월 (5-FY15-99), 퓨 자선 트러스트 (00027344), Damon Runyon 암 연구 재단 (35-15) 및 글렌 EÜ을 재단과 NSF 대학원 연구 장학금 부여 번호에서 자금에 의해 지원 되었다 JC에 DGE-1106400입니다.

참고: 모든 버퍼와이 프로토콜에 사용 된 미디어는 표 1에 나열 됩니다. 시 약에 대 한 공급 업체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
일 1/1-2 일:
참고: 식물 문화에 대 한 OD600 0.4에 0.6 선호 매체에서의 세포를 성장 한다. Meiotic 문화에 대 한 셀 (일반적으로 1.85의 OD600 에 경작) 기본 메서드를 사용 하 여 감수 분열을 유도.
1. 샘플 고정 및 소화
<ol><li>3% 포름알데히드에 셀의 ~3.5 OD600 의 총 수정.<ol>
<li>식물 문화에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 37% 포름알데히드의 480 µ L를 문화의 5.52 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>Meiotic 문화, 문화의 1840 µ L 2 mL microcentrifuge 튜브에 37% 포름알데히드의 160 µ L를 추가 합니다. 하 ~ 5 번 반전 혼합. 주의: 포름알데히드는 독성이 있다. 처리 하 고 기관 규정에 따라 처분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 분 동안 실내 온도에 롤러 드럼에 튜브를 놓습니다. Meiotic 샘플, 20 분 동안 실내 온도에 고정 후 하룻밤 4 ˚C에서 수정 계속, 회전. 참고: 야간 고정 meiotic 샘플 획득 smFISH 데이터의 품질과 재현성을 증가 시킵니다. 고정 시간을 최적화 합니다.</li>
	<li>샘플을 수정 하는 동안 200mm Vanadyl Ribonucleoside 복합물 (VRC) 적어도 10 분 동안 65 ˚C에서 해 동.</li>
	<li>15 mL 튜브에 소화 마스터 믹스 준비: 버퍼 b 425 µ L 200 mm (65 ˚C 하 예 열); VRC 40 µ L 믹스 1 샘플 5 샘플에 대 한 버퍼 B의 2125 µ L 200 m (65 ˚C 하 예 열) VRC m의 200 µ L 믹스. 완전히 밝은 갈색 녹색 VRC 추가 후 표시 됩니다 마스터 믹스에 추가 하기 전에 VRC resuspend을 소용돌이 ~ 5 s. 참고: 추가 VRC 소화 하는 동안 향상 됩니다 smFISH 결과의 일관성 잠재적으로 원유 추출에서 순화 zymolyase 혼합물에 의해 도입 된 nuclease 오염 억제. 이 단계에서 필요한 VRC 양의 최적화 되어야 합니다.</li>
	<li>식물 샘플에 대 일 분 ~ 1057 x g에서 튜브 원심. (후에 야간 고정) meiotic 샘플, 1.5 분 Decant 21000 x g에서 원심 또는 포름알데히드 폐기물 상쾌한 발음. 참고: 모든 원심 분리 단계는 상 온에서 수행 됩니다.</li>
	<li>아래로 pipetting 또는 튜브를 거꾸로 하 고 혼합 flicking 셀 1.5 mL 찬 버퍼 b에 resuspend. 물의 resuspension 후 2 mL 튜브에 식물 샘플을 전송.</li>
	<li>1.5 분에 대 한 21000 x g에서 원심 분리기는 액체의 대량 진공 포부에 의해 여 제거할 pipetting, ~ 100 µ L를 남겨두고.</li>
	<li>1.5 mL 찬 버퍼 b에 셀 resuspend</li>
	<li>1.5 분에 대 한 21000 x g에서 원심 분리기는 액체의 대량 진공 포부에 의해 여 제거할 pipetting, ~ 100 µ L를 남겨두고.</li>
	<li>Resuspend 셀 1.5 분 Aspirate에 대 한 21000 x g에서 차가운 버퍼 B. 분리기의 1.5 mL에 완전히 진공 또는 pipetting 액체.</li>
	<li>소화 마스터 믹스, 그리고 짧게 resuspend를 소용돌이의 425 µ L 셀 resuspend 각 튜브를 100T 10 mg/mL zymolyase의 5 µ L를 추가 합니다. 참고: 소용돌이 관에 추가 하기 전에 때마다 zymolyase Zymolyase 각 튜브를 개별적으로 추가할 마스터 믹스에 추가 하는 대신. 두 단계 zymolyase 신속 하 게 침전 물 때문에 튜브 중 소화 일관성을 유지 도움이.</li>
	<li>믹스와 2-3 동 s입니다. 롤러 드럼에 튜브를 놓고 30 ˚C 15-30 분에 소화 합니다. 식물 세포와 초기 meiotic 단계, 보통 ~ 15 분 걸립니다 그리고 meiotic 의향 및 meiotic 사단, 보통 ~ 30 분 걸립니다. 참고: 15 분 후 현미경에 매 5 분을 확인 하 고 세포의 ~ 80% 비-투명 하 고 비 굴절 나타나면 소화를 중지. 가이 시점에서 세포는 매우 깨지기 쉬운. 셀을 부드럽게 처리 하 고 진공 포부 또는 vortexing를 사용 하지 마십시오.
</li>
	<li>원심 ~ 376 x g 3 분 제거에서 튜브 액체 완전히 pipetting으로.</li>
	<li>부드럽게 버퍼 B의 1 mL로 세포를 1-2 번 아래로 pipetting으로 resuspend 혼합.</li>
	<li>Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거 버퍼 B 액체에 튜브를 원심. 부드럽게 70% 에탄올 (RNase 무료 물과 함께 희석) 1 mL에 셀 resuspend.</li>
	<li>3.5-4 시간 동안 실 온에서 품 어.</li>
</ol>2입니다. 교 잡
<ol><li>실내 온도에 formamide를가지고 (50 mL 약 수에 대 한 걸리는 ~ 30 분 물 목욕에서). 참고: 병 formamide의 산화 방지를 위해 상 온에 도달할 때까지 formamide 병을 열지 마십시오. 주의: Formamide은 독성이 있습니다. 처리 하 고 기관 규정에 따라 처분.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 10 %formamide 워시 버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거 500 µ L의 70% 에탄올에 튜브를 원심. 부드럽게 피펫으로 아래로 나머지 셀 resuspend를 다음 낮은 접착 튜브 셀을 전송. 참고: 다음 세척 시 셀 손실 감소 크게 낮은 접착 튜브를 사용 하 여.</li>
	<li>Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거에서 다시 튜브 모든 에탄올을 원심.</li>
	<li>추가 10 %formamide 워시 버퍼, 그리고 부드럽게 피펫으로의 1 mL를 위아래로 2-3 시간 하 셀 resuspend.</li>
	<li>하이브리드 솔루션을 준비 하는 동안 ~ 20 분 동안 실내 온도에 앉아 셀 수 있습니다. 1 샘플에 대 한 교 잡 버퍼 (임시 방)의 50 µ L, 200 mm (65 ˚C 하 예 열), VRC 5 µ L 및 각 프로브 (200 nM 최종)의 1 µ L를 혼합. 5 샘플에 대 한 교 잡 버퍼 (임시 방)의 250 µ L, 200 mm (65 ˚C 하 예 열), VRC 25 µ L 및 각 프로브 (200 nM 최종)의 5 µ L를 혼합.<ol>
<li>Formamide 산화를 방지 하기 위해 튜브를 열기 전에 실내 온도 (-20 ˚C에서 냉동) 교 잡 버퍼를 녹여.</li>
		<li>200mm VRC, 프로브를 추가 하기 전에 5-10 s에 대 한 소용돌이 추가한 후에 설계 상업적으로, 구입 그리고 제조업체의 지침에 따라 재구성.</li>
		<li>2 프로브 공동 incubated 있다면, 추가 1시 10분의 1 µ L 프로브 #1 주식으로 1시 10분의 1 µ L의 희석의 최종 희석 수 있도록 프로브 #2 주식의 희석 ~ 어느 프로브에 대 한 1: 500. 최상의 신호 대 잡음 비율 요구에 필요한 농도 최적화 (자세한 내용은 토론 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 유해 폐기물에 pipetting으로.</li>
	<li>각 튜브를 교 잡 솔루션의 적어도 50 µ L를 추가 합니다. 믹스에 튜브를 터치 합니다.</li>
	<li>어둠 속에서 적어도 16 시간 동안 롤러 드럼에 30 ˚C에서 품 어.</li>
</ol>주 2/3 일
3. 세척 및 이미징
<ol><li>실내 온도에 formamide를가지고.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 10 %formamide 워시 버퍼 (FWB)를 준비 합니다.</li>
	<li>롤러 드럼에서 튜브를 제거 하 고 빛 으로부터 보호 하기 위해 호 일 커버 상자에 그들을 배치.</li>
	<li>원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 유해 폐기물에 pipetting으로.</li>
	<li>부드럽게 위아래로 pipetting으로 10 %FWB 1 mL에 resuspend 번 2-3.</li>
	<li>30 분 (회전 하지) 호 적용 상자에서 30 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>3 분 pipetting, 상쾌한 유해 폐기물을 제거에 대 한 샘플 ~ 376 x g에서 원심 고 ~ 50 µ L를 둡니다.</li>
	<li>한편, 15 mL 원뿔 튜브에 DAPI/FWB 준비: 1 샘플, 5 mg/ml DAPI 1 µ L 1000 µ L 10 %formamide 워시 버퍼의 혼합. 10 샘플, 5 mg/ml DAPI 10 µ L로 10 %formamide 워시 버퍼의 10 mL를 섞는다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 DAPI/FWB의 1 mL에 resuspend 번 2-3.</li>
	<li>30 분 (회전 하지) 호 적용 상자에서 30 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>안티 표 백제 시 약 얼음에 녹여</li>
	<li>원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 완전히 pipetting으로. 필요한 경우, 모두는 상쾌한 제거 하려면 다시 원심.</li>
	<li>즉시 이미지는 샘플에 대 한 GLOX 버퍼 없이 효소의 50 µ L에 펠 릿을 resuspend. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 3-4 회를 섞어.<ol>
<li>모든 unimaged 샘플 호 적용 상자에서 4 ˚C에까지 계속 준비 이미지. 이미지를 준비, 2 분 ~ 376 x g에서 샘플 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 완전히 제거 하는 방법. 아래와 같은 효소 GLOX에 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플에 대 한 즉시, 몇 군데 되 고 효소 GLOX 버퍼의 15-20 µ L을 추가 합니다. 부드럽게 피펫으로 위아래를 섞어입니다. 참고: 볼륨 추가 셀 펠 릿의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 우리 효소 GLOX 버퍼의 15 µ L에 펠 릿을 resuspending 하는 것을 권장 하 고 현미경에 셀 밀도 확인 합니다. 세포는 너무 조밀한 (세포 서로 응집), 효소 추가 GLOX 버퍼를 추가 합니다. 셀 너무 스파스 있다면, 원심 샘플 하 고 버퍼의 ~ 5 µ L을 제거 합니다.</li>
	<li>피펫으로 5 µ L coverslip (18 m m x 18 m m, 제 1 호), 그리고 넣어 슬라이드에 coverslip에.</li>
	<li>넣어 슬라이드 위에 실험실 지우기는 coverslip 배치 됩니다. 부드럽게 슬라이드 (액체는 coverslip의 모든 4 개의 가장자리에서 빼야 보아야 한다)를 설정 하는 실험실 지우기에 누릅니다.</li>
	<li>알루미늄 호 일에 의해 포함 하는 상자에 현미경을 슬라이드를 전송 합니다.</li>
	<li>이미지 와이드 필드 형광 현미경을 사용 하 여 높은 확대 (60-100 X)와 높은 수 가늠 구멍. 참고: smFISH 프로브에 의해 방출 되는 광자의 최대 수를 수집, confocal 현미경 권장 하지 않습니다, 그들은 크게 수집 빛의 양을 제한으로. 여기, 데이터 수집 했다 100 X, 1.4 나 목표를 갖춘 현미경에 CY5 필터를 사용 하 여 (EX632/22, EM679/34) 1.3에서 몇 군데 s, 100 %T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100 %T; 그리고 DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, 32%-50 %t. 밝은 필드 참조 이미지 또한 취득 한다. 0.1-0.2의 스텝 크기와 15-25 조각 취득 µ m에서 전적으로 전적으로 위, 보기의 필드의 초점 아래 있도록 그의 모든 RNA 명소는 차지 했다.</li>
</ol>4. 이미지 분석
<ol><li>물고기-양의17 , StarSearch2, 등 게시 된 smFISH 분석 도구 또는 실험의 정확한 요구 사항에 따라 맞춤 프로그램, smFISH 데이터를 분석 합니다. 참고: 좋은 분석 파이프라인 진정한 RNA 명소는 배경에서 분리 하 고 X, Y 및 Z (옵션) 좌표와 각 자리, 각 셀에 관광 명소의 수의 강도 등의 통계를 출력 하는 임계값을 확인 하려면 사용자를 허용 해야 합니다. 그리고 아마도 거짓 탐지를 필터링 하는 방법으로 매개 변수를 피팅.</li>
</ol>

<ol><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
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<li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li>
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<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
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</ol>

저자는 공개 충돌의 관심 있다.

여기에 제시 된 프로토콜 다른 게시 된 smFISH 프로토콜2,3,21,,2223에서 파생 되 고 효 모 스트레인 배경 SK1 최적화입니다. 최적화 된 매개 변수 셀 번호, 고정 기간, 원심 분리 속도 기간, 소화 기간, 소화 버퍼, 프로브 농도 및 교 잡 버퍼 포함. 교 잡 온도 기간 같은 다른 매개 변수 최적화 하지 했다. 이 섹션에서 우리는이 프로토콜 어떤 효 모 스트레인 배경 및 관심사의 성장 조건에 적응 하는 데 도움이 될 몇 가지 메모를 공유.
싹 트는 효 모의 세포 벽은 프로브 삽입을 방지 하는 세포 벽 때문에 싹 트는 효 모에 높은-품질 smFISH 이미지를 획득 하는 것에 대 한 하나의 주요 도전 이다. Zymolyase에 의해 세포 벽의 불완전 한 소화는 프로브와 신호에 높은 셀 다양성의 비효율적인 교 잡 이끌어 낸다. 그러나, 이상의 소화 수 셀 너무 연약 할 중요 한 선도 세척 단계 동안 손실 셀 및 셀 이미징에 대 한 슬라이드 준비 중 붕괴. 따라서, 소화 기간 최적화 매우 중요입니다. 서로 다른 양의 시간에 대 한 동일한 샘플을 소화 하 여 파일럿 smFISH 실험을 실시 하는 것이 좋습니다. 우리의 경우, 우리 최고의 smFISH 데이터를 얻은 하는 셀의 ~ 80%가 비 굴절 될 때 우리가 소화 중지. 일반적으로, 동일한 성장 조건에 대 한 다른 유전자 돌연변이 체 긴장 비슷한 타이밍으로 소화 될 수 있습니다. 그러나, 소화 기간 다른 성장 조건 및 싹 트는 효 모에 감수 분열의 다른 단계 사이에서 비교 될 때 다릅니다. 타이밍 결정 되 면 smFISH의 품질이 재현 합니다. 참고 결함 세포 벽 합성 또는 구성 돌연변이 체 긴장에 대 한 소화 zymolyase의 다른 배치의 사용 미만 15 분 내에 완료 될 수 있습니다 또한 약간 소화 타이밍을 변경할 수 있습니다.
최적의 프로브 농도 높은 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 필요 합니다. 우리가 설계 하 고 상업적으로 우리의 smFISH 프로브를 구입. 좋은 프로브 (종종 20-메) GC 35%에서 45%, 프로브, 그리고 낮은 분 사이 2 기본적인 쌍의 최소 간격 사이의 비율을 가져야 한다. 우리 프로브, 목록을 생성 하는 제조 업체에서 웹 기반 조사 디자이너를 사용 하 고 충분 한 프로브에서 선택할 수 있다면, 우리는 알고리즘을 사용 폭발 Saccharomyces 게놈 데이터베이스에서 이상의 17 자료 쌍 겹쳐 프로브를 제거 하 과 다른 게놈 영역입니다. 우리는 더 많은 photostable 형광 염료 (CAL Fluor 590) 때문에이 세트에서 (20 프로브) 위의 기준을 모두 만족 하는 프로브 수 보다 낮은 NDC80luti (CF 590)의 독특한 영역에 anneals 프로브 세트에 대 한 선택은 (~ 25 프로브) 제조업체에서 권장 하는 최소 수입니다. 제조업체의 지침에 따라 프로브 솔루션, 재구성 후 우리가 만든 1시 10분 희석 재고 솔루션의 희석된 솔루션-20 ˚C에서 5 µ L aliquots에 저장. 각 약 수 한 번만 사용 되었다. 최적화, 하나 직렬 해야 희석 1:10에서 희석 솔루션 및 테스트 어느 농도 수익률 최상의 신호 대 잡음 비율. 1: 250, 1: 500, 1:1000, 및 원래 주식에서 1: 2000의 희석 시리즈를 만드는 것이 좋습니다. 우리의 경우, 1: 500 희석 요인 CF 590 및 Q 670 프로브 세트에 대 한 최상의 신호 대 잡음 비율 귀착되는.
최적의 고정 시간 성공적인 smFISH 신진 효 모에 대 한 중요 한 이기도합니다. 우리는 하룻밤 고정 4 ˚C에서 발견 보다는 크게 meiotic 샘플에 대 한 smFISH 결과의 품질과 일관성을 개선 20 분 동안 실내 온도에 고정. 우리는 테스트 하지 않지만 고정 식물 샘플 영향을 줄 수 어떻게 하룻밤, 실 온에서 고정이 성장 조건을 잘 일했다. 따라서, 새로운 긴장 또는 성장 조건에 대 한 smFISH 프로토콜을 최적화 하려면 좋습니다 실내 온도에 짧은 고정 시간으로 시작 하 고 증가 하는 고정 시간 신호의 높은 다양성 발생 하는 경우.
다른 게시 프로토콜3,,2223와 비교해, 우리의 프로토콜 소화와 교 잡 동안 VRC의 높은 농도 중 VRC RNase 억제제를 사용 합니다. 이 두 단계에의 VRC 추가 향상 smFISH 결과의 일관성 가능성이 더 나은 nuclease 활동, zymolyase 믹스 (효소 원유 추출 물에서 정화와 RNase 포함 될 수 있습니다에 의해 도입 될 수 있습니다에 대 한 RNA 분자를 보존 오염 물질)입니다. 따라서, 우리의 프로토콜 또는 VRC의 최적화를 위한 더 높은 농도에 나와 VRC의 금액을 사용 하는 것이 좋습니다.
셀의 상당 부분 버퍼 B에 formamide 워시 버퍼 세척 단계 동안 손실 될 수 있습니다. 셀 손실을 줄이기 위해, 하나는 원심 분리 속도 증가할 수 있었다. 우리의 경우, 버퍼 B 동안 우리의 샘플 작은를 고속 (21000 x g)를 사용 하 여 씻어 크게 감소 셀 손실. 그러나, 셀 될 zymolyase 소화 후 매우 깨지기 쉬운 그래서 원심 분리 속도 변경 권장 되지 않습니다. 대신, 셀 formamide 워시 버퍼에서 세척 하는 동안 작은 도움이 크게 미국 과학에서 낮은 접착 튜브 사용 하 여 하는 것이 좋습니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜 지속적으로 효율적인 이미징 충분히 밀도 세포의 단층을 생성할 수 있습니다. 일반적으로, 7 시야를 산출 해야 한다 > 130 셀 정량화에 적합.
마지막으로, 그것은 대 한 최적의 이미지 분석에서 필요한 출력을 결정 하는 것이 중요입니다. SmFISH 관광 명소를 검색, 게시 된 분석 프로그램 일반적으로 배경 신호를 제거 하려면 가우스 알갱이 사용 하 여 원시 이미지를 필터링 하 고 이미지2,17의 각 집합에 대해 사용 하 여 신호 대 잡음 비율을 결정 하기 위해 사용자에 게 요청. 불행히도, 거기 현재는 적절 한 매개 변수 결정 됩니다, 단일 표준 이며 그래서 이러한 다른 설정의 몇 가지 경험적 테스트 하는 것은 필요. 각이 단계에 필요한 매개 변수를 설정 하려면 하나는 반복적으로 다른 매개 변수 집합을 입력 하 고 얼마나 잘 각 세트에서 얻은 결과 일치 하는지 몇 가지 대표적인 셀에서 수동 계산에서 확인 해야 합니다. 매개 변수 한 집합이 발견 되 면 그것은 다른 성장 조건과 유전적 배경에 불구 하 고 얻은 이미지의 대부분을 위해 사용할 수 있습니다.
또한, 하나는 smFISH 이미지의 최대 강도 투영 정량화22전에 수행할 수 있는 경우 테스트할 수 있습니다. 이 단계 자리 탐지 알고리즘을 단순화 하 고 크게 영상 시간, 비록 그들의 subcellular 지 방화 등 개별 관광 명소에 대 한 일부 잠재적으로 유용한 정보 비용 감소. 우리의 경우, NDC80 유전자에 의해 생산 하는 mRNA 분자의 수가 이었다 충분히 낮은 반점 (드문 일 신진 성적 증명서3,7효 모에 대 한)이이 처리 후 잘 분리 되었다. Colocalization 분석 중요 한 경우에 분석 파이프라인 각 smFISH 자리 colocalization를 평가 하기 위해 각 채널에서의 위치를 결정 해야 합니다. 특정 질문에 따라 질문 하 고, 각 명소의 강도 등 다른 정보 또한 추가 분석을 위해 파이프라인에서 압축을 풀 게 할 수 있습니다. 프로토콜에 단계는 키를 최적화와 이미지 분석 파이프라인 관심 질문 공부를 smFISH 데이터의 높은 품질을 얻기에서 결정적 이다.

유전자 발현의 동적 규칙 물질 대사에 유기 체, 환경 스트레스, 감염, 그리고 변화에 응답의 개발 드라이브. RNA 풍부를 측정 하는 기술에 의존 하는 transcriptional 규칙에 집중 하는 연구. 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH), 불리 한 그러한 방법, 단일 셀1,2개별 RNA 분자의 탐지를 위해 사용 됩니다. 이 메서드는 셀 유전자 발현의 측정 및 세포내 RNA 지역화의 결정을 수 있습니다.
가장 일반적으로 사용된 smFISH 기술, 개별 RNA 분자의 탐지 여러 짧은 DNA 프로브를 (종종 ~ 48 20-메 르 프로브) 대상 RNA 보완 하 고 같은 형광 염료를 활용 합니다. 약한 신호 귀착되는 단일 형광 프로브의 바인딩 하지만 모든 프로브의 앙상블에서 신호는 강력한. 이 기능은 크게 단일 프로브 오프 대상 바인딩 전시 수 있습니다, 비록 이러한 신호는 될 것으로 예상 매우 약한 대상 RNA 분자3의 비교 때문에 신호 대 잡음 비율을 향상 시킵니다. 오류 검출, 내 RNA 분자의 수는 계산 고 다양 한 성장 조건 및 다른 뮤턴트 들을 비교 될 수 있습니다.
첫 번째 개발, 이후 smFISH 맞게 조정 되었습니다 유전자 식4, 녹음 방송 신장1,2,5,6,7 을 파열 transcriptional 접합 등의 다양 한 측면을 연구 하 , 8 , 9, 세포내 유전자 식10,11,12, 그리고 RNA 지역화13,,1415. 최근에, 우리는이 방법을 사용 하는 동일한 유전자의 두 사본 isoforms의 표정을 연구 하 짧은 사본 isoform (NDC80ORF) 긴 isoform (NDC80luti 와 공유의 전체 순서는 )16. 두 개의 mRNA isoforms를 고유 하 게 식별 하려면 사용 하는 두 개의 프로브 세트: 1 세트 NDC80luti의 독특한 시퀀스에 특정 이며 다른 설정, 다른 형광 성 염료에 활용 된 두 개의 isoforms의 공통 영역에 바인딩합니다. NDC80luti RNA로 식별 됩니다 colocalized 자리 두 형광 신호, 반면에 NDC80ORF RNA만 일반적인 프로브 세트에서 신호를 포함 하는. 수 이후는 NDC80ORF 성적 조사 교 잡의 높은 효율성과 높은 신호 대 잡음 비율은 자신 있게 smFISH 관광 명소를 식별 하 고 오류를 감소 하는 데 필요한 "빼기" 방법에 의해 계산 번 식입니다.
이 문서는 싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 smFISH를 수행 하기 위한 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜, 휴대폰 번호, 고정 시간, 소화, 소화 버퍼, 프로브 농도, 시간과 교 잡에서 버퍼 smFISH 실험을 위해 사용 했다 SK1 긴장의 배경 S. cerevisiae 겪고 식물에 대 한 최적화 된 성장 또는 감수 분열입니다. 그러나, 우리는 또한이 원고에 참고: (1) 이미지 수집, 및 (2) 다른 스트레인 배경 및 성장 조건에 대 한 추가적인 최적화 필요할 수 있는 프로토콜의 단계 후 smFISH 데이터의 품질을 확인 하는 메서드.

<table><tbody><tr><td>BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>-20°C에서 보관.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>4 &deg에 저장; C는 단기입니다. 사용하기 전에 소용돌이.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>D9564</td><td>-20 &deg에 저장; C는 물에서 재구성 후. 빛으로부터 보호하십시오.</td></tr><tr><td>50% 덱스트렌 설페이트</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>실온에서 보관하십시오. 매우 점성이 있는 액체. 인내심을 가지고 다루십시오.</td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>-20 &deg에 저장; C는 물에서 재구성 후 부분 표본에서 발생합니다.</td></tr><tr><td>에탄올 (100 %, 200 proof)</td> <td>다양한</td><td></td><td>가연성.</td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>실온에서 보관하십시오. 유독. 주의해서 사용하고 폐기하십시오.</td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>4 °C에서 보관하십시오. 산화를 방지하기 위해 온도가 실온과 평형 한 후 개봉하십시오. 유독. 주의해서 사용하고 폐기하십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>포도당</td><td>다양한</td><td></td><td>상점 4 &deg; C 뉴클레아제가 없는 물에 용해된 후.</td></tr><tr><td>포도당 산화 효소</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>-20 &deg에서 저장; 50 mM NaOAc, pH 5에서 재구성 후 부분 표본의 C.</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>인산칼륨 (monobasic 및 dibasic)</td> <td>다양한</td><td></td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>프로브 라이브러리, TE로 희석, pH 8.0&nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Store -20 &deg; 부분 표본의 C (5 &micro; L) TE pH 8.0에서 재구성한 후 제조업체의 지침에 따릅니다. 빛으로부터 보호하십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>소르비톨</td><td>다양한</td><td></td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>-20 &deg의 매장; 부분 표본의 C.</td></tr><tr><td>200 mM 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체 (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>-20 &deg에 저장; C는 재구성 후 부분 표본에서 제조업체의 지침에 따릅니다.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>-20 &deg에 보관; C는 물에서 재구성 후 부분 표본에서 발생합니다.</td></tr><tr><td>저접착 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr></tbody></table>

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smfish) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 단일 셀 검색 하 고 개별 RNA 분자를 계산 하는 능력 때문에 유전자 발현을 연구 하는 강력한 기술입니다. 깊은 시퀀싱 기반 방법 보완, smFISH 사본에 셀 변화와 특정된 RNA의 subcellular 지 방화에 대 한 정보를 제공합니다. 최근, 우리 사용 smFISH 신진 효 모 감수 분열 동안 NDC80 유전자의 표현 연구, 어느 두 기록에서 isoforms 존재 하 고 짧은 사본 isoform는 긴 isoform와 공유의 전체 시퀀스. 각 사본 isoform를 자신 있게 식별 하려면 우리는 알려진된 smFISH 프로토콜을 최적화 하 고 높은 일관성과 신진 동안 샘플에 대 한 smFISH 데이터의 품질을 얻은 감수 분열 효 모. 여기, 우리는이 최적화 된 프로토콜, 우리 smFISH 데이터의 고품질 얻을 여부 및 다른 효 모 종자와 성장 조건에서이 프로토콜을 구현 하기 위한 몇 가지 팁을 확인 하는 데 사용할 조건을 설명 합니다.

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

이 최적화된 단일 분자 RNA 제자리 혼성화(in situ hybridization, smFISH)의 전반적인 목표는 발아 효모의 식물 성장 및 감수분열 동안 세포별로 개별 RNA 분자를 검출하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 세포 내 RNA 국소화에서 유전자 발현의 세포 간 다양성을 보여주므로 유전자 조절을 연구하는 강력한 기술입니다. smFISH에 의해 밝혀질 수 있는 고유한 정보 외에도 이 기술의 주요 장점은 일단 최적화되면 강력하고 재현성이 높다는 것입니다.이 프로토콜의 시연을 위해 감수분열 배양이 사용됩니다. 3% 포름알데히드의 배양물을 고정하려면 2밀리리터 미세원심분리기 튜브에 37% 포름알데히드 160마이크로리터에 배양물 1840마이크로리터를 첨가합니다. 약 5회 뒤집어 섞습니다.튜브를 실온에서 20분 동안 롤러 드럼에 놓습니다. 20분 후 섭씨 4도에서 밤새 교대로 고정을 계속합니다. 다음 날에는 먼저 200밀리몰의 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체(VRC)를 섭씨 65도에서 최소 10분 동안 해동하여 소화를 준비합니다.분해 마스터 믹스를 준비하려면 먼저 2125마이크로리터의 버퍼 B를 15ml 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 따뜻한 VRC를 5초 동안 소용돌이치게 하여 완전히 재현탁시키고 15ml 튜브에 200마이크로리터의 VRC를 추가합니다. 혼합물은 밝은 갈색을 띤 녹색으로 나타나야 합니다.감수분열 샘플을 21, 000 x g에서 실온에서 1분 30초 동안 원심분리합니다. 상등액을 조심스럽게 흡입하고 펠릿을 방해하지 않도록 진공 팁을 펠릿의 반대쪽에 놓습니다. 1.5 ml의 저온 완충액 B에 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 세포를 재현탁시킵니다.21, 000 x g에서 1분 30초 동안 원심분리기. 진공 흡입으로 액체의 대부분을 제거하고 약 100 마이크로 리터를 남겨 둡니다. 1 밀리리터의 콜드 버퍼 B에 세포를 재현탁합니다.샘플을 원심 분리하고 액체를 제거한 다음 1 밀리리터의 콜드 버퍼 B에 세포를 다시 현탁시킵니다.21, 000 x g에서 1분 30초 동안 원심분리기. 피펫팅으로 액체를 완전히 흡입합니다. 425 마이크로 리터의 소화 마스터 믹스와 와류에 세포를 잠시 재현탁시킵니다.5마이크로리터의 자이몰리아제를 튜브에 넣고 2-3초 동안 섞습니다. 튜브를 롤러 드럼에 놓고 섭씨 30도에서 15-30분 동안 소화합니다. 15 분 후, 매 5 분마다 현미경 검사로 세포를 확인하고 세포의 약 80 %가 불투명하고 굴절되지 않는 것처럼 보일 때 소화를 중지하십시오.376 x g에서 튜브를 3분 동안 원심분리합니다. 상등액을 완전히 제거하십시오. 1ml의 buffer B로 1-2회 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 세포를 부드럽게 재현탁합니다.튜브를 원심분리하고 버퍼를 제거합니다. 1ml의 70% 에탄올에 세포를 부드럽게 재현탁시키고 실온에서 3시간 반에서 4시간 동안 배양합니다. 혼성화 절차를 시작하려면 376 x g에서 3분 동안 세포 튜브를 원심분리합니다.튜브에서 500 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 제거합니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 남은 세포를 재현탁시키고 세포를 저접착 튜브로 옮깁니다. 샘플을 저접착 튜브로 옮기는 것은 후속 포름아미드 세척 중에 과도한 세포 손실을 방지하는 데 중요합니다.저접착 튜브를 원심분리하고 모든 에탄올을 제거합니다. 10% 포름아미드 세척 완충액 1ml를 튜브에 넣고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁시킵니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 혼성화 용액을 준비하는 동안 세포를 약 20분 동안 실온에서 설정하도록 합니다.샘플을 원심분리하고 상등액을 유해 폐기물로 제거합니다. 각 혼성화 용액을 튜브에 최소 50마이크로리터를 추가하고 튜브를 튕겨 혼합합니다. 섭씨 30도의 롤러 드럼에서 어둠 속에서 최소 16시간 동안 배양합니다.혼성화가 완료되면 세포관을 호일로 덮인 상자에 넣어 빛으로부터 보호합니다. 376 x g에서 3분 동안 샘플을 원심분리합니다. 피펫팅으로 상층액을 유해 폐기물로 제거합니다.1ml의 10% 포름아미드 세척 완충액에 샘플을 2-3회 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다. 세포관을 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 덮인 상자에 다시 넣고 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후 샘플을 원심분리합니다.피펫팅으로 상층액을 유해 폐기물로 제거하고 약 50 마이크로 리터를 남겨 둡니다. 1ml의 DAPI 용액에 샘플을 두세 번 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다. 다시 한 번, 세포 튜브를 호일로 덮인 상자에 넣고 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다.샘플을 원심분리하고 피펫팅으로 상층액을 완전히 제거합니다. 즉시 이미지화되지 않는 샘플의 경우, 효소 없이 50마이크로리터의 GLOX 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 피펫을 위아래로 3-4회 혼합합니다.이미지화할 준비가 될 때까지 섭씨 4도의 호일로 덮인 상자에 보관하십시오. 즉시 이미징되는 샘플의 경우 효소와 함께 15-20마이크로리터의 GLOX 완충액을 첨가하십시오. 5마이크로리터를 피펫으로 커버 슬립에 끼우고 커버 슬립을 슬라이드에 놓습니다.커버 슬립이 놓인 슬라이드 위에 실험실용 물티슈를 놓습니다. 와이프를 부드럽게 눌러 슬라이드를 설정합니다. 현미경실로 옮기기 위해 알루미늄 호일로 덮인 상자에 슬라이드를 넣습니다.이 프로토콜은 두 개의 mRNA 동형을 발현하는 NDC80 유전자의 발현을 검사하는 데 사용되었습니다. 긴 디코딩되지 않은 전사체 동형은 짧은 동형에 비해 400 염기쌍 5 소수 확장을 가지고 있습니다. 두 세트의 프로브가 설계되었습니다.CF 590 세트는 긴 동형의 고유한 5개 프라임 영역에 결합하고 Q 670 세트는 두 동형의 공통 영역에 결합합니다. 최적화된 조건에서 두 프로브 세트 모두에 대해 뚜렷한 smFISH 스폿이 명확하게 식별되었습니다. 두 개의 프로브 세트는 식물 성장 및 감수 분열 중 NDC80 발현을 연구하는 데 사용되었습니다.식물 세포에서는 Q 670 프로브 세트의 강력한 신호가 감지되었지만 CF 590 프로브 세트에서는 감지되지 않았습니다. 대조적으로, 두 프로브 세트의 강력한 신호는 감수분열 전구기에서 감지되었으며 대부분의 스폿은 공동 국소화 신호를 가졌습니다. 노던 블롯 분석은 긴 동형이 감수 분열에서 특이적으로 발현되는 것을 확인했습니다.식물 세포는 세포당 5개의 짧은 동형 전사체의 중앙값을 갖는 것으로 밝혀진 반면, 감수분열 전구 세포에서는 중앙값이 세포당 4개의 전사체로 크게 떨어졌습니다. 감수분열 전구기(meiotic prophase)에서 세포당 긴 동형체 전사체의 중앙값은 21개였으며 세포의 100%가 전사체를 발현했습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 72시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 먼저 최적의 신호 대 잡음비를 달성하는 데 필요한 분해 시간과 smFISH 프로브의 농도를 최적화하는 것이 중요합니다. 또한 뉴클레아제 활성을 방지하기 위해 소화 및 야간 혼성화 중에 VRC를 추가하는 것을 잊지 마십시오. 이러한 발전을 통해 이 기술은 연구자들이 동적 유전자 조절과 세포 내 RNA 국소화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 발아 효모 감수분열에서 단일 분자 RNA FISH를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기에 침묵 교미 loci HML과 HMR에서 형광등 기자 적용 성장 고정화 효모 세포의 시각화에 대한 신속한...

라이브 고정화 효모 세포의 시각화에 대한 신속한 기술

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

이 프로토콜은 형광을 수행하기위한 실험 절차를...

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

우리는 핵분열 효모 성 수명 주기의 장기 현미경을 위한 재현 가능한 기본 방법을 제공합니다. 설명된 사소한 조정과 함께 제시된 프로토콜은 생식 과정의 여러 단계에 대한 연구의 초점을 맞출 수 있도록 합니다.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

이 프로토콜은 mRNA 합성 및 분해의 생체 내 운동학을 측정하기 위해 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광의 적용을 설명합니다.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

단일 분자 RNA 형광은 시투 혼성화(smFISH)에서 단일 세포 수준에서 특정 RNA의 수준 및 국소화를 정확하게 정량화하는 방법이다. 여기서는 특정 RNA의 단일 세포 정량화를 위한 습식 벤치 처리, 이미징 및 이미지 분석을 위한 검증된 실험실 프로토콜을 보고합니다.

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

배우세요 단일 분자 형광 제자리 교잡법(smFISH)을 이용하여 효모의 무성 생장 및 감수 분열 동안 RNA 분자를 정량 분석하는 방법입니다. 이 기법은 유전자 발현의 세포 간 변동성과 아세포 RNA 국소화를 밝혀내어 유전자 조절 연구에 강력한 도구를 제공합니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

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