における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

心臓由来の細胞を細胞培養プレートに載せ、虚血を模擬します。再灌流モデル虚血は、グルコースフリー培地で150分で達成されますが、酸素レベルは0.5%未満ですこの虚血期間は、ほとんどの細胞の縮小とブラブにつながります。次に、正常な培地と酸素レベルを再導入して、再灌流をシミュレートします。

間葉系幹細胞を添加し、損傷した細胞と一緒に培養します。共培養の24時間後、細胞をカルシウムとイーサリアムホモダイマーで染色します 生細胞と死細胞を区別するために、共焦点顕微鏡では、2つの細胞集団とその相互作用 フローサイトメトリー分析により、損傷した細胞の3つのクラスターが明らかになり、グラフにプロットして統計的に分析できる幹細胞移植。プロトコルは、臨床診療への道を見つけ、より良い結果を得て、プロトコルをより堅牢にし、埋め込み型細胞の新しい供給源を見つけることが最近の研究の焦点です。

細胞治療の有効性を調べることは容易ではなく、治療過程に関与するメカニズムを調査するための新しいツールが必要です。私たちは、虚血、灌流障害、および幹細胞移植後の細胞結合、さらには細胞内メカニズムの観察を可能にするために、実験プロトコルを設計しました。私たちの設計基準、完全なin vitroシステムですが、宿主細胞とドナー細胞のみが存在します。

そのため、周囲の組織から分離されています。損傷前、損傷中、損傷後の細胞生存率を最大24時間連続測定します。また、両方の細胞集団を明確に識別できるため、移植された細胞の運命を追跡できます。

この目標を達成するために、私たちは酸素、グルコース欠乏、一般にOGDと略されるグルコース欠乏のプロトコルを設定し、その後に再酸素化期間が続きます。宿主細胞の選択は、既知の赤色心筋芽細胞株を介した9歳C細胞2細胞でした。OGD後、損傷した細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞を培養物に加えることにより移植することにより支持されました。

このセットアップにより、共焦点フォレストと顕微鏡法を使用して細胞間接続を調査し、フローサイトメトリーによって損傷した細胞の生存率を定量化することができました。さっそく仕事に取り掛かり、どのように行うか見てみましょう。H nine C two cellsから培地を取り出します。

PBSで細胞を2回洗浄し、0.05%トリプシンEDTAで消化し、ペトリ皿を5分間置きます。37°インキュベーターで、DMEM培地でトリプシンを阻害します。細胞を1200 RPMで8分間スピンダウンします。

スーパーナチン再懸濁細胞を1ミリメートルDM EM培養で除去した後、トリアムブルー染色C30,000H9C1ウェルあたり2細胞を染色したサイトメーターで細胞を培地にカウントします。12ウェルプレートで、プレートを37度の二酸化炭素インキュベーターに24時間入れます。吸引により培地を除去し、細胞をPBSで2回洗浄します。

3ミリメートルのグルコースフリー培地を追加します。プレートを細胞インキュベーションシステムに入れます。窒素ガスを開始して、インキュベーションシステムから酸素をパージします。

酸素のレベルが0.5%に達するまで待ってからタイマーを開始し、0.5%酸素は、150分間の模擬虚血に細胞の水銀部分張力対象細胞の約3ミリメートルを意味します。虚血中、細胞は表面から剥離し、その膜が剥離し始めます。その結果、各集団はわずかに異なる時間を必要とし、細胞画像の60〜80%に達することがわかりました。

そのため、2つのRインキュベーションから始めることをお勧めします。そして、それだけでは不十分な場合は、OGDの時間を増やしてください。私たちの場合、年齢9 C 2細胞は通常、シミュレートされた虚血の終わりに150〜70分のOGDを必要とします。

グルコースフリー培地を細胞から取り出し、通常の培養培地をウェルにピペットで移します。12ウェルプレートを37度の二酸化炭素インキュベーターに30分間置きます。これが再灌流期間です。

シミュレートされた虚血中に、移植用のレスキュー細胞を準備します。蛍光食を希釈し、DMEM培養で1対200の比率で鮮やかなDIDを投与します。レスキュー細胞から培地を吸引し、37度の二酸化炭素インキュベーターで30分間、鮮やかなブレントプレイシャーレから300マイクロリットルのDMEMを追加します。

再灌流の終了時に30分後、井戸あたり1000個の間葉系幹細胞を虚血後H9Cの2つの心筋芽細胞に投与します。最初のステップは、H、9、C、2播種、PBSトリプシンで2回洗浄し、カウントするのと同じです。細胞の共培養物を37度の二酸化炭素インキュベーターに24時間入れます。

24時間後。培養培地と付着細胞を井戸から回収します。また、24時間のインキュベーション中に一部の死細胞が培養皿の表面から剥離する可能性があるため、培地を収集することも非常に重要です。

500マイクロリットルの生きた、死んだ、死んだ溶液、5つのNMOカルシウム、およびPBS中の400NMOイーサリアムホモダイマーの細胞を5×10で4細胞/ミリリットルの累乗に懸濁します。共培養の場合、間葉系幹細胞は、それぞれの蛍光細胞標識によってH nine C 2つの細胞と区別されます。このようにして、細胞融合および細胞間接触部位を検出することが可能です。

死細胞の比率は、ブラインド方式で各培養物の10倍の目標を使用して、4つの独立した視野で評価することができ、再現性のある細胞数の結果が得られます。細胞をフローサイトメトリーチューブに移します。Cell Quest Proソフトウェアを起動して、フローサイトメーターを測定用に設定します。

生細胞と死細胞のコントロールサンプルを調製します。生細胞は、正常な状態で同じ密度で培養され、カルシウムで染色されます。死細胞は、イーサリアム、ホモ二量体で染色された10マイクロモルの過酸化水素で1時間処理して調製し、同じ方法で回収します。同じ方法で、生細胞がカルシウム陽性でイーサリアムホモ二量体陰性になるように装置の設定を調整する必要があります。

死んだ細胞はカルシウム陰性でイーサリアムホモダイマー陽性ですが、これらの集団の割合はグラフ上の棒で表すことができ、これらの値に対して統計分析を実行できます。その結果、健康な幹細胞が加わると、集団内の生存細胞の割合が増加することがわかりました。興味深いことに、損傷後に保存された細胞は、死んだ細胞だけでなく、生き残った細胞からもゲートアウトできることも観察しました。

この集団はさらなる調査が必要であると私たちは考えています。このビデオを見れば、in vitro幹細胞移植を用いた模擬虚血実験を標準化された方法で行う方法について、十分に理解できるはずです。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。技術的なご質問がございましたら、お気軽にお問い合わせください。私たちがお手伝いします。