조직 평가에 대한 자기 공명 Elastography 방법론은 구조 성장하는 기술

공학적으로 제작된 조직 구조물을 조사할 때, 흔히 시료의 파괴를 초래하는 전통적인 기계적 시험 방식은 적절하지 않습니다. 본 방법에서는 작은 연조직의 기계적 특성을 측정하기 위한 비침습적 기술로 미세 자기공명 탄성도 촬영 또는 micro MRE를 사용합니다. 먼저, 조직을 생성하기 위해 생체 재료 지지체 위에 세포를 배치합니다.

조직을 aros gel에 현탁시키고, 액추에이터의 팁을 젤 내부에 배치합니다. 그 다음 액추에이터의 움직임을 특성화하기 위해 샘플로 전달하고, 레이저 도플러 속도계(Doppler velocimeter)를 사용하여 이를 검출합니다.

시료와 액추에이터를 자석 및 자기공명 장치로 옮깁니다. 엘라스트로그래피 영상을 획득합니다. 결과 영상을 분석하여 골분화 및 지방분화 구조물 모두에서 전단 강성의 변화를 확인합니다.

우리는 먼저 이 기술에 대한 아이디어를 얻었으며, 질병 진단을 위한 자기공명 영상 기술을 관찰함으로써 이를 조직 공학으로 확장할 수 있음을 깨달았습니다. 기계적 시험과 같은 기존의 다른 기술들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 MRI의 비침습적 기술을 조직의 주요 기계적 특성에 적용할 수 있다는 점입니다. 기계적 특성에 대한 지식은 골 및 연골 공학에서 의도한 용도에 적합한지 확인할 수 있게 해주므로, 이 기술의 응용 범위는 조직 공학까지 확장됩니다.

이러한 방법들은 조직 공학에 대한 귀중한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 예를 들어 간 섬유화, 외상성 뇌 손상 또는 뇌암과 같은 다양한 장기의 질병을 진단하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이 방법에는 학습하기 어려운 단계들이 포함되어 있으며, 조직 공학 및 magnitude rhythm imaging에 대한 사전 지식이 필요하기 때문에 이를 시각적으로 시연하는 것이 매우 중요합니다. 조직 구조물 준비 과정은 세포 집단의 확장, 생체 재료 지지체로의 세포 파종, 그리고 화학적 신호 분자를 이용한 분화라는 세 가지 주요 단계로 구성됩니다.

세포주의 배양 및 증식 후, 골 형성을 위해 인간 중간엽 줄기세포 또는 HMC를 1×10⁶ cells/mL의 밀도로 젤라틴 스펀지에 파종합니다. 약 3일 후, 세포가 스캐폴드 상에서 합쳐져(confluent) 분화를 유도할 수 있는 상태가 되어야 합니다. 배지를 제거하고 지방 분화 유도 배지로 교체합니다.

그 후 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 3일 동안 배양합니다. 배지를 10 µg/mL의 human recombinant insulin이 포함된 증식 배지로 구성된 유지 배지로 교체합니다. 24시간 동안 배양한 후, 유지 배지를 유도 배지로 교체합니다.

이 사이클을 세 번 반복합니다. 그 후 골분화를 유도하기 위해 4주 동안 이틀마다 유지 배지를 교체합니다. 연구 기간 동안 이틀마다 신선한 골분화 배지로 교체합니다.

본 연구의 기간은 4주이며, 매주 MRE를 수행합니다. 자기공명 탄성도 측정법은 국소적인 기계적 특성 값을 평가하기 위해 기계적 전단파의 전파에 의존합니다. 따라서 피조 전기 액추에이터를 사용하여 관심 조직 내에서 이러한 기계적 진동을 생성하고 특성화해야 합니다. 시료를 준비하려면, 고체 베이스와 0.5% AGROS 겔 층이 포함된 10 millimeter 직경의 시험관으로 조직 배양물을 옮기십시오.

그 다음, 이를 둘러싸기 위해 따뜻한 0.5% agarose gel을 추가합니다. agarose gel이 5분 동안 굳도록 둡니다.

실온에서 피에조 전기 굽힘 모터(piso electric bending motor)의 팁을 겔 표면에 삽입하십시오. 다음으로, 샘플과 액추에이터가 들어 있는 튜브를 견고한 지지대에 고정하십시오. 레이저 도플러 압력계(laser doppler barometer)의 빔을 기계적 액추에이터의 팁을 향하도록 조절하십시오.

기압계에 표시되는 반사 신호 강도를 최적화하도록 시스템의 위치를 조정하십시오. 반사도를 최대화하기 위해, 필요한 경우 반사 테이프를 사용하여 액추에이터가 약 250 microns의 상당한 진폭을 가진 무해한 전단파를 생성하도록 설정하십시오. 함수 발생기를 설정하여 20 volts peak to peak의 동작 전압과 화이트 노이즈 신호를 사용하여 원하는 주파수 범위를 스윕하십시오.

본 실험에서 요구되는 주파수 범위는 20~2000 hertz입니다. Polytech Rsof 프로그램에서 분석된 스펙트럼을 확인하려면 속도(velocity) 및 FFT 디스플레이를 선택하십시오. 신호 캡처를 시작하고 스펙트럼의 피크를 기반으로 시스템의 공진 주파수를 확인하십시오.

다음으로, 액추에이터의 굴곡을 측정하기 위해 액추에이터가 특성화된 공진 주파수에서 연속 정현파를 전달하도록 설정합니다. 피크-투-피크(peak-to-peak) 동작 전압을 200 volts로 설정하고, 액추에이터가 젤 표면으로 전달하는 변위를 측정하며, 변위를 Y축으로 하여 FFT를 표시하도록 설정합니다. 액추에이터의 특성화가 완료되면, 샘플과 액추에이터가 들어 있는 시험관을 10 millimeter RF 코일의 슬롯에 넣고, 샘플과 액추에이터를 MRI 스캐너의 중심에 배치합니다.

구성체의 위치를 확인하기 위해 스카우트 영상을 획득합니다. 조직 구성체의 위치가 확인되면 영상 획득을 위한 파라미터를 설정합니다. 일반적인 in vitro 시상면 스캔의 반복 시간은 1000 milliseconds입니다.

에코 시간은 20 내지 40 milliseconds, 슬라이스 두께는 0.5 내지 1 millimeter, 시야(field of view)는 12 by 10 millimeter squared이며, 매트릭스 크기는 128 by 128 pixels로 설정합니다. 엘라스토그래피 파라미터의 경우, 액추에이터 주파수를 레이저 도플러 진동계(laser doppler vibrometer) 특성 분석으로 결정된 값으로 설정하십시오. 본 샘플의 경우, 그래디언트 진폭 50 gauss per centimeter와 MRE 지연 시간을 0으로 설정한 1 bp가 필요합니다.

함수 발생기를 버스트 모드로 변경하고, 주파수와 사이클 수를 포함하여 함수 발생기의 파라미터를 엘라스토그래피 획득 파라미터와 일치하도록 조정합니다. 또한, 함수 발생기를 외부 트리거 방식으로 설정하십시오. 시상면 영상을 얻으려면 모션 감도를 양의 슬라이스 방향으로 설정하고 획득 후 스캔을 시작합니다.

이미지를 확인하여 조직 구조체의 신호 품질을 평가합니다. 이미지가 너무 어둡게 보이면 MR 파라미터를 조정한 후 다시 스캔을 수행합니다. 다음으로, 감도를 음수 슬라이스 방향으로 변경합니다.

MRI 스캐너의 파일을 MATLAB이 설치된 다른 컴퓨터로 전송하고, 전단파 전파를 묘사하는 영상을 생성하기 위해 복소 나눗셈을 수행하는 MATLAB 프로그램을 실행합니다. 영상에서 전단파의 존재 여부와 위상 래핑(phase wrapping)과 같은 잠재적 아티팩트를 평가하며, 파동의 품질과 진폭을 더 정확하게 평가하기 위해 라인 프로파일을 플롯할 수 있습니다. 래핑이 발생하는 경우, 그래디언트 진폭을 줄이고 다시 스캔을 수행하십시오.

이미지에 별도의 조정이 필요 없는 경우, 파라미터 배열 크기를 0초부터 특성 분석된 공진 주파수의 전체 주기까지 동일한 간격의 8개 값으로 조정하십시오. 이미지가 획득되면 양(+) 및 음(-)의 슬라이스 방향 모두에서 스캔을 수행하십시오.

전단파 데이터와 샘플 내에서 전파되는 파동의 해당 영상을 생성하도록 설계된 MATLAB 프로그램을 사용하십시오. 이 파일은 기계적 특성을 추정하는 데 필요합니다. MRE의 마지막 단계는 전단파 영상을 통해 전단 강성을 계산하는 것입니다.

먼저 데이터를 3차원 데이터셋을 평가할 MATLAB 프로그램에 입력하고, 시야(field of view), 경사도(gradient), 진폭(amplitude), 바이폴라 쌍(bipolar pairs)의 수를 포함한 영상 파라미터를 지정한 후 코드를 실행합니다. 이 알고리즘을 통해 관심 영역(regions of interest)을 선택하면 각 파라미터의 평균과 표준 편차가 계산됩니다. 조직 구조물의 윤곽선을 그려 관심 영역을 선택하십시오.

선택한 관심 영역 내의 강성, 저장 탄성률 및 손실 탄성률의 평균과 표준 편차가 표시됩니다. 또한, 이 프로그램은 필터링 후의 파형, 방향성 필터링 후의 파형, 그리고 복원도의 신뢰성을 추정하는 데 도움이 되는 라인 프로파일을 포함한 중간 결과물을 제공합니다. 정확한 추정을 위해서는 필터링된 파형이 매끄러워야 합니다.

특정 관심 영역 내 파라미터의 표준 편차는 필요시 계산 품질의 지표가 되며, 공학적 구조물이 발달함에 따라 기계적 특성의 변화를 관찰하기 위해 정확한 기계적 특성 값을 얻을 수 있도록 다른 파라미터들을 적절히 조정하십시오. MRE 테스트는 4주 동안 수행되었습니다. 이 구조물 발달 맵은 A로 표시된 지방분화 및 O로 표시된 골분화 구조물을 나타내며, 이에 해당하는 강도 이미지, 전단파 이미지, ELA 및 평균 전단 강성이 표시되어 있습니다.

ELA의 컬러 맵은 바의 색상 체계와 일치합니다. 차트와 오차 막대는 각 구조체 관심 영역 내의 표준 편차를 나타냅니다. 시간이 지남에 따라 지방 분화 구조체의 강성이 낮아졌으며, 이는 지방 조직과 유사한 특성을 나타냅니다.

마찬가지로, 골분화 유도 구조체는 4주의 기간 동안 더 단단해졌으며, 이는 뼈와 유사한 분화가 일어났음을 나타냅니다. 숙련된 경우, 이 기술을 적절히 수행하면 약 2시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 액추에이터의 특성을 완전히 규명하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에 생화학적 분석 및 조직학 등의 방법을 사용하여 무기질 침착 확인과 같은 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

인체 세포 물질 및 MRI를 사용할 때는 매우 위험할 수 있으므로, 적절한 BL2 및 MRI 안전 수칙을 숙지하는 것이 중요하며, 이러한 절차를 수행하는 동안 주의를 기울여야 함을 잊지 마십시오.