Name: 조직 평가에 대한 자기 공명 Elastography 방법론은 구조 성장하는 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 학습하세요 조직 공학에서 미세 자기 공명 엘라스토그래피(μMRE)를 이용한 비침습적 조직 구조물 역학적 특성 평가 방법을. 이 기술은 샘플을 파괴하지 않고 반복 측정이 가능하여 지방 및 골 형성 조직의 발달을 모니터링합니다.

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이 연구는 NIH RO3-EB007299-02 및 NSF EPSCoR 첫 수상에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 조직 구조 준비 조직은 준비 과정을 구성하는 세 가지 주요 단계로 구성되어 화학 신호 분자의 사용을 통해 세포 인구의 팽창, biomaterial 발판 진입 세포 퍼뜨리고, 그리고 차별화. 구조 준비 절차는 데니스 외., 홍콩 외., 그리고 메리 언과 마오 8,9,10 실시 방법에 따라 달라집니다. <ol><li> 문화와 세포 라인의 확장, 종자 뼈 및 3x10 6 셀 / ML에 대한 1x10 6 셀 / ML의 밀도에 젤라틴 스폰지 진입 인간 mesenchymal 줄기 세포 (H MSCS) (4 밀리미터 직경 3.5 밀리미터 두께)에 대한 후 지방 형성. </li><li> 지방에 H MSCS의 차별 화를 위해, 셀 확장 매체에 1 μm의의 dexamethasone, 0.5 μm의 이소 부틸-methylxanthine, 10 μg / ML 인간 재조합 - 인슐린, 200 μm의 제품 인도 메 타신 구성된 지방 유도 매체를 적용일단 세포가 발판에 합류 나타납니다. 사흘 뒤에, 10 μg / 24 시간 동안 확장 매체에서 인간 재조합-인슐린 ML 후 유도 매체로 돌아가 함께 미디어를 교체하십시오. 주기를 세 번 반복하고 이틀 유지 보수 언론에서만 교환. </li><li> osteogenesis를 유도하기 위해, 0.1 μm의의 dexamethasone, L-아스코르비 산 - 2phosphate 50 μm의, 그리고 셀 확장 매체에서 10 밀리미터 β-glycerophosphate의 최종 농도함으로써 osteogenic 유도 미디어를 준비합니다. 신선한 osteogenic 미디어 이틀로 바꿉니다. </li></ol> 2. 액추에이터 특성화 액츄에이터의 특성은 MRE (군용 식품)의 실험을위한 중요한 단계입니다. MRE (군용 식품)는 기계적 특성의 로컬 값을 평가하기 위해 기계적인 전단 파도의 전파에 의존하므로 이러한 기계적 진동이 압전 액츄에이터를 사용하여 관심있는 조직 내에서 생성 및 특성화해야합니다. 그림 EXA특성화 과정의 mple은 그림 3에 표시됩니다. 이 절차의 목표는 상당한 amplitudes (~ 250 미크론)에 무해한 전단 파도를 생성하기 위해 액츄에이터의 움직임을 최적화하는 것입니다. <ol><li> 실험에 앞서, 10mm 테스트 튜브 구조를 묶으 0.5 % 아가로 오스 겔을 적용합니다. 겔의 온도는되어야 약 37 ° C 구조에 손상을 최소화합니다. </li><li> 아가로 오스 겔 오분은 실온에서 설정할 수 있도록하면 젤의 표면에 압전 굽힘 모터의 끝부분을 삽입합니다. </li><li> 엄격한 지원 샘플 및 액츄에이터를 포함한 튜브를 부착하고, 동양 기계 액츄에이터의 끝 방향으로 레이저 도플러 진동계의 빔. 필요한 경우 반사 신호를 최적화하는 시스템의 위치를​​ 조정, 반사 테이프를 사용합니다. </li><li> 기계식 액추에이터의 예상 공진 주파수를 바탕으로 d를 청소하기 위해 함수 발생기를 설정백색 잡음 신호와 함께 20 VPP의 작동 전압을 사용하여 esired 주파수 범위 (즉, 본 실험에서는 20-2000 Hz에서). </li><li> 시스템의 공진 주파수를 식별하고 y 축은로 FFT와 속도로 프로그램을 설정하는 Polytec Vibrosoft 프로그램을 특성화 스펙트럼을 봅니다. </li><li> 변위 측정을위한 200 VPP의 작동 전압을 사용하여 지정된 공진 주파수에서 연속적인 정현파를 제공하기 위해 액츄에이터를 설정하고, 젤의 표면에 전달되는 생성된 변위를 적어 둡니다. y 축은 같은 변위와 FFT를 표시 Vibrosoft을 설정합니다. </li></ol> 3. 이미지 수집 <ol><li> 액추에이터 특성화 완료 후 MRI 스캐너의 중앙에있는 샘플 및 액추에이터를 놓습니다. 조직 구조 실험의 경우 RF 신호의 전송 및 수신을위한 작고 더 민감한 RF 코​​일 (이 실험에서 즉 10mm)을 사용합니다. (표시된 절차는 9.4 T를 사용하여수직 구멍 자석은 삼중 축 기울기, 100 G / ㎝)가 장착되어. </li><li> 구조 위치의 식별을위한 정찰 이미지를 취득. </li><li> 인수에 대한 매개 변수를 설정합니다. 체외 화살 검사에서 전형적인 1000 MS, 20-40 MS, 0.5-1.0 mm와 128x128 픽셀의 매트릭스 크기가 12x10 mm 2의 전망 분야의 슬라이스 두께의 반향 시간의 반복 시간을해야합니다. </li><li> elastography 매개 변수의 경우 레이저 도플러 진동계의 특성에 의해 결정 값으로 액추에이터 주파수를 설정합니다. 현재 학문에서는, 바이폴라 쌍은 50 G / cm의 기울기 진폭으로 필요했다. 조정하는 다른 매개 변수는 초기 취득 제로 밀리초로 설정해야 지연을 포함합니다. </li><li> 모드를 파열과 주파수 및주기의 수를 포함하여 elastography 인수​​ 매개 변수에서 일치하도록 함수 발생기의 매개 변수를 조정하기 위해 함수 발생기를 변경합니다. 또한, FUNC을 설정기 발전기는 외부 트리거해야합니다. </li><li> 화살 이미지, 긍정적인 슬라이스 방향이어야하며 스캔을 시작 모션 sensitization을 설정합니다. 취득 후, 이미지를 확인하고 부정적인 슬라이스 방향으로 sensitization을 변경합니다. </li><li> 전단 파 이미지의 생성을 위해 복잡한 분할을 수행합니다 MATLAB 프로그램을 실행합니다. </li><li> 전단 파도와 같은 위상 포장 가능한 유물의 존재에 대한 이미지를 평가합니다. </li><li> 이미지에 어떤 조정이 필요 없다면 0 초에서 특징인 공명 주파수의 전체 기간에 이르기까지 여덟 동일 간격 값으로 매개 변수 배열의 크기를 조정합니다. </li><li> 긍정과 부정적인 슬라이스 방향 모두에서 스캔을 습득. </li><li> 이미지가 획득되면, 이미지의 배열에서 전단 웨이브 데이터 생성을위한 MATLAB 프로그램을 사용합니다. </li></ol> 4. MRE (군용 식품) 실험 영상 처리 <ol><li> 일MRE (군용 식품)의 전자 마지막 단계는 가위 웨이브 이미지에서 전단 강성을 계산하는 것입니다. 입체 데이터 세트 (2 공간적, 1 현세)을 평가할 것입니다 MATLAB 프로그램에 데이터를 배치. </li></ol> 참고 : 평면 전단 파, 변위 및 라플라스의 함수로 복잡한 - 가치 전단 계수의 평가를 허용 모션 decouple의 방정식을 가정함으로써. 알고리즘은 유한 차와 공간적 초 파생 상품을 대략하고 픽셀별로 픽셀 단위로 전단 계수를 계산합니다. 이 복잡​​한 숫자에서 많은 기계적인 매개 변수는 알고리즘도 허용 등의 전단 파 속도, 전파 감쇠, 전단 강성, 전단 탄성, 전단 점도 등의 추론 수있는 관심 영역의 선정있는 대한의 평균 및 표준 편차 각 매개 변수가 계산됩니다. <ol start="2"><li> 이미징 매개 변수는 프로그램의 시작 부분에 지정해야합니다. 또한, 일elastogram의 전자 상한은 샘플에서 명암을 최적화하기 위해 조정할 수 있습니다. </li></ol> 참고 :이 프로그램은 사용자가 복구 신실을 추정하는 데 도움이 중간 결과 (로우 패스 필터 후 파도 방향 필터링, 현세의 FFT, 라인 프로파일 등 뒤에 파도)을 제공합니다. <ol start="3"><li> 일부 매개 변수는 이러한 관심의 특정 지역에서 매개 변수의 표준 편차는 로우 - 패스 필터, 운동의 시간적 주파수, 전파의 전파의 방향 등의 수준으로이 정보를 기반으로 조정할 수 있습니다 또한 계산의 품질 지표. </li></ol> 5. 대표 결과 그림 4는 메모 osteogenic 및 adipogenic 구조 개발 4 주 전역의 기계적 성질의 변화. MRE (군용 식품)는 730-820 Hz에서 실시되었다. 두 씨앗을 품고 스폰지는 약 3 kPa, osteogeni에서 시작하는 동안C 감독의 조직은 22 kPa의 강성 결과, 지방은 1 kPa까지 강성으로 감소 조직을 감독, 반면. 또한, osteogenic 구조가 연구의 처음부터 끝까지 비해 크기가 주목할만한 감소를 보여주었다. elastography 연구에서 파생된 추가적인 특성은 표 1에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 자기 공명 elastography위한 이미지 수집 과정입니다. 이미지 수집하는 동안 펄스 시퀀스 ()는 (b)는 MRI 스캐너의 양극성 그라디언트 펄스와 함수 발생기의 동기화를 제어합니다. 긍정적이고 부정적인 방향으로 토글 양극성 그라디언트 취득 후, (다) 전단 파 이미지는 복잡한 분할을 사용하여 생산하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig2.jpg" alt="그림 2"/> 조직 엔진 MRE (군용 식품) 과정을 그림 2. 흐름 다이어그램ered 구조. 첫째, 세포 ()는 첫번째 재배 및 설계 프로젝트를위한 필수적인 인구의 크기로 확대됩니다. 그렇다면 전지 biomaterial 비계 및 화학 시약쪽으로 씨앗 (B)가 분화 신호를 적용합니다. 공사장 공중 발판은 그의 첫 번째 단계 (C) 구조로 결합 액츄에이터의 공진 주파수의 결정이다 MRE (군용 식품)와 특징. 다음으로, MRI 영상 (D)은 전단 파 이미지 (E)를 생성하기 위해 찾았습니다. 마지막으로, 알고리즘은 elastogram를 얻을 수에 적용됩니다 (F) 매핑 구조의 강성. 동시에, 구조는 차별의 유효성을 검사하기 위해 histological 평가 (G)에 대해 sectioned 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 액츄에이터 특성화 절차. 젤라틴 발판은 0.5 % 아가로 오스 겔에 의해 포함되어 있습니다. 샘플로 전송되는 움직임을 특성화하기 위해 화이트 노이즈가 먼저 시스템에 전송됩니다(1A) 및 결과 동의안은 레이저 도플러 진동계 (1B)를 사용하여 감지됩니다. 공진 주파수가 결정되면 공명의 연속 정현파 신호 (2A) 젤라틴 환경에 전송된 변위를 (2B) 결정하기 위해 전송됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 사주 기간 동안 개발지도를 구축. Adipogenic ()과 osteogenic (O) 구조가 왼쪽에서 해당 크기 및 전단 파 이미지, elastogram, 평균 전단 강성과 오른쪽에 표시됩니다. 막대 차트와 오차 막대의 색 구성표와 elastogram에 해당위한 colormap 관심의 각 구조의 영역 내에서 표준 편차를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618Table1.jpg" alt="표 1"/&gt; 표 1. 성장의 4 주간의 기간 동안 지방과 osteo 구조의 기계적 성질.

<ol><li>Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tissue+engineering+using+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging.</a> J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).</li>
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<li>Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).</li>
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</ol>

저자가 공개하는 흥미 아무런 충돌이 없습니다.

이 절차에서는 조직 공학 구조를위한 MRE (군용 식품)의 과정은 세포 준비 과정에서 elastogram의 세대 증명하고 있습니다. 조직 엔지니어링 파이프라인에 비파괴 기계적 평가 방법을 적용함으로써, 개발의 여러 단계에 걸쳐 엔지니어링 구조의 변화를 평가하는 지금은 가능합니다. 조작 모니터링 조직 등 확산, 자화 전송, 화학 시프트 분석 1로 구성하고 위해 또한, MRE (군용 식품)는 다른 MR 방식을 보완합니다. MRE (군용 식품) 실험을 수행할 때 몇 가지 제한 사항이 언급되어야한다. 시험 관내 표본에의 평가는 시간에 민감한 연구입니다. 따라서, 그것은 조직 구조에 대한 어떠한 잠재적인 손상이 최소화되도록 연구가 더 이상 하나가 아닌 시간을 지속해야하는 것이 좋습니다. 또한 강성지도의 충실 복구는 6 너무 작거나 뻣뻣한 하나되는 구조로 인해 손상된 수 있습니다. 에파장은 주파수에 반비례로이 문제에 대한 전자 가능...

<table border="1"><tbody><tr><td> 자재 명칭 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> MSCGM - 총알 키트 </td><td> 시약 </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td> 4에서 저장 ° C </td></tr><tr><td> 1X의 DPBS </td><td> 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 21600-010 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시약 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td> -20 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> Dexamethasone </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D2915 </td><td></td></tr><tr><td> 3 - 이소 부틸-1-methylxanthine </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I5879 </td><td> -20 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> 인슐린 - 소의 췌장 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I6634 </td><td> -20 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> 인도 메 타신 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I7378 </td><td></td></tr><tr><td> Β-Glycerophosphate </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G9891 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - 인산 L-아스코르비 산 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A8960 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> 발판 </td><td> Pharmacia &amp; Upjohn 주식 회사 </td><td> 09-0315-08 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 mesenchymal 줄기 세포 </td><td> 세포주 </td><td> Lonza </td><td> PT-2501 </td><td></td></tr><tr><td> 9.4T MR 스캐너 </td><td> 장비 </td><td> 애질런트 </td><td></td><td> 400MHz WB </td></tr><tr><td> 10mm Litz 코일 </td><td> 장비 </td><td> 늙어 빠진 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 레이저 도플러 진동계 </td><td> 장비 </td><td> Polytec </td><td> PDV-100 </td><td></td></tr><tr><td> Vibrosoft (20) </td><td> 소프트웨어 </td><td> Polytec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 함수 발생기 </td><td> 장비 </td><td> 애질런트 </td><td> 아프가 니스탄 3022B </td><td></td></tr><tr><td> 증폭기 </td><td> 장비 </td><td> 압전 INC </td><td> EPA - 104-115 </td><td></td></tr><tr><td> 압전 굽힘 모터 </td><td> 장비 </td><td> 압전 INC. </td><td> T234-A4Cl-203X </td><td></td></tr><tr><td> 컴퓨터 리눅스 </td><td> 장비 </td><td> 프로세서 : 인텔 코어 2 듀오 E8400 메모리 : 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 컴퓨터 윈도우 </td><td> 장비 </td><td> 프로세서 : 인텔 코어 2 듀오 E8400 메모리 : 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MATLAB </td><td> 소프트웨어 </td><td> Mathworks, INC </td><td></td><td> 2009b </td></tr></tbody></table>

조직 평가에 대한 자기 공명 elastography 방법론은 구조 성장하는 기술

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

전통적인 기계적인 테스트는 종종 시료의 파괴​​에 결과 및 연구를 구축 설계 장기적인 조직의 경우에는 파괴적인 평가의 사용은 허용되지 않습니다. 제안된 대안은 자기 공명 elastography라는 이미징 프로세스의 사용이다. Elastography는 조직의 구조와 기능을 식별하는 데 필수 마커가 지방 기계적 성질 값 (즉, 복합 전단 계수)를 측정하여 공학 결과를 결정하기위한 비파괴 방법입니다. 평가를위한 비침 투 수단으로서, 그러한 자기 공명 영상 (MRI)와 같은 이미징 modalities와 엔지니어링 구조의 모니터링은 지난 10 년 1 증가하고 관심을 보여줬습니다. 예를 들어, 보급 및 relaxometry의 자기 공명 (MR) 기술은 엔지니어링 조직 개발이 중 화학 및 물리적 특성의 변화를 특징 짓는 수 있었다. 에서 제안된 방법다음과 같은 프로토콜이 작은 부드러운 조직 3의 기계적 성질을 측정하는 비침 투 MR 기반 기술로 미세한 자기 공명 elastography (μMRE)를 사용합니다. MRE (군용 식품)은 관심의 조직과 음파 기계 액츄에이터를 커플링 및 MR 스캐너 4 전단 웨이브 전파를 기록함으로써 이루어진다. 최근 μMRE은 전통적으로 파괴적인 기계 매크로 기법 5를 사용하여 측정하는 필수적인 성장 정보를 얻기 위해 조직 공학에 적용되었습니다. 다음 절차에서는 elastography는 기계식 액추에이터와 결합 수정 돼야 해 한이 스핀 - 에코 시퀀스와 엔지니어링 구조의 영상을 통해 이루어진다. 그림 1에 나타난 바와 같이, 수정된 순서는 외부 전단 파도의 전송과 이미지 수집을 동기화, 이후, 움직임은 바이폴라 쌍을 진동을 통해 sensitized입니다. 긍정적이고 부정적인 움직임 sensitiza와 이미지의 수집을 따라데이터의 기, 복잡한 부서는 전단 파 이미지를 생성합니다. 그런 다음 이미지가 전단 강성지도 6 생성 반전 알고리즘을 사용하여 평가된다. 각 voxel의 결과로 성능은 강력하게 데이터를 동적 기계적 분석 7을 사용 회수와 함께 (R 2&gt; 0.9914) 상관 관계를 보여왔다. 본 연구에서는 elastography는 그림 2에 표시된 adipogenic과 osteogenic 구조로 인간 mesenchymal 줄기 세포 (H MSC) 차별 모니터링을위한 조직 개발 과정에 통합되어 있습니다.

절차는 지방과 미세한 자기 공명 elastography (μMRE)를 사용하여 기계적 성질의 비침 투 현지 심사를 통해 osteogenic 조직 공학 구조의 공학 결과를 모니터링하기위한 자기 공명 elastography의 방법론을 보여줍니다.

조직 평가에 대한 자기 공명 Elastography 방법론은 구조 성장하는 기술

전통적인 기계적 시험은 흔히 시료의 파괴를 초래하며, 특히 장기적인 조직 공학 구조체 연구의 경우, ...의 사용은

공학적으로 제작된 조직 구조물을 조사할 때, 흔히 시료의 파괴를 초래하는 전통적인 기계적 시험 방식은 적절하지 않습니다. 본 방법에서는 작은 연조직의 기계적 특성을 측정하기 위한 비침습적 기술로 미세 자기공명 탄성도 촬영 또는 micro MRE를 사용합니다. 먼저, 조직을 생성하기 위해 생체 재료 지지체 위에 세포를 배치합니다.조직을 aros gel에 현탁시키고, 액추에이터의 팁을 젤 내부에 배치합니다. 그 다음 액추에이터의 움직임을 특성화하기 위해 샘플로 전달하고, 레이저 도플러 속도계(Doppler velocimeter)를 사용하여 이를 검출합니다.시료와 액추에이터를 자석 및 자기공명 장치로 옮깁니다. 엘라스트로그래피 영상을 획득합니다. 결과 영상을 분석하여 골분화 및 지방분화 구조물 모두에서 전단 강성의 변화를 확인합니다.우리는 먼저 이 기술에 대한 아이디어를 얻었으며, 질병 진단을 위한 자기공명 영상 기술을 관찰함으로써 이를 조직 공학으로 확장할 수 있음을 깨달았습니다. 기계적 시험과 같은 기존의 다른 기술들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 MRI의 비침습적 기술을 조직의 주요 기계적 특성에 적용할 수 있다는 점입니다. 기계적 특성에 대한 지식은 골 및 연골 공학에서 의도한 용도에 적합한지 확인할 수 있게 해주므로, 이 기술의 응용 범위는 조직 공학까지 확장됩니다.이러한 방법들은 조직 공학에 대한 귀중한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 예를 들어 간 섬유화, 외상성 뇌 손상 또는 뇌암과 같은 다양한 장기의 질병을 진단하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이 방법에는 학습하기 어려운 단계들이 포함되어 있으며, 조직 공학 및 magnitude rhythm imaging에 대한 사전 지식이 필요하기 때문에 이를 시각적으로 시연하는 것이 매우 중요합니다. 조직 구조물 준비 과정은 세포 집단의 확장, 생체 재료 지지체로의 세포 파종, 그리고 화학적 신호 분자를 이용한 분화라는 세 가지 주요 단계로 구성됩니다.세포주의 배양 및 증식 후, 골 형성을 위해 인간 중간엽 줄기세포 또는 HMC를 1×10⁶ cells/mL의 밀도로 젤라틴 스펀지에 파종합니다. 약 3일 후, 세포가 스캐폴드 상에서 합쳐져(confluent) 분화를 유도할 수 있는 상태가 되어야 합니다. 배지를 제거하고 지방 분화 유도 배지로 교체합니다.그 후 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 3일 동안 배양합니다. 배지를 10 µg/mL의 human recombinant insulin이 포함된 증식 배지로 구성된 유지 배지로 교체합니다. 24시간 동안 배양한 후, 유지 배지를 유도 배지로 교체합니다.이 사이클을 세 번 반복합니다. 그 후 골분화를 유도하기 위해 4주 동안 이틀마다 유지 배지를 교체합니다. 연구 기간 동안 이틀마다 신선한 골분화 배지로 교체합니다.본 연구의 기간은 4주이며, 매주 MRE를 수행합니다. 자기공명 탄성도 측정법은 국소적인 기계적 특성 값을 평가하기 위해 기계적 전단파의 전파에 의존합니다. 따라서 피조 전기 액추에이터를 사용하여 관심 조직 내에서 이러한 기계적 진동을 생성하고 특성화해야 합니다. 시료를 준비하려면, 고체 베이스와 0.5% AGROS 겔 층이 포함된 10 millimeter 직경의 시험관으로 조직 배양물을 옮기십시오.그 다음, 이를 둘러싸기 위해 따뜻한 0.5% agarose gel을 추가합니다. agarose gel이 5분 동안 굳도록 둡니다.실온에서 피에조 전기 굽힘 모터(piso electric bending motor)의 팁을 겔 표면에 삽입하십시오. 다음으로, 샘플과 액추에이터가 들어 있는 튜브를 견고한 지지대에 고정하십시오. 레이저 도플러 압력계(laser doppler barometer)의 빔을 기계적 액추에이터의 팁을 향하도록 조절하십시오.기압계에 표시되는 반사 신호 강도를 최적화하도록 시스템의 위치를 조정하십시오. 반사도를 최대화하기 위해, 필요한 경우 반사 테이프를 사용하여 액추에이터가 약 250 microns의 상당한 진폭을 가진 무해한 전단파를 생성하도록 설정하십시오. 함수 발생기를 설정하여 20 volts peak to peak의 동작 전압과 화이트 노이즈 신호를 사용하여 원하는 주파수 범위를 스윕하십시오.본 실험에서 요구되는 주파수 범위는 20~2000 hertz입니다. Polytech Rsof 프로그램에서 분석된 스펙트럼을 확인하려면 속도(velocity) 및 FFT 디스플레이를 선택하십시오. 신호 캡처를 시작하고 스펙트럼의 피크를 기반으로 시스템의 공진 주파수를 확인하십시오.다음으로, 액추에이터의 굴곡을 측정하기 위해 액추에이터가 특성화된 공진 주파수에서 연속 정현파를 전달하도록 설정합니다. 피크-투-피크(peak-to-peak) 동작 전압을 200 volts로 설정하고, 액추에이터가 젤 표면으로 전달하는 변위를 측정하며, 변위를 Y축으로 하여 FFT를 표시하도록 설정합니다. 액추에이터의 특성화가 완료되면, 샘플과 액추에이터가 들어 있는 시험관을 10 millimeter RF 코일의 슬롯에 넣고, 샘플과 액추에이터를 MRI 스캐너의 중심에 배치합니다.구성체의 위치를 확인하기 위해 스카우트 영상을 획득합니다. 조직 구성체의 위치가 확인되면 영상 획득을 위한 파라미터를 설정합니다. 일반적인 in vitro 시상면 스캔의 반복 시간은 1000 milliseconds입니다.에코 시간은 20 내지 40 milliseconds, 슬라이스 두께는 0.5 내지 1 millimeter, 시야(field of view)는 12 by 10 millimeter squared이며, 매트릭스 크기는 128 by 128 pixels로 설정합니다. 엘라스토그래피 파라미터의 경우, 액추에이터 주파수를 레이저 도플러 진동계(laser doppler vibrometer) 특성 분석으로 결정된 값으로 설정하십시오. 본 샘플의 경우, 그래디언트 진폭 50 gauss per centimeter와 MRE 지연 시간을 0으로 설정한 1 bp가 필요합니다.함수 발생기를 버스트 모드로 변경하고, 주파수와 사이클 수를 포함하여 함수 발생기의 파라미터를 엘라스토그래피 획득 파라미터와 일치하도록 조정합니다. 또한, 함수 발생기를 외부 트리거 방식으로 설정하십시오. 시상면 영상을 얻으려면 모션 감도를 양의 슬라이스 방향으로 설정하고 획득 후 스캔을 시작합니다.이미지를 확인하여 조직 구조체의 신호 품질을 평가합니다. 이미지가 너무 어둡게 보이면 MR 파라미터를 조정한 후 다시 스캔을 수행합니다. 다음으로, 감도를 음수 슬라이스 방향으로 변경합니다.MRI 스캐너의 파일을 MATLAB이 설치된 다른 컴퓨터로 전송하고, 전단파 전파를 묘사하는 영상을 생성하기 위해 복소 나눗셈을 수행하는 MATLAB 프로그램을 실행합니다. 영상에서 전단파의 존재 여부와 위상 래핑(phase wrapping)과 같은 잠재적 아티팩트를 평가하며, 파동의 품질과 진폭을 더 정확하게 평가하기 위해 라인 프로파일을 플롯할 수 있습니다. 래핑이 발생하는 경우, 그래디언트 진폭을 줄이고 다시 스캔을 수행하십시오.이미지에 별도의 조정이 필요 없는 경우, 파라미터 배열 크기를 0초부터 특성 분석된 공진 주파수의 전체 주기까지 동일한 간격의 8개 값으로 조정하십시오. 이미지가 획득되면 양(+) 및 음(-)의 슬라이스 방향 모두에서 스캔을 수행하십시오.전단파 데이터와 샘플 내에서 전파되는 파동의 해당 영상을 생성하도록 설계된 MATLAB 프로그램을 사용하십시오. 이 파일은 기계적 특성을 추정하는 데 필요합니다. MRE의 마지막 단계는 전단파 영상을 통해 전단 강성을 계산하는 것입니다.먼저 데이터를 3차원 데이터셋을 평가할 MATLAB 프로그램에 입력하고, 시야(field of view), 경사도(gradient), 진폭(amplitude), 바이폴라 쌍(bipolar pairs)의 수를 포함한 영상 파라미터를 지정한 후 코드를 실행합니다. 이 알고리즘을 통해 관심 영역(regions of interest)을 선택하면 각 파라미터의 평균과 표준 편차가 계산됩니다. 조직 구조물의 윤곽선을 그려 관심 영역을 선택하십시오.선택한 관심 영역 내의 강성, 저장 탄성률 및 손실 탄성률의 평균과 표준 편차가 표시됩니다. 또한, 이 프로그램은 필터링 후의 파형, 방향성 필터링 후의 파형, 그리고 복원도의 신뢰성을 추정하는 데 도움이 되는 라인 프로파일을 포함한 중간 결과물을 제공합니다. 정확한 추정을 위해서는 필터링된 파형이 매끄러워야 합니다.특정 관심 영역 내 파라미터의 표준 편차는 필요시 계산 품질의 지표가 되며, 공학적 구조물이 발달함에 따라 기계적 특성의 변화를 관찰하기 위해 정확한 기계적 특성 값을 얻을 수 있도록 다른 파라미터들을 적절히 조정하십시오. MRE 테스트는 4주 동안 수행되었습니다. 이 구조물 발달 맵은 A로 표시된 지방분화 및 O로 표시된 골분화 구조물을 나타내며, 이에 해당하는 강도 이미지, 전단파 이미지, ELA 및 평균 전단 강성이 표시되어 있습니다.ELA의 컬러 맵은 바의 색상 체계와 일치합니다. 차트와 오차 막대는 각 구조체 관심 영역 내의 표준 편차를 나타냅니다. 시간이 지남에 따라 지방 분화 구조체의 강성이 낮아졌으며, 이는 지방 조직과 유사한 특성을 나타냅니다.마찬가지로, 골분화 유도 구조체는 4주의 기간 동안 더 단단해졌으며, 이는 뼈와 유사한 분화가 일어났음을 나타냅니다. 숙련된 경우, 이 기술을 적절히 수행하면 약 2시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 액추에이터의 특성을 완전히 규명하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에 생화학적 분석 및 조직학 등의 방법을 사용하여 무기질 침착 확인과 같은 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.인체 세포 물질 및 MRI를 사용할 때는 매우 위험할 수 있으므로, 적절한 BL2 및 MRI 안전 수칙을 숙지하는 것이 중요하며, 이러한 절차를 수행하는 동안 주의를 기울여야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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