입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

이 실험 절차의 전반적인 목적은 3차원 암 모델에서 세포외 기질의 기계적 특성에 나타나는 종단적 변화를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 암세포를 수확하고 적절한 방법을 통해 종양 스페로이드가 원하는 크기에 도달할 때까지 배양합니다. 두 번째 단계는 종양 스페로이드를 콜라겐 또는 다른 적절한 세포외 기질에 임베딩하는 것입니다.

다음으로, 샘플 지점의 그리드를 구성하고 각 지점에서 비디오를 촬영합니다. 마지막 단계는 비디오 데이터를 분석하여 각 공간 지점에서의 실제 논리적 특성을 계산하고 코레지스트레이션(coregister)하는 것입니다. 궁극적으로, 이 프로토콜은 추적 프로브의 궤적 분석을 통해 세포외 기질 역학의 공간적 변화를 비파괴적인 방식으로 종단적으로 정량화합니다.

본 연구의 개념은 세포 외 기질 방사선학의 영상 기반 측정법과 세포 외 기질 상호작용을 복원하는 인 비트로(in vitro) 3D 종양 모델을 결합함으로써, 종양 성장, 침습 과정 및 치료 반응에 수반되는 기계적 미세환경의 시간 의존적 변화에 대한 정량적 통찰을 제공하는 것입니다. 이 비디오에서 보여주는 방법은 aros 오버레이 방식을 채택하여 기성 췌장암 세포주 pan one으로부터 비부착성 3D OID를 생성합니다. 우선, 세포 배양 등급의 물 10 milliliters와 aros 0.1 gram을 섞어 1% aros 용액을 조제합니다.

Ali 전 단계에서 aros 용액을 70 °C 이상으로 가열하십시오. 96-웰 플레이트의 각 웰에 해당 용액 40 µL를 분주하고, 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오. trypsin을 사용하여 암세포를 수확하고 단일 세포 현탁액을 준비한 후, 세포 현탁액을 mL당 1000 cells가 되도록 희석하십시오. 이 희석액 100 µL를 경화된 aros 베드가 포함된 웰에 첨가하십시오.

배양 후, 시료를 37 °C 및 5% CO2로 설정된 인큐베이터 내의 쉐이커에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. 쉐이커에서 시료를 꺼내고 세포 배양 배지 100 µL를 추가한 후, 원하는 직경에 도달할 때까지 생성된 스테로이드를 배양합니다. 예를 들어, 9일 후의 한 스테로이드는 직경이 약 450 µm가 됩니다.

먼저, 라미나 플로우 후드 내에 2 mL 바이알 두 개를 준비하여 워크스테이션을 구성합니다. 바이알 1에는 종양 스테로이드를 넣고, 바이알 2는 무세포 대조군으로 사용합니다. 스톡 프로브 2분량에 멸균수 25분량을 추가하여 카복실산 변형 1 µm 직경 형광 트레이서 프로브의 희석 혼합물을 준비합니다.

3.1 mg/mL 농도의 소 콜라겐(bovine collagen) 한 병을 냉장고에서 꺼내 얼음 위에 둡니다. 125 µL의 콜라겐을 바이알 1에 분주한 후, 희석된 트레이서 프로브 용액 50 µL를 추가하고 짧게 볼텍싱하여 프로브를 분산시킵니다. 그 다음, 페놀 레드(phenol red)가 포함된 적절한 세포 배양 배지 235 µL를 추가하여 총 부피를 410 µL로 맞추고, 짧게 볼텍싱한 뒤 205 µL를 취해 바이알 2로 옮깁니다. 마지막으로, 해당 바이알에 1 M 수산화나트륨(sodium hydroxide) 약 2 µL를 추가합니다.

용액을 중성 pH로 되돌린 후, 가볍게 볼텍싱하여 혼합합니다. 그런 다음 혼합물이 경화되기 시작하지 않도록 즉시 아이스 랙으로 옮깁니다. 종양 스테로이드가 포함된 웰에서 배지 40 µL를 조심스럽게 제거합니다.

다음 단계를 수행하는 동안 이 40 µL를 보관하십시오. 이전 단계에서 스테로이드가 제거되었는지 웰을 확인하십시오. 제거되지 않았다면, 40 µL를 다시 웰에 넣고 이전 단계를 반복하십시오.

그렇다면 스테로이드가 포함된 40 µL를 바이알에 추가하십시오. 바이알 1을 가볍게 섞은 후, 혼합물을 60 µL씩 나누어 96웰 플레이트의 서로 다른 세 개 웰에 옮기십시오. 혼합물을 추가한 후 각 웰을 현미경으로 관찰하여 어느 웰에 스테로이드가 포함되어 있는지 확인하십시오. 그 다음, 1 M 수산화나트륨 약 2 µL와 세포 배양 배지 40 µL를 바이알 2에 추가하고 분주 전 보텍싱하십시오.

이 혼합액 60 µL를 96-well 플레이트의 빈 well에 분주하고 이를 무세포 대조군(cell-free control)으로 표시합니다. 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣고 최소 1시간 동안 경화시켜 샘플 포인트 그리드를 구축합니다. 먼저, 샘플 플레이트를 인큐베이터에서 현미경 스테이지로 옮깁니다.

가열 스테이지를 사용할 수 없는 경우, 샘플이 상온으로 평형을 이룰 때까지 10분 동안 둡니다. 저배율 대물렌즈로 샘플을 관찰하여 샘플이 손상되지 않았으며 이미징 준비가 되었는지 확인합니다. 웰 내에서 종양의 위치를 결정하고, 이후의 공간적 공동 등록(spatial co-registration)을 위해 투과광 이미지로 이를 기록합니다.

일반적으로 S 구형체 주변에 동심원 형태로 분포된 웰당 20개의 샘플 지점을 설정하면 충분히 세밀한 결과를 얻을 수 있습니다. 스테이지를 원하는 각 위치로 이동시키고 현미경 인터페이싱 소프트웨어를 사용하여 XNY 좌표를 기록하십시오. 현미경의 대물렌즈를 고배율로 전환하고 추적 프로브의 들뜸 파장에 적합한 필터 큐브를 선택하십시오.

생성된 지점 목록을 사용하여 그리드의 첫 번째 지점으로 이동합니다. 위로 이동하기 전에 초점을 조정하여 웰의 바닥을 찾습니다. 초점이 맞는 여러 개의 트레이서 프로브가 포함된 시야를 찾으십시오.

강도 히스토그램을 관찰하고, 이미지가 포화되지 않도록 주의하면서 가능한 최대의 동적 범위(dynamic range)를 확보할 수 있도록 노출 강도와 시간을 조정하십시오. 프레임당 20에서 30 밀리초의 프레임 속도로 비디오 시퀀스를 획득하고 적절한 명명 규칙에 따라 저장하십시오. 녹화하는 동안에는 현미경이나 테이블을 건드리지 마십시오.

그리드의 각 샘플 지점에 대해 기록을 반복합니다. 그런 다음, 실험의 각 웰에 대한 그리드를 구성하기 위해 이 과정을 반복하고, 종단적 모니터링 기간의 각 시점에 대해 전체 과정을 다시 반복하십시오.

데이터 분석을 시작하려면 모든 비디오 데이터를 분석 폴더로 복사하십시오. 이미지 데이터를 MATLAB 또는 다른 분석 소프트웨어로 가져오십시오.

비디오의 여러 프레임을 분석하여 프로브 중심 위치를 식별하기 위한 선택 및 거부 매개변수를 적절하게 결정함으로써 소프트웨어를 보정합니다. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 모든 비디오 프레임에 대해 각 프로브 위치를 자동으로 결정하고, 이 위치들을 궤적으로 연결합니다. 특정 대물렌즈 또는 픽셀 비닝(pixel binning)에 적합한 공간 보정 계수를 반드시 적용하여, 궤적 데이터를 이용해 지연 시간(lag time)의 함수로서 평균 제곱 변위(mean square displacement) 또는 MSD를 계산합니다.

특정 샘플에 대한 일반화된 스토크스-아인슈타인 관계식의 적용 한계를 고려하여 일반화된 스토크스-아인슈타인 관계식을 이용해 G Star를 계산하십시오. 실험의 각 시야(field of view)에 대해 분석 단계를 반복하십시오. 사용된 현미경 제조사에 따라, 특정 관심 주파수에서의 점탄성 계수 I과 위치 데이터를 공동 등록(coregister)하십시오.

이 단계는 현미경 메타데이터를 읽는 사용자 정의 루틴을 통해 용이하게 수행하거나, 위치 데이터를 수동으로 표로 작성하여 진행할 수 있습니다. 3D 종양 결절이 포함된 대표 웰 내의 여러 공간적 위치에서 비디오 시퀀스를 획득하고 이를 연결함으로써, 팬 주변부의 세포 집단을 종단적으로 모니터링할 때 시료의 공간적 미세 방사선 지도(spatial micro radiology map)를 제공합니다. 본 예시에서 사용된 일부 스테로이드는 며칠 내에 주변의 콜라겐 섬유를 자발적으로 분해하고 세포외 기질로 침투합니다.

이 예시에서, 마이크로올로지(micro ology)의 공동 등록(co-registration)은 스테로이드의 왼쪽에서는 발생하지만 오른쪽에서는 발생하지 않는 명백한 매트릭스 내 침습에 대한 정량적 판독값을 제공합니다. 이러한 서로 다른 공간적 영역을 종단적으로 모니터링하면, 침습과 동시에 복소 점탄성 전단 탄성률의 실수 성분이 약 4자릿수(four orders of magnitude) 정도 감소하는 것을 알 수 있습니다. 4일 차에 영역 1과 영역 2 내 물질의 레올로지(rheological) 특성을 대조한 전체 주파수 의존적 데이터가 표시되어 있습니다.

본 실험 절차를 수행할 때, 프로브 궤적 분석 과정에서 부적절한 결론으로 이어질 수 있는 일반적인 오류를 피하기 위해 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 샘플 드리프트 및 이질성 해석과 같은 고려 사항을 다룬 본 문서의 PTM 관련 인용 문헌을 참고하시기 바랍니다. 본 절차는 추가적인 종단적 또는 최종 형광 이미징과 결합하여, 기계적 리모델링이 주요 신호 전달 이벤트나 중재에 대한 세포 독성 반응과 어떻게 상관관계가 있는지와 같은 다른 질문들에 대한 답을 찾는 데 활용될 수 있습니다.