입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

이 절차의 전반적인 목표는 3차원 암 모델에서 세포외 기질의 기계적 특성의 종적 변화를 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 암세포를 채취하고 원하는 크기에 도달할 때까지 적절한 방법으로 종양 스테로이드를 성장시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 종양 스테로이드를 콜라겐 또는 기타 적절한 세포외 기질에 삽입하는 것입니다.

다음으로, 샘플 포인트의 그리드를 구성하고 각 포인트에서 비디오를 촬영합니다. 마지막 단계는 비디오 데이터를 분석하고 각 공간 지점에서 실제 논리 속성을 계산 및 공동 정합하는 것입니다. 궁극적으로 이 프로토콜은 추적 프로브 궤적 분석을 사용하여 비파괴 방식으로 세포 외 기질 역학의 공간적 변화를 종단적으로 정량화합니다.

이 아이디어는 세포외 기질 방사선학의 이미징 기반 측정과 체외 3D 종양 모델을 결합하여 세포 외 기질 상호 작용을 복원함으로써 이 접근 방식이 종양 성장 침입 과정에 수반되는 기계적 미시 환경의 시간 의존적 변화 및 치료에 대한 반응에 대한 정량적 통찰력을 제공할 수 있다는 것입니다. 이 비디오에 표시된 방법은 aros 오버레이 접근 방식을 채택하여 확립된 췌장암 세포주 pan one에서 비부착성 3D OID를 생성합니다. 시작하려면 10ml의 세포 배양 등급 물과 0.1g의 aros를 혼합하여 1% aros 용액을 얻습니다.

알리 전에 aros 용액을 섭씨 70도 이상으로 가열하십시오. 96웰 플레이트의 각 웰에 용액 40마이크로리터를 인용하여 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하고, 트립신을 통해 암세포를 수확하고, 세포 현탁액을 밀리리터당 1000개의 세포로 희석하기 전에 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 경화된 aros bed가 들어 있는 well에 이 희석액 100마이크로리터를 추가합니다.

샘플을 쉐이커에 담아 섭씨 37도로 설정하고 배양 후 5%CO2로 설정된 인큐베이터에서 하룻밤 동안 놓습니다. 셰이커에서 샘플을 제거하고 100마이크로리터의 세포 배양 배지를 추가하고 원하는 직경에 도달할 때까지 생성된 스테로이드를 배양합니다. 예를 들어, 9 일 후, 팬, 하나의 스테로이드는 직경이 약 450 미크론이됩니다.

시작하려면 2개의 2밀리리터 바이알이 있는 층류 후드 내부에 워크스테이션을 준비합니다. 첫 번째 바이알에는 스테로이드 종양이 함유되어 있고 두 번째 바이알에는 무세포 대조군이 함유되어 있습니다. 25개의 멸균수에 2개의 스톡 프로브를 추가하여 카르복실레이트 변형 1미크론 직경의 형광 추적 프로브의 희석된 혼합물을 준비합니다.

냉장고에서 밀리리터당 3.1밀리그램, 소 콜라겐 한 병을 꺼내 얼음 분취량 125마이크로리터의 콜라겐에 놓고 50마이크로리터의 희석된 추적 프로브 용액을 바이알 1 와류에 잠시 넣어 프로브를 분배합니다. 그런 다음 총 부피 410마이크로리터에 대해 페놀 레드를 포함하는 적절한 세포 배양 배지 235마이크로리터를 추가하고 205마이크로리터를 제거하고 바이알 2에 넣기 전에 잠시 와류를 추가합니다. 다음으로, 약 2마이크로리터의 1몰 수산화나트륨을 바이알에 첨가합니다.

하나는 용액을 중성 pH 와류로 다시 가져와 잠시 혼합하는 것입니다. 그런 다음 혼합물이 경화되지 않도록 즉시 얼음 선반으로 돌아가십시오. 종양 스테로이드가 들어 있는 웰에서 40마이크로리터의 배지를 부드럽게 제거합니다.

다음 단계를 수행하는 동안 이 40마이크로리터를 유지하십시오. 이전 단계에서 스테로이드가 제거되었는지 확인하기 위해 우물을 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 40마이크로리터를 우물에 다시 넣고 이전 단계를 반복합니다.

그렇다면 스테로이드가 함유 된 40 마이크로 리터를 바이알에 첨가하십시오. 하나는 부드럽게 약동, 60 마이크로 리터 부분의 혼합물을 96 웰 플레이트의 3 개의 별도 웰로 옮기기 전에 1 바이알을 1 개 부드럽게 약동하고, 어느 웰이 스테로이드를 포함하는지 결정하기 위해 혼합물을 첨가 한 후 현미경으로 각 웰을 검사합니다. 그런 다음 약 2 마이크로 리터의 1 몰 수산화 나트륨과 40 마이크로 리터의 세포 배양 배지를 바이알 2에 넣고 알리 앞에 와류를 일으

이 혼합물 60마이크로리터를 96웰 플레이트의 빈 웰에 인용하고 무세포 대조군으로 라벨링합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣어 최소 1시간 동안 경화시켜 샘플 포인트 그리드를 구성합니다. 먼저, 인큐베이터에서 현미경 스테이지로 샘플 플레이트를 옮깁니다.

10분 동안 허용amp가열된 경우 s가 실온과 평형을 이룹니다.tage를 사용할 수 없습니다. 저전력 대물 렌즈로 샘플을 관찰하여 손상되지 않고 이미징 준비가 되었는지 확인하십시오. 웰 내 종양 위치를 결정하고 후속 공간 공동 정합을 위해 투과광 이미지로 이를 문서화합니다.

일반적으로 S 스페로이드 주위의 동심원 고리에 분포된 각 웰의 20개 샘플 포인트는 적절하게 상세한 결과를 생성합니다. 스테이지를 원하는 각 위치로 이동하고 현미경 인터페이스 소프트웨어를 사용하여 XNY 좌표를 기록합니다. 현미경을 고출력 대물 렌즈로 전환하고 추적 프로브의 x 인용 파장에 적합한 필터 큐브를 선택합니다.

생성된 점 목록을 사용하여 그리드의 첫 번째 점으로 이동합니다. 위로 이동하기 전에 우물의 바닥을 찾도록 초점을 조정하십시오. 초점 추적기 프로브에 여러 개를 포함하는 시야를 찾습니다.

강도 히스토그램을 관찰하고 노출 강도와 시간을 조정하여 이미지가 포화되지 않도록 하면서 가능한 최대 동적 범위를 제공합니다. 프레임당 20-30밀리초의 프레임 속도로 비디오 시퀀스를 얻고 적절한 명명 규칙을 사용하여 저장합니다. 녹음하는 동안 현미경이나 테이블을 만지지 마십시오.

그리드의 각 샘플 점에 대해 기록을 반복합니다. 그런 다음 프로세스를 반복하여 실험의 각 우물에 대한 그리드를 구성하고 매번 전체 프로세스를 반복합니다. 종단 모니터링 기간에 대한 포인트를 지정합니다.

데이터 분석을 시작합니다. 모든 비디오 데이터를 분석 폴더에 복사합니다. 이미지 데이터를 MATLAB 또는 다른 분석 소프트웨어로 가져올 수 있습니다.

프로브의 중심 위치를 식별하기 위한 선택 및 거부 파라미터를 적절하게 결정하기 위해 비디오의 여러 프레임을 분석하여 소프트웨어를 보정합니다. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 모든 비디오 프레임에 대한 각 프로브 위치를 자동으로 결정한 다음 이러한 위치를 궤적에 연결합니다. 궤적 데이터를 사용하여 평균 제곱 변위 또는 MSD를 지연 시간의 함수로 계산하고, 특정 대물 렌즈 또는 픽셀 베닝에 대해 적절한 공간 보정 계수를 적용해야 합니다.

특정 샘플에 대한 일반화된 스토크스 아인슈타인 관계의 적용 한계를 고려하여 일반화된 스톡스 아인슈타인 관계를 사용하여 G Star를 계산합니다. 실험의 각 시야에 대해 분석 단계를 반복합니다. 사용된 현미경 제조업체에 따라 특정 관심 주파수에서 점탄성 mod I과 위치 데이터를 공동 등록합니다.

이 단계는 현미경 메타데이터를 읽거나 위치 데이터를 수동으로 표로 만들 수 있는 맞춤형 루틴을 통해 촉진할 수 있습니다. 비디오 염기서열은 3D 종양 결절을 포함하는 대표 웰 내의 여러 공간적 위치에서 획득되고 팬 주변에 있는 세포 집단을 종적으로 모니터링할 때 샘플의 공간 마이크로 방사선 지도를 제공하기 위해 연결됩니다. 이 예시에 사용된 스테로이드 중 하나는 주변 콜라겐 섬유를 자발적으로 분해하고 며칠 내에 세포외 기질로 침입합니다.

이 예에서 micro ology의 공동 등록은 스테로이드의 오른쪽이 아닌 왼쪽에서 발생하는 매트릭스로의 명백한 침입에 대한 정량적 판독을 제공합니다. 이러한 이질적인 공간 영역에 대한 종단 모니터링은 침입과 동시에 약 4 자릿수의 복잡한 점탄성 전단 계수의 실제 성분이 감소하는 것을 보여줍니다. 전체 빈도 의존적 데이터는 넷째 날에 지역 1과 지역 2에 있는 자료의 신학적 속성을 대조하여 보여진다.

이 절차를 시도하는 동안 부적절한 결론으로 이어지는 프로브 궤적을 분석하는 동안 일반적인 함정을 피하기 위해 주의를 기울여야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 독자들이 여기에 인용된 PTM 문헌을 참조하여 표본 드리프트 및 이질성 해석과 같은 고려 사항을 다룰 것을 권장합니다. 이 절차는 추가 종방향 또는 말단 형광 이미징과 결합하여 기계적 리모델링이 주요 신호 전달 사건 또는 중재에 대한 세포독성 반응과 어떤 상관관계가 있는지와 같은 다른 질문에 답할 수 있습니다.