하여 세균없는 마우스 프로 그레시브 콜로니 동안 간장 신진 대사 변경 사항 평가 ¹ H NMR 분광학

이 절차의 목적은 진행성 집락화가 숙주 간 대사에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 무균 마우스에 점진적으로 군집화함으로써 달성됩니다. 집락화 과정은 NMR 분광법을 통해 미생물 공동 대사 산물의 소변 배설물을 평가하여 모니터링됩니다.

집락화 과정을 모니터링한 후, 마우스에서 간 생검을 채취하여 대사 프로파일링을 준비합니다. 그런 다음 비파괴 고해상도 마법각 방사 NMR 분광법을 사용하여 온전한 생검에서 간 대사 프로파일을 얻을 수 있습니다. 궁극적으로 이러한 양성자 NMR 분광법의 사용은 에너지 및 산화 스트레스 경로와 같은 대사 경로에 관여하는 다양한 대사 산물을 보여줍니다.

따라서 이 실험은 집락화 중 간 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 신장과 같은 시스템을 통해 적용할 수 있습니다. 동물을 군집화하려면 격리 동물에서 무균 쥐를 제거하고 통제 역할을하는 기존 동물 앞에 필터가 장착 된 케이지의 기존 축산실에 수용합니다.

그런 다음 대조군 일반 케이지에서 채취한 3일 된 깔짚의 절반을 무균 동물의 깔짚과 섞어 1.5ml 마이크로 튜브에 소변을 모으고 튜브 위로 마우스를 다루어 장을 부드럽게 마사지하여 도움을 줍니다. 5mm NMR 프로브로 획득하려면 최소 20마이크로리터가 필요하지만 대사 프로파일링의 품질을 개선하기 위해 30마이크로리터를 사용하는 것이 좋습니다. 소변을 액체 질소에 즉시 스냅 동결하고 NMR 분석이 있을 때까지 섭씨 영하 40도 이상에서 보관하십시오.

NMR 획득 전에 중수에 0.2몰 인산나트륨 완충액을 준비합니다. 1밀리몰 TSP를 포함하는 pH 7.4는 30마이크로리터의 소변과 30마이크로리터의 인산나트륨 완충액을 혼합합니다. 금속 바늘이 장착된 50마이크로리터 유리 주사기를 사용하여 50마이크로리터의 혼합 용액을 1.7mm NMR 모세관 튜브로 옮깁니다.

거품이 생기지 않도록 주의하세요. 소변 샘플이 들어 있는 모세관 위에 모세관 어댑터를 끼우고 5mm NMR 프로브용 2.5mm NMR 마이크로 튜브에 넣습니다. 이 튜브 조합은 스펙트럼 획득을 위한 표준 5mm NMR 튜브로 사용할 수 있습니다.

이 시연에서는 더 고급스러운 3개의 700MHz NMR 분광계를 사용하여 데이터를 수집합니다. 서면 프로토콜에 설명된 매개변수를 사용하여 1차원 양성자 NMR 스펙트럼을 획득합니다. NMR 획득 후 추출 로드를 사용하여 서면 프로토콜에 설명된 대로 동물 안락사 후 모세관 어댑터를 부드럽게 나사로 조여 2.5mm NMR 튜브에서 모세관을 제거합니다.

간 생검을 준비합니다. 오염을 방지하기 위해 알코올이 함유된 제품을 사용하지 말고 물이나 식염수를 사용하여 도구를 세척하십시오. 재현 가능한 생검을 위해 좌엽에서 간 생검을 수집합니다.

조직이 더 얇은 주변 영역을 피하면서 좌엽 중앙에 지속적으로 수집합니다. 담즙이 새는 경우 담낭에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하십시오. 즉시 물이나 식염수로 조직을 씻으십시오.

액체 질소에서 즉시 생검을 스냅 동결하고 NMR 분석이 완료될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.H-R-M-A-S-N-M-R을 설정하려면 세 번째 생검을 지르코늄 로터에 삽입하고 나머지 부피를 NMR 잠금을 위한 순수한 중수로 채웁니다. 거품을 만들면 후속 shimming 및 데이터 수집의 품질이 변경될 수 있으므로 거품을 만들지 않도록 주의하십시오. 원통형 나사를 사용하여 50마이크로리터 테프론 스페이서를 삽입합니다.

나사를 풀고 짧은 쪽에 있는 깊이 게이지를 사용하여 보정합니다. 스페이서에 나사산 핀을 놓고 드라이버로 부드럽게 조입니다. 건조한 집, 티슈 조각과 함께 잔류 물.

그런 다음 로터 상단에 캡을 놓고 로터 패커에 삽입합니다. 캡이 제자리에 고정될 때까지 세게 누릅니다. 로터와 캡 사이에 공간이 남아 없어야 하며, 검은색 마커 펜을 사용하여 로터 바닥의 절반을 표시하여 광학 스핀 속도를 감지할 수 있습니다.

로터가 충분히 채워지면 NMR 분광계 내부에 넣고 5킬로헤르츠를 회전시키기 시작합니다. 여기. bru 고급 3 개의 500 메가 헤르츠 분광계가 사용됩니다. CP MG 펄스 시퀀스를 사용하여 양성자 NMR 스펙트럼을 획득합니다.

제조업체의 지침에 따르면 5.22ppm의 풍부한 알파 및 숫자 포도당 이중항 피크를 사용하여 결과 NMR 스펙트럼을 보정할 수 있습니다. 로터의 포장을 풀려면 캡 제거제를 사용하여 캡을 제거하고 나사산 핀을 풀고 테프론 스페이서를 제거하여 진행하십시오. 원통형 나사를 사용하여 물과 세제를 사용하여 장치를 철저히 세척 할 수 있습니다.

집락화 과정에 걸친 장내 미생물 공동 대사 산물의 출현은 20일 동안 집락화된 동물의 소변 대사 프로필의 양성자 스펙트럼에 명확하게 설명되어 있습니다. 이 동물은 무균 상태에서 유순한 황산염과 매우 적은 양의 페닐 아세틸 글리신, 약칭 PAG 및 que 세포 황산염을 배설하지 않았습니다. 군집화가 진행됨에 따라 장내 미생물총(microbiota)에 의한 단백질 대사의 이 세 가지 지표는 상당히 증가하여 20일째에 평형에 도달합니다.

특정 PAG 삼중항 피크를 적분함으로써 시간 경과에 따른 이 특정 마커의 증가를 정량화할 수 있었습니다. 이 다이어그램은 양성자 H-R-M-A-S-N-M-R 분광법을 사용하여 7 마리의 동물 그룹에 대한 집락화 중 평균 PAG 농도를 나타내며, 집락화 전후의 두 마우스의 간 대사 프로파일을 나타냅니다. 이 그림은 A-M-A-S-N-M-R 기반 대사 프로필에서 파생될 수 있는 정보를 잘 보여줍니다.

에너지 대사에서 파생된 대사 산물뿐만 아니라 수많은 아미노산을 시각화할 수 있습니다. 이러한 프로파일에는 산화 스트레스, 뉴클레오티드 대사 및 메틸 아민 대사와 관련된 정보도 포함되어 있습니다. 이 예에서 무균 마우스는 글리코겐이 거의 없고 포도당과 트리글리세리드의 양이 매우 적다는 것이 매우 분명합니다.

따라서 이 절차를 따르면 chemo와 같은 여러 통계 도구를 적용하여 대사 프로필에 따라 논리적 샘플을 클러스터링하고 대사 상태와 관련된 바이오마커를 강조할 수 있습니다.