하여 세균없는 마우스 프로 그레시브 콜로니 동안 간장 신진 대사 변경 사항 평가 ¹ H NMR 분광학

본 실험 절차의 목적은 점진적인 군집화가 호스트의 간 대사에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 무균 생쥐를 점진적으로 군집화합니다. 군집화 과정은 NMR 분광법을 통해 미생물 공대사물질의 소변 배출량을 평가함으로써 모니터링합니다.

정착 과정을 모니터링한 후, 마우스로부터 간 생검 조직을 채취하여 대사 프로파일링을 준비합니다. 그 다음, 비파괴적 고해상도 매직 각 회전(magic angle spinning) NMR 분광법을 사용하여 온전한 생검 조직으로부터 간 대사 프로파일을 획득할 수 있습니다. 궁극적으로, 이러한 양성자 NMR 분광법의 활용은 에너지 및 산화 스트레스 경로와 같은 대사 경로에 관여하는 다양한 대사물을 밝혀냅니다.

따라서 본 실험은 군집화 과정 중의 간 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 이는 신장과 같은 시스템에도 적용될 수 있습니다. 동물에게 미생물을 군집화시키려면, 무균 생쥐를 아이솔레이터에서 꺼내 대조군으로 사용되는 일반 동물 앞단에 필터가 설치된 일반 사육실의 케이지에 수용하십시오.

그런 다음 대조군 일반 케이지에서 가져온 3일 된 깔짚의 절반을 무균 동물의 깔짚과 섞습니다. 마우스를 마이크로 튜브 위에 올리고 장을 부드럽게 마사지하여 배출을 도와 1.5 mL 마이크로 튜브에 소변을 수집합니다. 5 mm NMR 프로브로 획득하려면 최소 20 µL가 필요하지만, 대사 프로파일링의 품질을 높이기 위해 30 µL를 사용하는 것이 권장됩니다. 소변을 즉시 액체 질소로 급속 냉동한 후, NMR 분석 전까지 최소 -40 °C에서 보관합니다.

NMR 측정 전, 중수(heavy water)로 0.2 M 인산나트륨 완충액을 준비하십시오. pH 7.4 및 1 mM TSP를 포함하는 이 완충액 30 µL를 th urine 30 µL와 혼합합니다. 금속 바늘이 장착된 50 µL 유리 주사기를 사용하여 혼합액 50 µL를 1.7 mm NMR 모세관으로 옮깁니다.

기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 소변 샘플이 들어 있는 모세관 상단에 모세관 어댑터를 장착하고, 이를 5 mm NMR 프로브용 2.5 mm NMR 마이크로 튜브에 넣습니다. 이 튜브 조합은 스펙트럼 획득을 위한 표준 5 mm NMR 튜브로 사용할 수 있습니다.

본 시연에서는 Bruker Advanced Three 700 MHz NMR 분광계를 사용하여 데이터를 수집합니다. 서면 프로토콜에서 논의된 파라미터를 사용하여 1차원 양성자 NMR 스펙트럼을 획득하십시오. NMR 획득 후, 서면 프로토콜에 기술된 동물 안락사 절차에 따라, 모세관 어댑터를 조심스럽게 돌려 모세관을 2.5 mm NMR 튜브에서 제거하는 추출 로드를 사용하십시오.

간 생검을 준비합니다. 오염을 방지하기 위해 알코올 성분이 포함된 제품은 사용하지 말고, 도구는 물이나 식염수로 세척하십시오. 재현성 있는 생검을 위해 좌엽에서 간 생검 조직을 채취하십시오.

조직이 더 얇은 주변 부위를 피해 왼쪽 엽의 중앙에서 일관되게 채취하십시오. 담즙 누출이 발생하지 않도록 담낭을 천공하지 않게 주의하십시오. 채취한 조직은 즉시 물이나 식염수로 세척하십시오.

생검 조직을 즉시 액체 질소로 급속 냉동한 후 NMR 분석 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. HR-MAS NMR 준비를 위해, 세 번째 생검 조직을 지르코늄 로터에 넣고 나머지 부피를 NMR lock용 순수 중수로 채우십시오. 기포가 생기면 이후의 shimming 및 데이터 획득 품질이 저하될 수 있으므로 주의하십시오. 원통형 나사를 사용하여 50 µL 테플론 스페이서를 삽입하십시오.

나사를 풀고 짧은 쪽의 깊이 게이지를 사용하여 보정하십시오. 스페이서 위에 스레드 핀을 놓고 드라이버로 부드럽게 조이십시오. 티슈로 남아 있는 물기를 닦아내어 건조시키십시오.

다음으로, 로터 상단에 캡을 덮고 로터 패커에 삽입합니다. 캡이 완전히 고정될 때까지 세게 누릅니다. 로터와 캡 사이에 틈이 없어야 합니다. 광학적 회전 속도 검출이 가능하도록 검은색 마커 펜을 사용하여 로터 바닥의 절반 부분을 표시하십시오.

로터가 충분히 충전되면, 이를 NMR 분광계 내부에 넣고 5 kHz로 회전을 시작합니다. 여기서는 Bruker Avance III 500 MHz 분광계가 사용되었습니다. CPMG 펄스 시퀀스를 사용하여 양성자 NMR 스펙트럼을 획득합니다.

제조사의 지침에 따라, 5.22 parts per million에서 나타나는 풍부한 알파 및 숫자 글루코스 이중 피크를 사용하여 결과 NMR 스펙트럼을 보정할 수 있습니다. 로터를 꺼내려면 캡 제거기를 사용하여 캡을 제거한 다음, 나사 핀을 풀고 테플론 스페이서를 제거하십시오. 원통형 나사를 사용하여 장치를 물과 세제로 깨끗이 세척할 수 있습니다.

정착 과정에 따른 장내 미생물 공동 대사물질의 출현은 20일 동안 정착시킨 동물의 소변 대사 프로필을 나타낸 이 양성자 스펙트럼에 명확하게 잘 나타나 있습니다. 이 동물은 무균 상태에서 인돌 설페이트를 전혀 배출하지 않았으며, PAG로 약칭하는 페닐아세틸글리신과 퀴놀 설페이트는 매우 적은 양만 배출했습니다. 정착이 진행됨에 따라 장내 미생물에 의한 단백질 대사의 세 가지 표지자인 이 물질들은 상당히 증가하여 20일째에 평형 상태에 도달합니다.

특정 PAG triplet 피크를 적분함으로써, 시간이 경과함에 따라 이 특정 마커의 증가량을 정량화할 수 있었습니다. 이 도표는 proton H-R-M-A-S-N-M-R 분광법을 사용하여 7마리의 동물 그룹에서 군락 형성 기간 동안의 평균 PAG 농도를 나타내며, 군락 형성 전후 두 마리 생쥐의 간 대사 프로필을 얻었습니다. 이 그림은 A-M-A-S-N-M-R 기반 대사 프로필로부터 도출할 수 있는 정보를 잘 보여줍니다.

수많은 아미노산뿐만 아니라 에너지 대사에서 유래한 대사물질들을 시각화할 수 있습니다. 이러한 프로파일에는 산화 스트레스, 뉴클레오타이드 대사 및 메틸아민 대사와 관련된 정보도 포함되어 있습니다. 본 예시에서는 무균 쥐가 글리코겐을 거의 나타내지 않으며, 포도당과 트리글리세리드 함량이 매우 낮다는 점이 매우 분명하게 나타납니다.

따라서 이 절차에 따라, 대사 프로파일에 따라 논리적 샘플을 클러스터링하고 대사 상태와 관련된 바이오마커를 강조하기 위해 화학계량학(chemo)과 같은 다양한 통계 도구를 적용할 수 있습니다.