의 샘플 준비 Mycobacterium 결핵 압축을 풉니 다

의 metabolomic 프로필

이 절차의 목적은 NMR 대사체학 1차 배양에 의한 결핵균, 무세포 추출물을 분석하고 적절한 성장 단계에서 세포를 수확하는 것입니다. 그런 다음 세포를 용해하고 분석을 위한 무세포 추출물을 얻습니다. NMR 분석을 위해 동결건조된 추출물을 완충액에 재현탁합니다.

마지막으로 NMR 데이터를 수집하고 소프트웨어로 스펙트럼을 분석하여 대사 산물을 식별합니다. 궁극적으로 결핵균에 대한 NMR 분석은 다양한 치료에서 대사 산물 수준의 보존을 보여주는 데 사용됩니다. NMR 대사체학은 중요한 대사 경로와 같은 결핵균 생리학의 주요 측면에 적용할 수 있습니다.

이러한 이해는 약물 작용 및 내성 작용 메커니즘을 규명하고 약물 설계를 위한 새로운 표적을 식별하는 데 중요합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 모든 샘플을 정확히 동일하게 처리할 수 없기 때문에 어려움을 겪을 것이며, 이로 인해 실험실에서 불필요한 변형과 결과가 발생할 수 있습니다. Steven Luka 박사 과정 대학원생은 NMR 처리를 위한 샘플을 처리하는 절차를 시연합니다 내 실험실에서 연구소 관리자와 연구 기술자 3명인 Robert Fenton은 이제 M 결핵을 수행할 때 결핵균 배양을 처리하는 절차를 시연할 것입니다.

연구는 기관 지침에 정의된 생물안전 레벨 3 관행을 따랐습니다. 이 비디오의 라벨에는 생물 안전성 고려 사항을 위해 microbacterium tuberculosis라고 표시되어 있지만, 이 시연에서는 비병원성 mycobacterium magmatic을 사용했습니다. M 결핵의 글리세롤 50% 스톡을 얼음에서 해동하는 것으로 시작합니다.

250 밀리리터 응급실과 내 플라스크에 110 밀리리터의 M-A-D-C-T-W 국물에 0.15 밀리리터를 접종하면 섭씨 37도에서 약 6 일 동안 100 RPM으로 흔들면서 배양액이 성장합니다. 항생제가 없는 경우 대체 추가 또는 기타 치료가 필요한 경우. 처리가 필요한 배양물을 위해 배양물을 수확합니다.

배양, 적정 및 품질 관리를 위해 0.5ml Eloqua를 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 원하는 처리를 수행하고 처리 기간 후에 배양액을 셰이커에 다시 놓습니다. 1밀리리터를 제거하고 OD 600을 결정합니다.

또한 배양, 적정 및 품질 관리를 위해 0.5mL 샘플을 예약하십시오. 남은 전체 프로토콜 동안 얼음 위의 세포를 유지합니다. 15ml의 얼음처럼 차가운 이중 증류수로 세척한 후 원심분리하여 4개의 50ml 튜브에서 세포를 수확합니다.

리스는 펠릿을 10ml 분취액에 현탁시킵니다. 원심분리로 두 개의 부분 표본과 펠릿을 당긴 다음 세포 펠릿을 최종 부피의 이중 증류수 1ml에 재현탁합니다. 응집되지 않는 단일 세포 현탁액을 원하는 경우 27 게이지 바늘에 세포를 통과시킵니다.

1 밀리리터 세포 현탁액을 용해 매트릭스 B.Biosafety 캐비닛 내부에 고속 준비 24 용해 균질화기를 배치하는 2 밀리리터 나사 캡으로 3 회 이동합니다. 샘플을 리텐션 스포크 플레이트를 고정하는 샘플 홀더에 넣습니다. 그런 다음 초당 6미터의 속도 설정으로 60초 동안 처리합니다.

다음으로, 샘플을 원심분리하여 세포 파편과 온전한 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 0.2 미크론 주사기 필터를 통해 supinate를 멸균 튜브에 통과시켜 생존 가능한 세포의 부재를 제어합니다. MADC에 0.1 밀리리터의 샘플을 플레이트합니다. 한천.

샘플을 에탄올 드라이 아이스 수조에서 동결하고 NMR 시설에서 동결 건조 및 처리할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 2 개월 후, 플레이트를 확인하여 식민지 형성 단위가 없는지 확인하십시오. CF 사용자가 발견되지 않으면 표준 NMR 시설에서 추가 분석을 위해 BSL 3 실험실에서 샘플을 제거할 수 있습니다.

건조에 표본을 종류 한 후에, NMR 완충액의 0.7 밀리리터에 있는 현탁시키고 13, 000 시간에 3 분 동안 마이크로 분리기 관 분리기로 옮깁니다. G, 0.6 밀리리터를 제거하고 5 밀리미터 NMR 튜브로 옮깁니다. 매체 분석에서 맞춤형 랙을 사용하면 여러 NMR 튜브를 올바른 깊이의 스피너에 쉽게 로드할

그런 다음 샘플을 NMR 분광계로 옮겨 A-B-A-C-S 1 20 샘플 체인저에 삽입합니다. 처리되지 않은 배양과 약물 처리된 배양을 번갈아 가며 사용합니다. 첫 번째 샘플은 자동 실행을 시작할 때 자석에 미리 로드해야 합니다.

기기를 보정하려면 단일 샘플로 90도 펄스 길이를 최적화하고 나머지 샘플에 대해 기기를 조정하십시오. 아이콘 NMR 및 grad shim을 사용합니다. 모든 샘플에 대한 잠금 shimming 및 NMR 데이터 수집을 자동화합니다.

A 1D 수소 1 NMR 스펙트럼의 경우 수분 억제 및 여기 조각으로 펄스 시퀀스를 선택합니다. 2개의 DH one C 13 hs QC 스펙트럼에 대해 총 32, 000개의 데이터 포인트, 128개의 스캔 및 16개의 더미 스캔을 설정합니다. 펄스 시퀀스를 선택합니다.

직접 H 1차원을 따라 스윕 너비를 가진 총 2048개의 데이터 포인트를 선택하고 간접 C 13 차원을 따라 스윕 너비를 가진 64개의 데이터 포인트를 선택합니다. 또한 128개의 스캔과 16개의 더미 스캔으로 스펙트럼 수집을 지정하여 양호한 신호 대 잡음을 얻을 수 있습니다. m 결핵의 스펙트럼은 50개의 알려진 대사 산물을 포함하여 약 400개의 피크를 생성했습니다.

예를 들어, 동반된 원고에 자세히 설명된 데이터 처리는 D 알라닌 경로와 직간접적으로 관련된 이러한 대사 산물 스펙트럼을 생성했습니다. 최대 강도의 크기는 세포 추출물에 존재하는 대사 산물 농도에 비례하므로 대사 산물 및 대사 경로의 상대적 섭동은 샘플과 처리 간에 정량화할 수 있습니다. LMR 대사체학은 세균학 분야의 연구가 또 다른 병원성 또는 비병원성 미생물인 시각 및 미생물의 생리학 및 발병기전을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

이 비디오를 시청한 후에는 NMR 대사체학을 위해 여러 결핵 세포 추출물을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 전체 프로토콜에서 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.