설치류 중간 Entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 Parasagittal 조각의 작성

다음 실험의 전반적인 목표는 내측 진입 RH 피질에 있는 뉴런의 시냅스 및 통합 특성의 지형 구조를 조사하는 것입니다. 이것은 등쪽 복부 평면(dorsal ventral plane)을 향한 내측 진입 RH 피질의 슬라이스를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 패치 클램프 기록은 시냅스 및 통합 특성을 조사하기 위해 멘토 RH 피질 뉴런을 만듭니다.

다음으로, 기록된 뉴런의 위치를 결정하여 전기생리학적으로 측정된 특성의 배쪽 복부 조직을 평가합니다. 입력 저항, 막 시간 상수 및 활동 전위 임계값의 측정을 기반으로 레이어 2에 있는 성상 세포의 고유 특성의 지형 구조를 보여주는 결과가 얻어지며, 그 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생인 Hugh Pastel이 할 것입니다. 수평 방향의 뇌 절편과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 내부 피질의 등쪽 복부 축을 따라 기록된 뉴런의 위치를 정확하게 기록할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 마우스에서 뇌를 제거하고 즉시 냉간 절단에 넣으십시오. 인공 뇌척수액은 발암물질로 거품을 일으켰다. 3분 후, 주걱을 사용하여 절단 A CSF에서 뇌를 조심스럽게 제거합니다.

절단 A CSF로 적신 여과지 위에 조심스럽게 똑바로 세웁니다. 그런 다음 면도기나 메스를 사용하여 대뇌의 연쇄 끝에 위치한 내측 경장 피질에 영향을 주지 않고 가능한 한 많은 소뇌를 제거합니다. 관상동맥 평면(coronal plane)을 절편하여 대뇌의 상부 부분을 제거합니다.

다음 hemis sec, 정중선의 수직 평면에 있는 뇌. 그 후, 반구를 거품이 있는 상태로 되돌려 장착하기 전에 1분 30초 동안 CSF를 절단합니다. 비브라토 블레이드의 절단면이 수평에서 20도 각도로 기울어져 있는지 확인합니다.장착 표면에서 비브라토 블레이드와 평행하고 대략 반구 너비와 평행하고 두 반구를 끝에서 끝까지 수용할 수 있을 만큼 충분히 긴 얕은 슈퍼 접착제 스트립을 만듭니다.

절단하여 CSF를 장착 표면으로 옮기십시오. 반구를 슈퍼 글루 스트립에 부드럽게 밀어 넣고 각 반구의 내측 표면이 비브라토 베이스와 평행한지 확인합니다. 그 후, 즉시 반구를 냉간 절단에 담그십시오.

CSF입니다. 슬라이싱 절차 전반에 걸쳐 온도와 자동차 및 채도를 유지하십시오. 비브람을 사용하여 각 반구에 있는 내측 장 피질의 가장 측면 부분이 측면 표면에서 최소 600마이크로미터 떨어진 곳에서 식별될 때까지 시상면의 양쪽 반구에서 피질을 제거합니다.

내측 경장 피질의 측면 범위는 해마의 복부 코달 곡선 주위에 두꺼운 흰색 띠가 없는 것으로 확인됩니다. 주부 경계의 볼록하지 않은 모양과 각진 등쪽 코달 모서리는 내측 경장 피질의 내측 범위에 도달할 때까지 양쪽 반구에서 400미크론의 파라 시상 단면을 절단합니다. 각 절단 후 즉시 섭씨 35도의 수조에서 유지되는 탄수화물 포화 표준 A CSF에 슬라이스를 넣고 약 15분 동안 배양합니다.

15분 후 수조에서 슬라이스 홀더를 제거하고 실온에서 최소 45분 동안 탄수화물로 계속 거품을 냅니다. 슬라이스를 섭씨 35도의 카보겐 포화 표준 A-C-S-F-A로 지속적으로 거품이 일고 있는 기록 챔버로 옮깁니다. 다음으로, 내측 진입 RH 피질 내의 대략적인 기록 영역을 식별합니다.

그런 다음 고배율 대물렌즈로 전환합니다. 이 영역 내에서 생존 가능한 세포를 식별합니다. 이 시점에서, 식별된 뉴런으로부터의 막 전위 또는 막 전류를 기록하기 위해 종래의 전체 세포 패치 클램프를 사용하는 실험을 수행할 수 있습니다.

뉴런 정체성은 기록된 뉴런의 전기생리학적 특성과 세포 내 용액 내에 형광 표지를 포함함으로써 확인할 수 있습니다. 등쪽 복부 축을 따라 기록된 뉴런의 위치를 결정하기 위한 실험이 끝나면 저배율 대물렌즈로 전환합니다. 이미지에 기록 전극을 포함하거나 자기장 홍채 다이어프램을 단계적으로 내려서 관심 위치를 표시합니다.

복제 이미지 이미지, 내측 및 RH 피질 영역 및 슬라이스의 주변 영역에서 관심 위치 주위에 밝은 원을 남겨 이미지 내의 기록 위치를 정확히 찾아내기 위해 복제본을 녹화 위치와 그 주변의 초기 이미지에 겹쳐 놓을 수 있습니다. 복부 기록 위치에서 내측 내막 피질의 등쪽 경계까지의 영역을 커버하기 위해 최대 3개의 개별 저배율 이미지가 필요할 수 있습니다. 그런 다음 이미지 조작 소프트웨어를 사용하여 이러한 이미지를 함께 연결할 수 있습니다.

내측 경장 피질의 등쪽 경계는 등쪽 복부 위치를 측정하는 편리한 랜드마크를 제공하지만 내측 경장 피질의 복부 경계는 잘 정의되지 않았습니다. 여기. DIC 및 NIAL para sagittal section은 원형 해마와 외측 경장 피질의 1층으로 각각 paras orbicular 돌출이 없음을 보여줍니다. 이것은 내측 경장 피질을 포함하는 전형적인 절편의 이미지입니다.

파라스 영역은 미사일 염색에 의해 명확하게 드러납니다. 해당 이미지에서 검은색 화살표로 표시된 내측 경장 피질의 등쪽 경계는 빨간색 화살표로 표시된 것처럼 레이어 1로 멀리 돌출된 paras orbicular cell 그룹의 복부입니다. 다음은 파라 시상면 슬라이스의 4배 확대 합성 이미지의 예입니다.

등쪽 세포와 배쪽 세포의 위치는 각각 파란색과 녹색으로 채워진 원으로 표시됩니다. 검은색 화살표는 내측 내피 피질의 추정된 등쪽 경계를 표시하며 흰색 점선에 의해 깊은 층으로 확장됩니다. 흰색 실선은 윤곽 경로를 보여주는 안내선이며, 이를 따라 표시된 등쪽 및 복부 성상 세포에서 복부에 위치한 세포 기록까지의 거리 픽셀 측정이 여기에 표시됩니다.

이러한 기록은 세포의 정체성을 확립하고 내측의 전기적 특성이 r 피질에 어떻게 들어가는지를 설명하는 데 도움이 됩니다. 2 층 별 세포는 이 절차를 시도하는 동안 등쪽과 복부 위치에서 다릅니다. 고품질 슬라이스는 생산적인 전기생리학적 기록에 필수적이므로 슬라이스를 준비하는 동안 매우 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.