Name: 설치류 중간 Entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 Parasagittal 조각의 작성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 설치류 중간 Entorhinal 피질의 Parasagittal 조각 작성 방법을. Dorsal-ventral 축을 유지하며 patch clamp 기록으로 뉴런의 시냅스 및 통합 특성을 연구합니다. 이 기법은 항해와 기억의 세포 메커니즘 이해에 필수적입니다.

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우리는 그들의 지원을 위해 다음과 같은 감사 위치 : 연방 장학위원회 영국 기금 (HP), EPSRC (HP), BBSRC (MFN) 및 유럽 연합 (EU) 마리 퀴리의 작업 (MFN).

1. Parasagittal 슬라이스 준비 1.1 대뇌 반구를 해부 모든 동물 실험은 지역 윤리적 검토와 국가의 규정을 따라야합니다. 여기에서 설명한 실험의 경우, 작품은 영국의 동물 (과학적 절차) 법 1986 준수. 우리는 정기적으로 두뇌를 제거하기 전에 마우스를 안락사시키려는 마취없이 경추 탈구를 사용합니다. 또는 마우스들은 불치병 anesthetized 될 수 있지만,이 경우는 마취의 선택의 연결 속성에 영향을 미치는지 확인 할 수 있습니다. 마우스에서 두뇌를 제거하고 추위에 즉시 장소 (4-8 ° C) 인공 뇌척수 (ACSF)을 (용액 조성을위한 표 1 참조) 절삭하는 carbogen (95% O 2 5 % CO 2)와 채도로 부풀어 오른 모양이었다. 3 분 최대 후에 신중하게 C에서 두뇌를 제거utting ACSF는 주걱을 사용하여 부드럽게 커팅 ACSF (그림 1A)로 moistened되었습니다 거름종이를 향해 수직 위치 (위쪽으로 향하게 지느러미 쪽)에 넣습니다. 반구의 장착 정확하고 용이하게하기 위해 멕을 (뇌를의 꼬리 극단에 위치)에 영향을주지 않고 최대한 소뇌의를 제거하고 코로나 비행기에 sectioning에 의해 뇌를의 주동이의 세번째를 제거하는 면도날이나 메스를 사용하여 (그림 1B). 섹션 정확히 중간선 (그림 1C)의 수직 평면을 따라는 것을 돌보는 두뇌를 Hemisect. 1.5 분 동안 부풀어 오른 절단 ACSF로 반구를 반환합니다. 1.2 vibratome에 반구를 탑재 장착하기 전에 vibratome 블레이드의 첨단이 수평에서 20도 각도에서되도록 ( <strong&gt; 그림 1D). 장착 표면에서 약 vibratome 블레이드에 superglue 평행의 얕은 스트립, 반구의 넓이를 만들어 충분히 두 개의 반구 엔드 - 투 - 엔드를 수용합니다. 그 내측 표면이 주걱에 달려 있으며 지느러미 범위가 마이크로톰 블레이드 향해 직면 있도록 신체에 미치는 영향을 최소화하기 위해 돌보는 것은 주걱 및 위치와 절단 ACSF의 각 반구를 제거합니다. 부드럽게 각 반구의 내측 표면 마이크로톰 기지 평행한지 확인하는 것은 돌보는 superglue의 스트립에 각 반구를 끼웁니다. 우리는 최상의 결과를 위해 각 반구의 지느러미 표면에 평행하게 vibratome 블레이드 (그림 1D)을 직시해야 것으로 나타났습니다. 깔끔히 동안 준비 1.3 유지 보수 즉시 장착 차가운 절단 ACSF (- 8 ° C 4)에서 잠수함 반구에 이어. temperatur를 유지깔끔히 절차 전반에 걸쳐 전자와 carbogen 채도. 커팅 챔버의 솔루션의 직접적인 냉각 및 기포가 실용적이 아닌 경우, 정기적으로 신선한 차게하고 부풀어 오른 솔루션 챔버에서 절단 ACSF 솔루션을 보충. 1.4 컷 섹션 당신은 (그림 1 층) (측면 표면에서 일반적으로 ~ 1mm 다운) 멕의 측면에서 가장 범위를 식별할 때까지 vibratome 사용하여 화살 비행기의 양쪽 반구에서 피질을 제거하십시오. 상처가 너머로 칼날을 끌어 노출된 조직 손상을 방지하기 위해 ~ 최대 200 μm의를 vibratome 블레이드 리프트 사이. 멕의 중간 정도에 도달할 때까지 동시 (그림 1D와 같이 그들이 줄지어있다면 그들이 동시에 절단됩니다 모두) 양쪽 반구에서 400 μm의 parasagittal 섹션을 했네요. 이것은 전술 ventro - 꼬리 곡선 주위에 두꺼운 흰색 밴드의 부재에 의해 확인할 수 있습니다그는 해마 (외부 캡슐)의 주동이의 경계의 비 볼록 모양과 각도 dorso-꼬리 &#39;코너&#39;. 그림 1E는 멕의 측면 parasagittal 비행기에서 해마의 둥근 모양을 보여줍니다. 수치는 1 층-G 설명 깔끔히 때 멕 내의 섹션은 서로 다른 측면 - 중간 위치에 표시하는 방법. 보다 중간 위치에있는 해마의 점차적으로 더 많은 콩 모양의 외관을합니다. 각 반구는 일반적 멕을 포함한 두 세 400 μm의 두께 슬라이스를 얻을. 1.5 품어 조각 각 절단 직후 35 ° C.에 물 목욕 유지 carbogen - 포화 표준 ACSF의 조각을 배치 조각은 깔끔히 후 ACSF 약 15 분 동안 35 ° C에서 품어하도록 허용하는 것은 분명하다. 물 목욕에서 슬라이스 홀더를 제거하고 나에 대해 상온에서 carbogen으로 품어 계속동쪽 45분. 2. 예 Parasagittal의 슬라이스 실험 이러한 준비 과정을 사용하여 일반적인 실험 멕의 계층 II에 별 모양의 세포에서 electrophysiological 레코딩을하는 것입니다. 2.1 최적화 광학 녹음하기 전에, 콘덴서는 슬라이스 비행기 (쾰러 조명)에 초점에 있으며 높은 배율 (예 : 40x) 목표 아래 중앙에 있는지 확인하십시오. 관심 2.2 확인 세포 낮은 배율 멕 (그림 2A-B) 내에서 대략적인 녹화 영역을 식별할 (예 : 4X) 목표를 사용합니다. 이 영역 내에서 실행 가능한 세포 (그림 2C-D)를 식별하기 위해 높은 배율의 목표로 전환합니다. 예를 들어, putative 레이어 II 별 모양의 세포가 시각적으로 유사한 diame 자신의 다각형 또는 난형의 모양과 여러 주요 dendrites에 의해 식별됩니다ter, 그리고 dendrite 2,13,14 혀끝의 하나의 큰 직경의 부재. 그들이 소그룹 2,9 (그림 2C-D)에 나타나는 자주 풍부하고 어디에 그들이 안정적으로 레이어 I / II 테두리의 가장자리에 식별됩니다. 이러한 interneurons과 피라미드 세포 같은 다른 세포 유형도 식별해야합니다. 이 시점에서 실험 기록된 신경 세포에 시냅스 입력을 활성화하기 위해 막 잠재적인 또는 확인된 뉴런에서 현재 멤브레인 및 전기 또는 optogenetic 방법을 기록하는 전체 세포 패치 - 클램프를 사용하여 예를 들어, 수행 할 수 있습니다. 신경 세포 정체성이 기록된 신경 세포의 electrophysiological 속성에서와 세포내 용액 내에서 형광 라벨을 포함하여 확인할 수 있습니다. 3. Dorso - 복부 축을 따라 위치를 측정 3.1 이미지 관심의 위치와 주변 슬라이스 recor의 위치를​​ 확인하려면지느러미 - 복부 축을 따라 ded 신경 세포가 첫 이미지 슬라이스와 주변 지역의 멕 지역에 낮은 배율 목표를 사용합니다. 이미지 (그림 3A) 또는 중복 이미지에 대한 관심의 위치 주위에 밝은 동그라미를 떠나 현장 아이리스 다이어프램을 스테핑하여 기록 전극을 포함 예를 들어 의한 관심의 위치, 표시한다. 중복 그때 녹음 위치와 그 주변 (그림 3B)의 초기 이미지가 겹쳐진 수있는 이미지 내의 녹화 위치를 파악합니다. 최대 이미지 멕의 지느러미 테두리에 복부 촬영 위치에서 지역을 충당하기 위해 필요할 수 있습니다 세 별도의 낮은 배율 (4X)에 적용됩니다. 이 이미지는 다음 거리를 측정합니다 (그림 3)에서 취할 수있는 이미지를 제공하기 위해 이미지 조작 소프트웨어를 사용하여 함께 맞춘 수 있습니다. 신경 세포의 신원과 위치의 추가 검증을 포함하여 녹음에 따라 수행하실 수 있습니다이러한 세포내 용액 내에서 다음 녹음이 따르는 조직의 적절한 처리를 사용 biocytin이나 알렉사 염료와 같은 비활성 마커. 3.2 멕의 지느러미 국경을 수립 멕의 지느러미 테두리는 지느러미-복부 위치를 측정할 수있는 편리한 랜드마크를 제공합니다. 멕의 복부 경계선은 잘 정의되지 않았습니다. 그림 4는 여러 중간 - 수평 위치에서 Nissl 스테인드 조각에 정의된 멕 세포 랜드마크가 DIC 조명 아래에 나타 방법을 보여줍니다. 그림 4는 원형 해마 (그림 4은 (i)) 및 계층 I (그림 4 (4)) 측면 Entorhinal 접속 (LEC)를 포함하는 parasagittal 조각과 연관된에 parasubicular 돌출부의 부족을 보여줍니다. 그림 4 기원전는 ME를 포함하는 전형적인 조각을 보여C.는 DIC 조명 조각에서 두드러진 어두운 지느러미 Parasubicular / Entorhinal 경계 지역의 지느러미 부분 parasubiculum의 영역을 포함하고 있습니다. parasubiculum 지역은 명확 칼럼 (3)의 해당 이미지 Nissl 염색법에 의해 드러났습니다. 멕 (4B와 4C 칼럼 (4)의 검은 화살표)의 지느러미 테두리는 레이어 I (4B와 4C 칼럼 (4)에서 빨간색 화살표)로 멀리 protrudes parasubicular 세포의 그룹에 복부이다. 그림 4B와 4C 열 (2)와 Nissl 섹션 멕의 지느러미 테두리가 DIC 슬라이스의 어두운 Parasubicular / Entorhinal 경계 지역의 지느러미 가장자리에 복부가 위치에 해당하는 (3) 쇼 (의 비교 검은색 화살표). 테두리의 위치는 (또한 심판. 14 참​​조) DIC 이미지와 비교에서 참조 이미지를 예상 할 수 있습니다. 분자 마커와 지느러미 멕 국경의 미래 검증이 추정의 정확도가 향상됩니다. 우리는 THA 있습니다지마 참조 섹션을 묻다, 그리고 라벨 뉴런의 형태학의 식별을 위해 처리되는 부분은 상당한 수축에 따라 달라질 수 있습니다. DIC 및 참조 섹션의 랜드마크에 상대적으로 절대적인 거리의 비교 그러므로 첫번째 측정 및 수축에 대한 수정 (예 : 심판 2 참조)이 필요합니다. 3.3 거리를 보정과 측정 거리 변환 비율 : 이미지의 거리를 쉽게 측정을 용이하게하기 위해 픽셀을 설정하기 위해 이미지 참조 격자에 동일한 낮은 배율 목표를 사용합니다. 그래픽 프로그램을 사용하여 멕의 등고선을 따라 흥미 위치 멕의 지느러미 테두리에서 픽셀 거리를 측정하고 μm의에서 거리 (그림 5A)으로 픽셀 거리를 변환합니다. 뉴런이 같은 biocytin 같은 표식으로 가득차있다면, 기록된 신경 세포의 위치는 다음에도 (예 : 심판 2 참조) 적절한 처리하여 복구할 수 있습니다. 4. Representative 결과 그림 5A는 예를 들어 낮은 배율 (4X) 겹쳐 녹음한 뉴런 및 측정 가이드의 위치와 녹음 후 parasagittal 슬라이스의 합성 이미지를 보여줍니다. 표시된 지느러미와 복부 별 모양의 세포에서 레코딩이 그림 5B에 표시됩니다. 이 녹음은 세포의 정체성을 확립하고 멕 레이어 II에 별 모양의 세포의 전기적 특성은 지느러미와 복부 위치에 차이가 방법을 설명하는 데 도움이됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig1.jpg" /> 1 그림. parasagittal 조각의 작성. 필터 종이에 위쪽으로 향하게 지느러미 측면과 함께 휴식 전체 머리가 ACSF. B에게 절단과 moistened </strong은 장착 준비 전두엽 피질. C Hemisected 두뇌의 소뇌와 주동이의 세번째의 제거 후&gt; 브레인. D는 병렬 ACSF 절삭 년 전에 침수로 vibratome 블레이드의 가장자리를 절단하고 LEC를 포함하는 섹션. 전자 외관을 깔끔히에 동안 접착제 스트립의 반구를 마운트 조직 추가 400 μm의를 (표면에 표시된 것과 중간 400 μm의입니다 제거한 후 멕의 &#39;측면&#39;의 일부 측면 조직의 제거 후 절차를 깔끔히하고 표준 parasagittal 멕 슬라이스에 대해 아직 충분히 중간 없습니다. F 모양 . (F)) 400 μm의 parasagittal 슬라이스 후 멕의 &#39;중간&#39;부분의 G 외관이 절단되어 각각 해부 랜드마크, C 나타내는 EF의 HI 회로도 :. 소뇌, L : 가로 entorhinal 피질 (LEC), 소 : 중간가 Entorhinal 접속 (멕), H : 해마, 오렌지 : 외부 캡슐, 파랑 : 코퍼스 callosum, 시안 : 이가있는 이랑, GR18 이요 : CA3 및 CA1. (H에 검은색 화살표) 만 멕 포함하는 슬라이스에있는 반면, 경계가 선형이 될 수있다 (빨간색 전에서 화살표) 또는 오목 (J에서 빨간색 화살표) LEC를 포함하는 슬라이스에있는 해마의 주동이의 경계의 모양이 오목입니다. 색깔의 해부 학적 경계표의 대략적인 모양은 앨런 뇌 아틀라스 (의 주석에서 얻은되었다 <a href="http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html">http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html</a> ). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig2.jpg" /> 그림 2. DIC 조명 아래 멕 레이어 II 세포를 식별. 패러의 예제 합성 이미지<html> 낮은 배율의 화살 뇌 슬라이스 (4X). 별도의 이미지를 정렬하고 산만 가장자리와 vignetting를 제거하는 혼합되었습니다. 중요 획기적인 영역의 H : 해마, M :.. 높은 배율의 오른쪽 가장자리 근처에 어두운 세로 스트 라이프와 같은 눈에 띄는, 멕 C 멕 레이어 II의 계층 II를 (포함하는 개별 낮은 배율 (4X) 이미지에서 멕의 B 자르기 DIC 조명과 40x). 이미지는 여러 이미지의 정렬 및 혼합 합성입니다. 세포의 밀도 중심 &#39;열&#39;은 레이어 II에 건강한 putative 별 모양의 세포와 interneurons의 그룹을 보여주는 레이어 II. D 싱글 높은 배율 DIC 이미지입니다. 여기에 표시된 바와 같이, 세포가 자주 레이어 I / II의 경계에 그룹에서 발생하는 별 모양의. 피라미드 세포 가까이 레이어 II / III 국경에 발견되는 경향이 있습니다. 교류의 점선 윤곽선은 각각 BD의 범위를 나타냅니다. 스케일 바 : A와 B 500 μm의에서, C 및 D 100 μm의 인치 그림 3은 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. 관심 지역의 지느러미-복부 위치를 측정. 연합 낮은 배율 (4X)의 관심 위치 (기록 전극의 일각에 의해 표시)과 어두운 Entorhinal / Parasubicular 경계 지역 랜드마크 (지느러미 국경을 수립하는 데 사용 사이 멕의 전체 dorso-복부 범위를 포함 이미지 멕의 -. B는 마찬가지로) 그림 4를 참조하지만, 현장 아이리스 다이어프램 (감소 불투명도와 중첩) 대신 관심의 위치를 표시하는 기록 전극을 중지와 겹쳐 이미지를 포함합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig4.jpg" /> 4 그림. parasagittal 조각의 DIC 이미지에서 멕의 지느러미 테두리를 예측. Entorhinal 접속에서 AC Parasagittal 섹션 (중간에 가로). DIC와 Nissl 섹션은 서로 다른 마이크 출신전자 AC 칼럼은 (i) :.. 전체 parasagittal 조각 (400 μm의 두께) (정렬과 낮은 배율 (4X) 심상의 혼합 복합 재료) AC 칼럼 (2)는 :에 특징적인 진한 Parasubicular / Entorhinal 경계 지역으로 entorhinal 피질 부위 닫아 각 이미지의 상단 영역입니다. AC 칼럼 (3) Nissl 스테인드 조각 (두께 40 μm의)는 다른 마우스는 AC (2)에서 이미지를 정렬. 세포의 어둡고, 밀도 레이어는 레이어 II입니다. 비교 열 (2) 그리고 (iii) Nissl 스테인드 세포는 DIC 이미지에 표시되는 방법을 보여줍니다 교류 열 (IV) :. Nissl 스테인드 조각의 상세. B와 C 열 (IV)는 parasubiculum (DIC 이미지의 어두운 Parasubicular / Entorhinal 경계 지역의 지느러미 부분)와 지느러미 멕의 세포에서 세포를 포함합니다. B (4) 및 C (4) 계층에 깊이 뻗어 parasubicular 세포의 큰 지느러미 패치에서 나는 (빨간색 화살표)을 쉽게 볼 수 있습니다. 이러한 패치의 복부 가장자리는 지느러미 보에 해당멕의 rder (검은색 화살표). 년 (4) parasubicular 패치 슬라이스 표준 parasagittal 멕 슬라이스 준비도 측면임을 나타냅니다 결석입니다. 모든 패널에 검정색 화살표가 멕의 지느러미 테두리를 나타냅니다. 회색 화살표는 멕의 대략적인 복부 경계를 나타냅니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig5.jpg" /> 그림 5. 대표 결과입니다. 그림 3에있는 이미지의 혼합과 자른 부분. 지느러미 전지 및 복부 세포의 위치는 각각 파란색과 녹색으로 채워진 동그라미로 표시됩니다. 검은색 화살표는 멕의 예상 지느러미 경계를 표시하고 흰색 점선으로 깊은 레이어로 연장됩니다. 솔리드 화이트 라인은 멕의 지느러미 국경에서 ventrally 위치한 세포까지 거리 픽셀 측정이 수행된 어떤 따라 윤곽 경로를 보여주는 가이드입니다. 스케일 바 : 500 μm의 B 전기주세요.세포의 생리 흔적이 왼쪽에서 오른쪽으로 A에서 표시 - 입력 저항을 계산하는 데 사용되는 현재의 단계에 subthreshold 응답을, 큰 긍정적인 전류 스텝, 스파이크 세부 사항에 대한 응답을 탔지.

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공개하는 아무것도.

우리가 상세하게 여기 멕의 지느러미-복부 정도를 유지 parasagittal 슬라이스 준비 생산을위한 절차를 설명했습니다 지느러미-복부 조직을 따라 멕 회로 특성 조사를 용이하게합니다. 중요 단계 동물의 두뇌를 제거하고. 두뇌에 exerting 압력을 피하기 위해 특별한주의를 기울입니다. 이것은 뇌의 급격한 제거보다 더 중요하다. 칼자국. 슬라이스는 단단히 잡고 챔버 바닥에 붙어 있어야합니다. vibratome는 Z 축 진동 &lt;2 μm의가 있어야하고 높은 진폭과 낮은 속도 설정과 함께 사용해야합니다. 최적의 설정은 모델간에 다를 수 있으며, 시행 착오에 의해 설립되어야합니다. 용액의 온도를 모니터링. 우리는 슬라이스 품질이 절단 도중...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 절단 ACSF (㎜) </td><td> 표준 ACSF (㎜) </td><td> 내부 용액 (㎜) </td><td> CASNumber </td><td> 공급 업체 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 86 </td><td> 124 </td><td></td><td> 7647-14-5 </td><td> 시그마 S9888 </td></tr><tr><td> 아뇨 2 PO 4 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td></td><td> 13472-35-0 </td><td> 시그마 71,505 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2.5 </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td><td> 7447-40-7 </td><td> 시그마 P3911 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td></td><td> 144-55-8 </td><td> 피셔 S/4240 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 25 </td><td> 20 </td><td></td><td> 50-99-7 </td><td> 시그마 G5767 </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 75 </td><td></td><td></td><td> 57-50-1 </td><td> 시그마 S5​​016 </td></tr><tr><td> 칼슘CL이 </td><td> 0.5 </td><td> 2 </td><td></td><td> 10043-52-4 </td><td> VWR 190464K </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 7 </td><td> 일 </td><td> 2 </td><td> 7786-30-3 </td><td> 시그마 63,020 </td></tr><tr><td> K 글루 콘 산 </td><td></td><td></td><td> 130 </td><td> 299-27-4 </td><td> 시그마 G4500 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 7365-45-9 </td><td> 시그마 H3375 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0.1 </td><td> 67-42-5 </td><td> 시그마 E4378 </td></tr><tr><td> 나이 ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td> 34369-07-8 </td><td> 시그마 A7699 </td></tr><tr><td> 나이 GTP </td><td></td><td></td><td> 0.3 </td><td> 36051-31-7 </td><td> 시그마 G8877 </td></tr><tr><td> NaPhospho - 크레아틴 </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 19333-65-4 </td><td> 시그마 P7936 </td></tr><tr><td> Biocytin (옵션) </td><td></td><td></td><td> 2.7 </td><td> 576-19-2 </td><td&gt; 시그마 B4261 </td></tr></tbody></table> 표 1. ACSF 표준 ACSF와 K-글루 콘 산 내부 솔루션 요리법을 절단.

설치류 중간 entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 parasagittal 조각의 작성

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

두뇌의 계산들은 시냅스 입력을 적절하게 응답 뉴런에 의존합니다. 뉴런들은 보완하고 그들이 시냅스 입력에 응답하는 방법을 결정 멤브레인 이온 채널의 배포판에 다릅니다. 그러나 이러한 세포 특성과 동물 행동에의 연결을 함수 간의 관계가 잘 이해되지 않습니다. 이 문제에 대한 하나의 접근 방식들은 인코딩 정보 또는 계산을 향해 개별 뉴런지도의 위치들이 1을 수행하는 topographically 조직 신경 회로를 조사하는 것입니다. 이 접근법을 사용하는 실험은 감각과인지 회로 2,3 년 정보 인코딩을 밑에있는 시냅스 반응의 튜닝을위한 원리를 제안합니다. 중간 entorhinal 피질 (멕)의 지느러미 - 복부 축에 대한 공간적 표현의 지형 조직은 세포 메커니즘과 계산 사이의 관계를 확립하는 기회를 제공하고 전공간 인식을위한 mportant. 쥐 멕의 계층 II에 뉴런은 사용 위치 필드에게 4-6를 해고 그리드와 같은 인코딩. 점차적으로 더 많은 복부 자세에서 뉴런이 거리보다 1m로 증가하는 반면 멕의 지느러미 위치에서 찾을 뉴런에 격자를 형성하는 개별 발사 필드 간의 거리는 30cm의 순서에 있습니다. 몇몇 연구들은 이러한 세포 특성이 공간적 계산 2,7-10을 위해 중요하다는 것을 제안하고, 그리드 해고 필드 사이의 간격처럼, 또한 그들의 지느러미 - 복부 위치에 따라 다르다, 그렇게 멕의 계층 II에 뉴런의 세포 특성을 발표했습니다. 여기 멕 뉴런의 biophysical 및 해부 학적 특성의 지형 조직의 멕있게 조사 지느러미-복부 정도를 유지하고 뇌 조각의 준비와 electrophysiological 레코딩을위한 절차를 설명합니다. 확인된 N의 지느러미-복부 위치그것이 슬라이스의 정확한 지느러미-복부 위치에 대한 기준점을 확립하기 어려운이기 때문에 해부 학적 경계표에 상대적 eurons는, 멕 7,8,11,12의 수평 조각을 사용하는 프로토콜과 정확하게 설정할 어렵습니다. 우리가 설명하는 절차는 멕뿐만 아니라 분자 그라디언트 2,10의 시각화의 지느러미 - 복부 축을 따라 기록된 세포의 위치를 정확하고 일관성있는 측정을 가능하게합니다. 절차는 성인 쥐 (&gt; 28일)와 함께 사용하기 위해 개발되었습니다 성공적으로 1.5 년 이전에 쥐가 함께 근무하고있다. 조정을 통해 그들은 어린 쥐 또는 다른 설치류 종과 함께 사용할 수 있습니다. 준비 및 측정의 표준 시스템이 해당 지역의 셀룰러 및 microcircuit 속성의 체계적인 조사를 도움이됩니다.

우리는 중간 entorhinal 피질 (멕)의 지느러미-복부 축을 유지 뇌 조각의 준비와 electrophysiological 레코딩을위한 절차를 설명합니다. 위치의 신경 인코딩 멕 내에서 지느러미-복부 조직을 따르기 때문에,이 절차는 탐색 및 메모리에 중요한 세포 메커니즘 조사를 용이하게합니다.

설치류 중간 Entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 Parasagittal 조각의 작성

뇌의 연산은 뉴런이 시냅스 입력에 적절하게 반응하는 것에 의존합니다. 뉴런은 ...의 구성과 분포 면에서 서로 다릅니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 내측 전두엽 RH 피질 뉴런의 시냅스 및 통합 특성의 지형학적 조직을 조사하는 것입니다. 이는 등-배 평면으로 배향된 내측 전두엽 RH 피질 절편을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 시냅스 및 통합 특성을 조사하기 위해 RH 피질 뉴런에서 패치 클램프 기록을 수행합니다.다음으로, 전기생리학적으로 측정된 특성의 배측-복측(dorsal-ventral) 구성을 평가하기 위해 기록된 뉴런의 위치를 결정합니다. 입력 저항, 막 시상수 및 활동 전위 임계값의 측정값을 바탕으로 2층에 있는 성상 세포(stellate cells)의 고유 특성에 대한 지형적 구성을 보여주는 결과가 도출됩니다. 이 절차의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Hugh Pastel이 맡겠습니다. 수평 방향의 뇌 절편과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 내측 피질의 배측-복측 축을 따라 기록된 뉴런의 위치를 정확하게 기록할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 마우스에서 뇌를 적출하여 즉시 카보젠(carbogen)으로 버블링한 차가운 인공 뇌척수액(artificial cerebral spinal fluid) 절단액에 넣습니다. 3분 후, 스패튤라를 사용하여 절단용 인공 뇌척수액에서 뇌를 조심스럽게 꺼냅니다.이를 cutting A CSF로 적신 여과지 위에 조심스럽게 수직으로 놓습니다. 그런 다음 면도날이나 메스를 사용하여 대뇌의 꼬리쪽 끝에 위치한 내측 엔테랄 피질(medial enteral cortex)에 영향을 주지 않으면서 소뇌를 최대한 제거합니다. 관상면으로 절단하여 대뇌의 머리쪽 부분을 제거합니다.다음으로 정중선 수직 평면에서 뇌의 반구를 절단합니다. 그 후, 마운팅 전 1분 30초 동안 CSF가 포함된 버블 커팅 용액에 반구를 다시 넣어둡니다. 비브라톰(vibratome) 칼날의 절단면이 수평면으로부터 20도 각도가 되도록 조정하십시오. 마운팅 표면에 비브라톰 칼날과 평행하게, 반구의 너비와 거의 비슷하고 두 개의 반구를 일렬로 배치할 수 있을 만큼 충분한 길이의 얇은 순간접착제 띠를 도포합니다.그 다음, 반구의 내측면이 스패튤라 위에 놓이고 등쪽 끝이 진동 절단날을 향하도록 배치하여, 각 반구를 절단용 CSF에서 마운팅 표면으로 옮깁니다. 반구를 순간접착제 띠 위로 부드럽게 밀어 넣고, 각 반구의 내측면이 진동 베이스와 평행한지 확인합니다. 그 후, 즉시 반구들을 차가운 절단액에

preparation-parasagittal-slices-for-investigation-dorsal-ventral

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐 새끼의 뇌에서 콜리큘로-시상 피질 뇌 절편을 준비하는 방법을 보여줍니다. 고립된 뇌는 표시된 슬라이드에 정렬되고 청각 중뇌와 전뇌를 같은 평면에 정렬하기 위해 비스듬히 절단됩니다. 그런 다음 비브라톰을 사용하여 뇌를 절편화하고, 주요 청각 중뇌 및 전뇌 구조를 포함하는 절편을 보존을 위해 보관실로 옮깁니다.

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain(쥐 강아지 뇌의 Colliculo-Thalamocortical Slices)

이 비디오는 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하는 데 중점을 두고 마우스에서 수평 해마 뇌 절편을 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 이 과정에는 뇌를 조심스럽게 이등분하고 고정하고, 절단을 위해 진동을 사용하고, 발암액으로 최적의 조직 상태를 유지하여 추가 실험을 위해 준비된 해마 뇌 절편을 만드는 것이 포함됩니다.

Horizontal Mouse Hippocampal Brain Slices 얻기

이 비디오는 쥐의 뇌에서 MT-ACC(Medial thalamus-anterior cingulate cortex) 절편을 준비하는 방법을 보여줍니다. 쥐의 뇌를 해부하고, MT-ACC 경로를 노출시키기 위해 절단하고, 진동을 사용하여 절편을 생성합니다. 그런 다음 MT-ACC 절편은 산소가 공급된 인공 뇌척수액에서 유지됩니다.

마우스 뇌에서 내측 시상-전방 대상피질 절편의 생성

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 망막 생성 및 피질 생성 시냅스의 전기 생리학적 기록을 설명합니다. dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN)를 포함하는 절편은 기록 챔버에 배치됩니다. 자극 피펫은 망막 신경절 세포(RGC)를 자극하고 망막 자극 시냅스를 조사하기 위해 시신경관에 배치되거나 피질 뉴런을 자극하고 피질 생성 시냅스를 조사하기 위해 망상 시상핵(nucleus reticularis thalami)에 배치됩니다. 자극을 받으면 망막 신경세포와 피질 뉴런은 흥분성 신경전달물질을 방출하여 LGN 중계 뉴런에서 시냅스 전류를 생성합니다. 이러한 전류는 패치 클램프 기록 피펫을 사용하여 기록됩니다.

쥐 뇌 절편에서 Retinogeniculate 및 Corticogeniculate 시냅스에 대한 전기생리학적 연구

이 비디오는 피질 흥분성 피라미드 뉴런에서 광 활성화 양이온 채널을 발현하는 형질전환 마우스의 관상 피질 절편에서 ictal events의 유도를 보여줍니다. 절편은 기록실에 놓이고, 기록전극은 표재성 피질층에 삽입된다. 칼륨 채널을 차단하는 발작 유도 약물을 관류하면 뉴런은 과흥분 상태가 되고 자발적인 ictal 이벤트를 생성합니다. 온디맨드 ictal 이벤트를 생성하기 위해 짧은 광 펄스를 사용하여 피라미드 뉴런의 양이온 채널을 활성화하여 흥분성 신경 전달 물질의 방출을 트리거하여 시냅스 후 뉴런이 짧은 기간 동안 ictal 이벤트를 생성하도록 유도합니다.

생쥐의 뇌 피질 절편에서 자발적이고 온디맨드(on-demand) 익탈 사건의 발생(Generation of Spontaneous and On-Demand Ictal Events in Mouse Brain Cortical Slices)

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

이 문서는 포유류 외피가에서 평평된 접선 섹션을 가져오고 피 질 조직화 학적인 사용 모듈과 immunohistochemical 방법을 시각화 하는 상세한 방법론을 설명 합니다.

병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

여기에서, 우리는 측방 geniculate 핵을 포함하는 급성 두뇌 조각의 준비를 위한 프로토콜 및 망막 생성 성 및 코르티코겐iculate 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사를 제시합니다. 이 프로토콜은 동일한 급성 뇌 슬라이스에서 높은 방출 및 낮은 방출 확률로 시냅스를 연구하는 효율적인 방법을 제공합니다.

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

배우세요 설치류 중간 Entorhinal 피질의 Parasagittal 조각 작성 방법을. Dorsal-ventral 축을 유지하며 patch clamp 기록으로 뉴런의 시냅스 및 통합 특성을 연구합니다. 이 기법은 항해와 기억의 세포 메커니즘 이해에 필수적입니다.

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