Name: 전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스 제작법을 통해 수평 세포와 아마크린 세포의 전기생리학적 특성을 연구하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 시각 정보 처리 메커니즘 규명에 필수적입니다.

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이 작업은 Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 및 FE464/11-1 to A.F.의 지원을 받았습니다. 저자는 Andrea Nerz의 탁월한 기술 지원에 감사를 표하고 싶습니다.

모든 절차는 독일 연방 공화국에 의해 발행 동물 실험에 대한 지침에 따라 수행 하였다. 참고 : 망막 조직이 절차의 연장 부분 중에 산소가없는 것입니다 때문에, 모든 단계가 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 마우스는 어두운 적응 해부하기 전에 적어도 3 시간을해야합니다. 망막, 준비의 빛 적응을 방지하려면 및 슬라이싱은 희미한 붉은 빛 아래에서 수행되어야한다. 미디어 및 기타 화학 물질 1. 준비 <ol><li> 에임스 &#39;중간 (6)를 준비합니다. 절개 한 후, 항상 에임스 &#39;중간에 망막 조직 몰입. <ol><li> 에임스 &#39;중간의 2.2 g과 증류수 250 ml의에서 298 mg을 HEPES를 녹여. HEPES의 농도는 5 밀리미터 될 것입니다. 모든 입자가 용해 될 때까지 부드럽게 저어. </li><li> carbogen와 실온에서 거품 에임스 &#39;중간 (95 % 산소, 5 % 차적어도 5 분 봉 이산화탄소). 솔루션에 유리 파스퇴르 피펫으로 공급 carbogen. 가스 레귤레이터의 콘센트에 적합한 튜브를 통해 파스퇴르 피펫을 연결합니다. </li><li> 이 용액에 475 mg의 나트륨 - 중탄산염을 추가합니다. 발포 후 탄산 수소 첨가는 탄산 칼슘의 침전을 방지한다. </li></ol></li><li> 낮은 겔화 온도 아가로 오스를 준비합니다. 아가로 오스는 vibratome의 절편 동안 망막 조직의 삽입이 필요합니다. <ol><li> 9 ml의 에임스 &#39;보통 180 mg의 아가로 오스와 증류수 1 ml에 용해. 모든 고체가 용해 될 때까지 천천히 아가로 오스 용액을 가열하는 전자 레인지를 사용한다. 5 열 - 10 초 단위는 오버 플로우를 방지 할 수 있습니다. 해결 방법은 명확하고 투명해야한다. </li><li> 저장소는 절차의 지속 기간 동안 37 ℃에서 수조에 용해 아가. </li></ol></li></ol> 2. Vibratome 설정 참고 : 모든 절편이 함께 수행하고있다vibratome 재료 표에 나열된. 주어진 설정은 vibratome의이 유형을 참조하십시오. 신경 조직의 vibratome 절편에 대한 자세한 내용은 7 참조 참조하시기 바랍니다가. <ol><li> 블레이드 홀더에 vibratome 인젝터 블레이드를 놓습니다. </li><li> 은 &quot;vibrocheck&quot;장치와 블레이드의 수직 편향을 측정합니다. 이 절삭면에 평행 할 때까지 블레이드를 기울 블레이드 홀더 상에 상기 조정 나사를 사용한다. 블레이드의 실제 위치는 부 표면 블라인드 효과를 방지하고 표면에 살아있는 세포를 포함하는 평면 부를 제조 할 필요가있다. </li><li> 다음 설정에 vibratome을 설정 진폭, 1.00; 속도, 0.20; 두께, 180-200 μm의. </li></ol> 마우스 망막의 3 해부 <ol><li> 밀폐 용기에 약 1 ml의 이소 플루 란의 증발에 의해 성인 C57BL / 6 마우스를 마취. 마취가 완료되면, 경부 탈구에 의해 동물을 안락사. 그만큼마우스 그렇지 않으면 조각의 품질이 저하되며, 이전 3 개월 이상이어야한다. </li><li> 눈 아래 곡선 집게를 배치하여 안구를 제거합니다. 조심스럽게 시신경을 노출 할 눈에 볼을 올려. 스프링 가위로 시신경을 잘라 2 ml의 에임스 &#39;매체를 포함하는 35mm 페트리 접시에 안구를 전송합니다. </li><li> 스테레오 현미경의 무대에 이후의 모든 단계를 수행합니다. 다음 절차 (- 3.9 3.4 단계)의 최적의 시각 제어를 할 수있는 값으로 배율을 조정합니다. </li><li> 뾰족한 집게로 공막 또는 20 G 바늘로의 전환에 각막에 구멍. 이 단계에서, 다른 집게로 눈 공을 안정. 천공 장치와 망막이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 단계 3.3에서 만든 작은 구멍에 스프링 가위를 삽입하고 각막 주위에 원을 잘라. 절단하는 동안 다시 집게로 눈 공을 안정. 다하기 위해 표면에 매우 근접하지 절개 유지망막에 유타. </li><li> 조심스럽게 집게와 각막, 렌즈 및 유리체를 제거합니다. 유리체는 눈 뒤쪽 만 얇은 투명층을 포함한다. 그러나, 유리체가 완전히 제거되었는지 절편 vibratome 필수적이다. </li><li> 페트리 접시에, 하나는 아래로 망막 위에 구멍을 통해 보이는하는 방식으로 아이 컵을 놓습니다. 개구부의 가장자리는 공막 조직으로 만 구성되어야합니다. 원형 컷 (단계 3.4)이 아이 컵의 적도에 너무 가까이 수행 한 경우, 망막 조직은 절개에 존재 가까이 될 것입니다. 단계 3.8에서 망막이 손상되지 않도록 다음주의하십시오. </li><li> 집게로 공막을 잡고 조심스럽게 따로 조직을 찢어. 이 단계에서 망막 파열되지 필수적이다. 필요한 경우 집게로 조직의 공막 부분을 흔들리지 조심스럽게 다른 집게와 망막 박리하여 오라 세라의 망막을 분리합니다. 포셉를 닫아 두십시오; 재 처리하지조직 이후 집게와 티나는 매우 부드럽고 방법 즉시 제공 할 것입니다. 주 :이 단계에서는, 망막과 세안 컵의 나머지 부분은 시신경 헤드에 연결된다. </li><li> 스프링 가위로 시신경 유두에 부착 사이트를 잘라. 망막은 이제 자유롭게 에임스 &#39;중간에 조직의 한 조각으로 떠되어야한다. </li><li> 위치로 조작하려면 집게로 가장자리를 따라 망막을 잡고 곡선 메스 블레이드를 사용하여 약 23mm의 6 작은 사각형 - 4로 망막을 잘라. 사각형 내에서 망막 조직을 곤란하게하지 마십시오. 망막이 아닌 지금까지 주변의 중앙 부분에서 조각을 가라. </li><li> 35mm의 플라스틱 페트리 접시에 대경 플라스틱 파스퇴르 피펫 망막 부분을 이동시켜 하부있는이 1mm 미만인 격자 크기의 메쉬로 대체되었다. 비커 나 삼각 플라스크의 상부 셋째 내에서 페트리 접시를 수정하고 에임스 &#39;중간 버퍼에 망막 조각 잠수함carbogen와 bbled. </li></ol> 아가로 오스의 망막 조각 4. 퍼가기 <ol><li> 에임스 &#39;매체의 일부와 함께 35mm 플라스틱 페트리 접시에 3 망막 조각 - 조심스럽게 2를 전송합니다. 전송 대경 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하는 것이 가장 편리하다. 이 단계에서 망막 부분의 정확한 방향은 중요하지 않다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫으로 나머지 에임스 &#39;매체의 가능한 한 많이 제거합니다. 즉시 유체가 제거 된 바와 같이 단계 4.3를 진행합니다. 망막 조직 건조하게하지 마십시오. </li><li> 바로 아가로 오스 용해 2 ㎖ (37 ° C)와 망막 조각을 커버한다. 단계 3.10에서 언급 한 크기 감안할 때, 조각은 아가로 오스 내에 컬하지 않을 것이다. </li><li> 액체 아가로 오스 내에서 조심스럽게 페트리 접시의 바닥에 망막 조각을 밀어 넣습니다. 신경절 세포 층이 아래로 향하게해야합니다. 정확한 위치의 판단에 대한 스테레오 현미경을 사용합니다. 측위 망막 PI 처리작은 주걱 eces. 아가로 오스 빠르게 응고하기 때문에 가능한 한 빠르고 정확한 망막을 배치합니다. <ol><li> 망막 조각이 유리 접시의 바닥에 평행하게 배열; 그렇지 않으면 섹션 접선 또는 경사 될 것입니다. 각각의 조각은 서로 접촉하지 말아야하지만, 또한 너무 멀리 떨어져이어야한다. 동일한 수평 수준에서 망막 조각이 더 많거나 적은 곳에 위치 시키십시오. </li></ol></li><li> 최소 2 분 - (6 °의 C 4) 냉장고에 내장 된 망막 조각과 유리 페트리 접시를 넣어. 이 신속하게 추가 처리를 위해 아가로 오스를 강화합니다. 즉시 아가로 오스는 중합 것처럼 다음 단계로 진행합니다. </li></ol> 망막 조각의 5 장착 <ol><li> 조심스럽게 페트리 접시에서 망막 조각을 포함하는 아가로 오스 블록을 제거합니다. 유리에서 아가로 오스 블록을 들어 올려 주걱 또는 유사한 장치를 사용하십시오. 때문에 접착 힘이 매우 어려운 것으로 판명 할 수 있습니다. 그러나, 파괴 방지아가로 오스 블록. 실온에서이 이후의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 유리 커버 슬립에 아가로 오스 블록을 놓고 메스 블레이드와 크기를 조정합니다. 망막 조각의 각 측면에 아가로 오스의 2mm - 1 둡니다. 블록의 최종 크기는 약 1,066mm이어야 (10mm 블록, 에지 길이 6mm의 높이를 말한다). </li><li> 순간 접착제를 사용하여 vibratome의 시험편 홀더에 아가 블록을 붙인다. 하부가 상기 홀더에 부착 된 상태에서 망막 부분은, 그 표면에 상기 10mm 높은 블록의 위쪽 및 배향과 평행에 위치한다. </li><li> vibratome의 버퍼 트레이에 이전에 버블 에임스 &#39;매체를 부어 바로 블록을 커버. </li></ol> 수평 Vibratome 섹션 6. 준비 <ol><li> 절편 시작합니다. 망막 조직의 조각이 조각에 나타날 때까지 처음에 수동으로 슬라이스의 두께를 설정합니다. 다음 단계 2.3의 설정을 변경할 수 있습니다. 이후아가로 오스 블록 당 3 조각 - 마우스 망막은 더 이상 2보다가있을 것입니다, 약 200 μm의 두께이다. </li><li> 유리 막대와 버퍼 트레이에서 섹션을 제거하고 35mm 페트리 접시에 2 ml의 에임스 &#39;매체로 전송. </li><li> 바로 37 °의 C (5 % CO 55분의 2 %의 O 2)에서 인큐베이터에 보관 섹션. 섹션을 둘러싸는 아가 인큐베이터 고체 유지되고 망막을 손상시키지 않고 부분을 처리하기 위해 사용될 수있다. RT에서 산소 에임스 중형에 비해 각각의 분위기 내에서 37 ℃에서 보관시 더 슬라이스 품질이 얻어진다. 섹션 바로 사용하거나 우수한 생리 결과 인큐베이터에서 4 시간까지 저장 될 수있다. </li><li> 6 - 아가 로스를 반복 섹션 4에서 다음 망막 조각을 포함. </li></ol>

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</ol>

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세로 슬라이스와 달리 수평 무 축삭 세포 및 세포 등을 방사상 배향 뉴런의 수지상 형태가 잘 유지된다. 전체 망막 제제에 비해, 이들 세포 유형은 마이크로 전극에 대한 접근이 용이하고 전기 생리 두 이미징 기술에 의해 조사 할 수있다. 여기서는 외부 망막 집중; 그러나, 유사한 접근 방식은 특히 내부 망막 (10)의 무 축삭 세포가보고되고있다. 수평 슬라이스 준비의 특성은 기능 연구를위한 몇 가지 의미를 내포하고있다. 콘 감광체와 시냅스 사이의 수평 세포 시냅스 접촉의 수는 그대로 망막 거의 구별 할 수 있었다. 시냅스 접촉은 어둠 속에서 신경 전달 물질의 토닉 방출을 보여주는 기능이었다. 시냅스는 빛 / 어둠 전환 등 중 내인성 자극에 의해 또는 외부 바이폴라 자극에 의해 활성화 될 수있다. <p cl엉덩이 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 기술의 하나의 중요한 단계는 조직을 손상시키지 않고 가능한 한...

시각 정보는 시각 활성화 동적 시공간 패턴으로 부호화되고, 감광체와 2 차 뉴런 사이의 시냅스 리본 시각 정보의 다운 스트림 전송을 결정한다. 포유류 망막의 수직 슬라이스 제조 즉 감광체 바이폴라 셀 사이, 및 바이폴라 전지 및 무 축삭 세포 1, 2, 3, 4의 일부 유형 사이에서 수직 통로에 신호 처리를 연구하는 매우 유용한 도구이다. 그러나, 수직 절편은 항상 시냅스 접촉의 상당한 손실로 이어지는, 많은 망막 신경 세포의 수지상 필드의 심각한 절단됩니다. 특히 외부 망막에, 수평 세포는 그들의 옆으로 퍼져 확장 된 수지상 필드와 축삭 터미널 시스템 (5)에 영향을 받는다. 수직에서슬라이스 제조 수평 셀의 돌기에 콘 감광체 단자 수백 시냅스 입력 따라서 약간 부족한 접촉 감소된다. 이것은 개별 시냅스의 특성을 연구하기에 충분할 수 있지만, 어떠한 수단은 감광체 리본 시냅스 동기 작동의 기초가되는 신호 처리 기능을 나타내는 않음으로써는 않는다. 따라서 우리는 그대로하고 기능적인 수평 세포의 수상 돌기에 거의 모든 콘 광 수용체의 시냅스 입력 잎 수평 슬라이스 준비를 개발했다. 절편 런 평면은 수평 적으로 무 축삭 세포와 세포 사이의 내부 핵 층을 절단하는 망막의 표면에 평행. 따라서, 외부 망막의 수평 슬라이스가 포함 생성, 시냅스 사이트, 시냅스 사이트의 내부 및 외부 세그먼트뿐만 아니라 시냅스 터미널, 수평 세포와 쌍극 세포 광 수용체. 이 준비는 잘 t을 적합오의 수지상 필드 내의 모든 콘 광 수용체에 의해 수평 세포의 수상 돌기에 통합 된 시냅스 입력을 조사합니다. 따라서 그것은 더 시냅스 반응에 감광체 활성화 매트릭스로부터 시각 정보 전송을위한 중요 감광체 리본 시냅스의 동작을 이해하는 데 유용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Ames' Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish (plastic)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri 접시</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dispensary 대학 병원</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome 인젝터 블레이드</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20G 바늘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>봄 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>곡선 메스 블레이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 파스퇴르 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

세로 슬라이스 제제 아니라 성인 포유류 망막 회로 및 신호 전달을 연구하기 위해 설립된다. 이 제제에서 절편의 비행기는 광 수용체 및 양극성 세포와 같은 방사상 중심의 신경 세포의 연구에 이상적, 망막 표면에 수직이다. 그러나, 수평 세포, 넓은 필드 무 축삭 세포 및 신경절 세포의 큰 수지상 아버 이들 세포에서 현저하게 감소 시냅스 활성을두고 주로 절단된다. 신경절 세포 변위 무 축삭 세포는 망막의 전체 실장 준비 연구 될 수있는 반면, 수평 세포 및 내부 핵 층에있는 무 축삭 세포는 잘못 전체 망막 조직에 전극 용 접근 가능하다. 최대 접근성 시냅스 무결성을 달성하기 위해 마우스 망막의 수평 조각 제제를 개발 및 감광체 및 수평의 시냅스에서 신호 전송 공부세포. 수평 절편 수평 세포의 수상 돌기에 손상 및 기능 콘 시냅스 입력을위한 전제 조건으로, 전극 타겟팅 수평 세포 기관 (1) 간단하고 명확한 시각적 식별 및 확장 된 수평 세포 수지상 필드 (2) 보존 할 수 있습니다. 수평 조각에서 수평 세포는 어둠 속에서 토닉 시냅스 활성을 나타내, 그들은 안쪽으로 전류 감소 시냅스 활동의 감소와 빛의 섬광을 브리핑하는 반응. 면역 세포 화학 증거는 수평 세포의 수지상 분야 내에서 거의 모든 콘이 그 주변 수상 돌기과 시냅스를 설정을 나타냅니다. 수평 슬라이스 준비 따라서 잘 선택 시냅스에 걸쳐 수평으로 확장 망막 신경 세포의 생리 학적 특성뿐만 아니라 감각 신호 전송 및 통합을 연구하기에 적합합니다.

<html> 마우스 망막의 수평 슬라이스에서, 수평 세포 기관을 쉽게 다각형 세포체 (그림 1A)에서 나오는 여러 주요 수상 돌기과의 독특한 형태에 따라 식별 할 수 있습니다. 슬라이스의 표면 근처에있는 수평 세포 기관은 패치 클램프 전극 용 일상적으로 접근 할 수 있었다. 녹음하는 동안 세포는 밀접 그대로 마우스 망막 8 (그림 1B)의 축삭 베어링 수평 세포의 형태를 닮은 자신의 복잡한 수지상 arborization을 공개, 형광 염료로 가득 차 있었다. 형광 결합 땅콩 응집소와 콘 척추 경의 레이블은 콘 척추 경 및 수평 세포 수상 돌기 (그림 1C) 사이에 밀접한 공간 관계를 보여 주었다. 몇 가지 예외를 제외하고, 수평 세포의 수지상 필드 내의 모든 콘 척추 경는 수지상 프로세스 연락을했다. 천만에 &quot;FO : 유지...

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

마우스 망막의 수평 절편 제작의 전반적인 목표는 수평 방향으로 배열된 뉴런의 형태학적 및 생리학적 무결성을 유지하여 망막 시냅스 회로에서의 기능적 역할을 연구하는 것입니다. 이 방법은 감각 신호가 망막의 리본 시냅스(ribbon synapse)에서 어떻게 부호화되고 통합되는지와 같은 시각 정보 처리 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수평 세포(horizontal cells) 및 아마크린 세포(amacrine cells)와 같은 수평 방향의 중간 뉴런들이 기능적으로 온전하게 유지되며 전자 기록(electronic recording)이 가능하다는 점입니다.본 절차의 시연은 제 실험실의 기술자인 Andrea Nerz가 맡아 진행하겠습니다. 먼저, 곡선 핀셋을 안구 아래에 배치하여 안구를 적출합니다. 안구를 부드럽게 들어 올려 시신경을 노출시킨 후, 스프링 가위로 이를 절단합니다.그 다음, 안구를 2 mL의 AMS 배지가 들어 있는 35 mm 페트리 접시에 옮깁니다. 실체 현미경 하에서 최적의 시각적 제어가 가능한 배율로 조정합니다. 다음으로, 핀셋으로 안구를 고정하고 다른 뾰족한 핀셋이나 20 gauge 바늘을 사용하여 공막과의 경계 부위에서 각막을 천공합니다.각막을 천공할 때 망막이 손상되지 않도록 주의하십시오. 그 다음, 작은 구멍으로 스프링 가위를 삽입합니다. 각막 주변을 원형으로 절개하는 동안 핀셋으로 안구를 고정하고, 망막이 잘리지 않도록 절개선을 표면에 매우 가깝게 유지하십시오.각막 렌즈와 유리체를 조심스럽게 제거하십시오. 유리체는 안구 뒷부분의 얇고 투명한 층으로만 구성되어 있습니다. 하지만 바이브라톰(vibratome) 절편 제작을 위해서는 유리체가 완전히 제거되는 것이 필수적입니다.페트리 접시에서 안구 컵을 배치하여 망막까지 이어지는 깨끗한 구멍이 보이게 합니다. 개구부의 가장자리는 공막 조직으로만 구성되어야 합니다. 다음으로, 핀셋으로 공막을 잡고 조직을 조심스럽게 찢어냅니다.이 단계에서 망막이 파열되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이 단계에서는 망막과 나머지 안구 컵이 시신경 유두 부분에서만 연결되어 있어야 합니다. 스프링 가위로 시신경 유두의 부착 지점을 절단하십시오.이제 망막은 AMS 배지 내에서 하나의 조직 조각으로 자유롭게 떠 있어야 합니다. 다음으로, 직경이 큰 파스퇴르 피펫을 사용하여 망막을 커버 슬립으로 옮긴 후, 곡선형 메스 날을 사용하여 망막을 약 2x3 mm² 크기의 작은 직사각형 4~6개로 절단합니다. 이때 직사각형 모양의 망막 조직이 집히지 않도록 주의하십시오.이 절차에서는, 직경이 큰 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 망막 조각 2~3개를 약간의 AMS 배지와 함께 유리 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 유리 파스퇴르 피펫으로 남은 AMS 배지를 최대한 제거합니다. 그런 다음 즉시 망막 조각들을 37 °C로 녹인 아가로스 2 mL로 덮습니다.망막 조각들을 페트리 접시 바닥으로 조심스럽게 밀어 넣으십시오. 아가로스가 빠르게 응고되므로, 신경절 세포층이 아래를 향하도록 최대한 빠르고 정확하게 배치하십시오. 동시에 망막 단면이 접선 방향이나 사선으로 놓이지 않도록 유리 접시 바닥과 평행하게 정렬하십시오.그 후, 추가 처리를 하기 전 아가로스를 경화시키기 위해 망막 조각이 포함된 블록을 냉장고로 옮깁니다. 이제 망막 조각이 들어 있는 아가로스 블록을 페트리 접시에서 조심스럽게 분리합니다. 메스 날을 사용하여 유리에서 아가로스 블록을 조심스럽게 들어 올립니다.그 후, 아가로스 블록을 유리 커버슬립 위에 놓습니다. 메스 날을 사용하여 크기를 조절하고 망막 조각의 각 측면에 1~2mm의 아가로스를 남겨둡니다. 다음으로, 순간접착제를 사용하여 아가로스 블록을 바이브라톰 시료 고정 장치에 접착합니다.이전에 기포를 제거한 AMS 배지를 바이브라톰(vibratome)의 버퍼 트레이에 부어 블록을 즉시 덮어줍니다. 이 그림에서는 슬라이스 표면 근처에 위치한 수평 세포가 도트 대비 광학 장치로 시각화되었습니다. 이 이미지는 패치 전극이 여전히 부착된 상태에서 Oregon Green 488 BAPTA-1로 채워진 수평 세포를 보여줍니다.여기에는 염색액이 주입된 수평 세포와 fluorescein coupled peanut agglutinin으로 표지된 원추세포 종말단 배열의 중첩 영상이 나타나 있으며, 이를 통해 추정되는 시냅스 접촉 부위를 확인할 수 있습니다. 이 그림에서 -60 mV의 유지 전위에서의 전세포 전압 클램프 기록은 고주파의 긴장성 시냅스 활성을 보여줍니다. 더 높은 시간 분해능에서 시냅스 이벤트는 단상 파형 또는 더 복잡한 전류 궤적을 나타냅니다.이 그림에서는 빛 자극에 대한 수평 세포의 전류 반응이 나타나 있습니다. 빛은 이온 채널의 폐쇄와 시냅스 활동의 차단을 유도합니다. 그리고 이 그림에서는 세포 외 전극을 사용하여 원추 광수용체를 전기적으로 자극하였습니다.시냅스 후 흥분성 전류는 자극 강도에 따라 단계적으로 변화합니다. 이 절차를 숙달하면 적절히 수행했을 때 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 망막 네트워크에서의 시각 정보 처리와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 칼슘 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 수평으로 확장된 세포 유형으로의 기능적 시냅스 입력이 유지된 포유류 망막의 수평 절편을 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

전통적으로 수직 슬라이스와 망막의 전체 마운트 준비는 망막 회로의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 여기, 우리는 망막 손상 뉴런의 돌기 형태를 보존하는 방법을 깔끔히 소설을 설명합니다.

망막의 수평 슬라이스 준비

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

이 비디오는 플랫 마운트 마우스 망막에서 전기 생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 기술을 보여줍니다. 전극이 있는 얇은 유리 피펫을 사용하여 망막 내의 별방울 무축삭 세포(SAC)에 접근합니다. 씰을 형성한 후 흡입이 가해져 멤브레인을 파열하고 전체 세포 패치 클램프 구성을 형성합니다. 마지막으로, SAC 시냅스 수용체를 통한 이온의 흐름은 구성을 사용하여 측정됩니다.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 망막 생성 및 피질 생성 시냅스의 전기 생리학적 기록을 설명합니다. dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN)를 포함하는 절편은 기록 챔버에 배치됩니다. 자극 피펫은 망막 신경절 세포(RGC)를 자극하고 망막 자극 시냅스를 조사하기 위해 시신경관에 배치되거나 피질 뉴런을 자극하고 피질 생성 시냅스를 조사하기 위해 망상 시상핵(nucleus reticularis thalami)에 배치됩니다. 자극을 받으면 망막 신경세포와 피질 뉴런은 흥분성 신경전달물질을 방출하여 LGN 중계 뉴런에서 시냅스 전류를 생성합니다. 이러한 전류는 패치 클램프 기록 피펫을 사용하여 기록됩니다.

쥐 뇌 절편에서 Retinogeniculate 및 Corticogeniculate 시냅스에 대한 전기생리학적 연구

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).   이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

우리는 쥐의 눈에서 망막 절편을 준비하고 망막 뉴런의 빛 반응을 기록하는 방법을 보여줄 것입니다. 전체 절차는 어두운 환경에서 수행됩니다.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

우리는 마우스 망막의 생체 외 슬라이스 준비를 사용하여 콘 광 수용체의 축삭 터미널에서 칼슘 역학을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 중요한 포유 동물 모델 시스템에서 콘 칼슘 신호의 포괄적 인 연구, 마우스를 할 수 있습니다.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

8 시간 - 몸에서 제거되면, 신경 조직은 크게 6 후 조직의 궁극적 인 저하로 이어지는, 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 밀접하게 모니터링하고, 조직의 세포 외 환경을 조절하는 독특한 배양 방법을 사용하여 조직 생존을 현저&gt; 24 시간 동안 연장 될 수있다.

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

이 연구는 광수용체 세포체를 제거함으로써 면역조직화학, in situ hybridization 및 전기생리학 실험을 위해 더 빠른 항체 확산과 내부 망막 뉴런에 대한 패치 피펫 접근을 개선할 수 있는 대체 편평 장착 망막 제제를 제시합니다.

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

배우세요 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스 제작법을 통해 수평 세포와 아마크린 세포의 전기생리학적 특성을 연구하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 시각 정보 처리 메커니즘 규명에 필수적입니다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

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