전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

쥐 망막의 이 수평 슬라이스 준비의 전반적인 목표는 망막의 시냅스 회로에서 기능적 역할을 연구하기 위해 수평 지향적인 뉴런의 형태학적, 생리학적 무결성을 보존하는 것입니다. 이 방법은 감각 신호가 반복되는 망막의 리본 시냅스에 어떻게 인코딩되고 통합되는지와 같은 시각 정보 처리 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수평 세포 및 무축삭 세포와 같은 수평 방향의 인터뉴런이 기능적으로 손상되지 않고 전자 기록에 액세스할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Andrea Nerz입니다. 이 절차를 시작하려면 눈 아래에 한 쌍의 구부러진 집게를 놓아 안구를 제거합니다. 안구를 부드럽게 들어 올려 시신경을 드러내고 스프링 가위로 자릅니다.

그런 다음 안구를 2밀리리터의 AMS 배지가 들어 있는 35mm 페트리 접시로 옮깁니다. 실체 현미경 아래에서 최적의 시각적 제어가 가능한 값으로 배율을 조정합니다. 다음으로, 한 쌍의 집게로 안구를 고정하고 공막으로 전환되는 과정에서 다른 뾰족한 집게 또는 20게이지 바늘로 각막을 뚫습니다.

각막에 구멍을 뚫는 동안 망막이 손상되지 않도록 주의하세요. 그런 다음 작은 구멍에 스프링 가위를 삽입하십시오. 각막 주위를 원을 그리며 자르면서 집게로 안구를 고정하고 망막이 절단되지 않도록 절개 부위를 표면에 매우 가깝게 유지합니다.

각막수정체와 유리체를 조심스럽게 제거합니다. 유리체는 눈 뒤쪽에 얇고 투명한 층으로만 구성되어 있습니다. 그러나 비브라톰 절편을 위해 유리체를 완전히 제거하는 것이 필수적입니다.

페트리 접시에서 아이컵을 망막까지 투명한 구멍이 보이도록 놓습니다. 개구부의 가장자리는 공막 조직으로만 구성되어야 합니다. 그런 다음 집게로 공막을 잡고 조직을 조심스럽게 찢습니다.

이 단계에서 망막이 파열되지 않는 것이 중요합니다. 이 단계에서 망막과 눈컵의 나머지 부분은 시신경 머리에만 연결되어야 합니다. 시신경두의 부착 지점을 용수철 가위로 자릅니다.

이제 망막은 AMS 배지에서 단일 조직 조각으로 자유롭게 떠다닐 수 있습니다. 다음으로, 망막을 큰 직경의 파스퇴르 피펫으로 커버 슬립으로 옮기고 구부러진 메스 날을 사용하여 망막을 약 2x3 평방 밀리미터의 4-6 개의 작은 직사각형으로 자릅니다. 직사각형 내의 망막 조직을 꼬집지 마십시오.

이 절차에서 2-3 개의 망막 조각을 직경이 큰 플라스틱 파스퇴르 피펫이있는 AMS 매체 중 일부와 함께 유리 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 유리 파스퇴르 피펫으로 남아 있는 AMS 매체를 최대한 많이 제거합니다. 그런 다음 즉시 섭씨 37도의 용존 아가로스 2밀리리터로 망막 조각을 덮습니다.

망막 조각을 페트리 접시 바닥으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 신경절 세포층이 아래를 향하도록 배치하는 것은 아가로스가 빠르게 응고되기 때문에 가능한 한 빠르고 정확하게 위치시킵니다. 동시에 망막 조각이 유리 접시의 바닥과 평행이 되도록 배열하여 섹션이 접선 또는 비스듬해지지 않도록 합니다.

그 후, 내장된 망막 조각을 냉장고로 옮겨 추가 처리 전에 아가로스를 굳히십시오. 이제 페트리 접시에서 망막 조각이 들어있는 아가로스 블록을 조심스럽게 분리합니다. 메스 날을 사용하여 유리에서 아가로스 블록을 조심스럽게 들어 올립니다.

그런 다음 아가로스 블록을 유리 커버 슬립에 놓습니다. 메스 날로 크기를 조정하고 망막 조각의 양쪽에 1-2mm의 아가로스를 남겨 둡니다. 다음으로, 순간 접착제를 사용하여 잡고 있는 비브라톰 표본에 아가로스 블록을 붙입니다.

이전에 버블링된 AMS 매체를 비브라톰의 버퍼 트레이에 부어 블록을 즉시 덮습니다. 이 그림에서는 슬라이스 표면 근처에 위치한 수평 셀이 도트 대비 광학 장치로 시각화되었습니다. 이 이미지는 여전히 셀에 부착된 패치 전극을 통해 Oregon Green 488 BAPTA-1로 채워진 수평 셀을 보여줍니다.

여기에 표시된 것은 염료가 주입된 수평 세포의 오버레이와 플루이진 결합 땅콩 응집소로 표시된 원뿔 꽃자루의 배열이며, 이는 추정 시냅스 접촉을 나타냅니다. 이 그림에서 -60 밀리 볼트의 유지 전위에서 기록하는 전체 셀 전압 클램프는 고주파 강장 시냅스 활성을 보여줍니다. 더 높은 시간 해상도에서 시냅스 이벤트는 단상 파형 또는 더 복잡한 전류 궤적을 표시합니다.

이 그림에서는 광 자극에 대한 수평 셀의 전류 반응을 보여줍니다. 빛은 이온 채널의 폐쇄와 시냅스 활동의 차단을 유도합니다. 그리고 이 그림에서 원뿔 광 수용체는 세포 외 전극으로 전기적으로 자극되었습니다.

시냅스 후 흥분 전류는 자극 강도로 등급이 매겨집니다. 일단 숙달되면 이 절차를 제대로 수행하면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 칼슘 이미징과 같은 다른 방법을 수행하여 망막 네트워크의 시각 정보 처리와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 기능적 시냅스 입력이 있는 포유류 망막의 수평 절편을 수평으로 확장된 세포 유형에 맞게 절단하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.