단백질 접기 유학을위한 Microfluidic 믹서

이 실험 절차의 전반적인 목표는 두 용액을 빠르게 혼합하여 마이크로초 시간 단위에서 생화학 반응을 시작하는 것입니다. 이는 먼저 미세유체 믹서를 제작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 칩을 커버 글라스에 접합하여 채널을 밀봉하는 것입니다.

다음으로, 칩을 용액 저장조가 포함된 매니폴드에 장착합니다. 마지막 단계는 공초점 형광 현미경을 사용하여 혼합 용액을 이미징하는 것입니다. 최종적으로, 출구 채널을 따른 거리를 시간으로 변환함으로써 생화학 반응을 마이크로초 시간 단위로 포착합니다.

정지 흐름 혼합(stop flow mixing)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 혼합이 난류에 의해 제한되지 않고 수 마이크로초 내에 일어난다는 점입니다. 이 방법은 소수성 붕괴(hydrophobic collapse)가 언제 발생하는가와 같은 단백질 접힘 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 미세유체 혼합 칩의 제작을 시작하기 위해, 본 실험실의 박사후 연구원인 Ling Woo가 해당 절차를 시연하겠습니다.

먼저 이 비디오에 제공된 서면 프로토콜에 설명된 대로 신선한 piranha solution을 사용하여 4인치 FU silica wafers를 세척하십시오. 다음으로, 저압 화학 기상 증착(low pressure chemical vapor deposition)로를 사용하여 최종 미세유체 채널의 예상 깊이 10 µm당 약 1 µm 두께의 polysilicon 코팅을 적용하십시오. 텍스트에 설명된 대로 웨이퍼를 추가 처리한 후, 900 nm 두께의 Z 52 14 photo Resist 층을 웨이퍼에 스핀 코팅하고, 핫플레이트 위에서 90 °C로 1분간 또는 오븐에서 110 °C로 30분간 소프트 베이크 하십시오.

포토마스크를 정렬한 후, 먼저 포토레지스트를 UV 광원에 수 초 동안 노출시켜 하드 및 진공 접촉을 형성합니다. 그 다음 서면 프로토콜에 명시된 대로 포토레지스트의 패턴을 현상합니다. 현미경으로 웨이퍼 상의 피처를 검사하고, 핫플레이트 위에서 115 °C로 2분 동안 하드 베이크합니다.

다음으로, Asher 또는 산소 플라스마를 사용하여 100 W의 RF 출력으로 2.5분 동안 웨이퍼를 DCU 처리합니다. 심해 반응성 이온 식각기(deep reactive ion etcher)를 사용하여 폴리 실리카 층을 아래의 용융 실리카까지 완전히 식각합니다. 남은 포토레지스트를 제거하고 본문에 안내된 대로 웨이퍼를 처리합니다.

에칭 깊이를 측정하여 폴리 코팅이 완전히 관통되었는지 확인합니다. 산화물 식각이 가능한 심해 반응성 이온 식각기(deep reactive ion etcher)를 사용하여, 폴리 코팅 두께 1 µm당 약 10 µm 깊이로 용융 실리카를 식각합니다. 매트릭스 애셔(matrix Asher)를 이용해 100 W의 RF 전력으로 4분 동안 웨이퍼를 세정하고, 제논 디플루오라이드(xenon di fluoride) 식각기로 폴리실리콘을 제거합니다. 웨이퍼에 구멍을 뚫기 전, 이후 공정 중에 채널을 보호하기 위해 1 µm 두께의 포토레지스트 층을 새로 스핀 코팅합니다.

그런 다음 Aqua Bond 55를 사용하여 웨이퍼의 특징면이 아래로 향하게 희생 유리판 위에 부착합니다. 본딩 시 기포가 생기지 않도록 주의하며, micro 90 세척액과 컴퓨터 제어 다이아몬드 팁 드릴을 사용하여 냉각합니다. 이렇게 하면 작은 유리 파편이 채널에 달라붙어 사용 중 칩이 막히는 것을 방지할 수 있습니다.

각 칩에 진입공과 진출공을 천공하십시오. 주사기를 사용하여 각 구멍에 물을 주입함으로써 웨이퍼를 탈이온수로 헹굽니다. 그 후, 포토레지스트를 제거하고 비눗물에 한 시간 동안 담가두십시오.

본문에 설명된 대로 레지스트와 본더를 처리합니다. 웨이퍼를 탈이온수와 따뜻한 비눗물로 헹굽니다. 웨이퍼 위에 질소를 흘려준 후, 식각된 패턴 부위가 닿지 않도록 주의하며 시린지로 각 구멍을 다시 한번 헹굽니다.

120°C로 설정된 진공 오븐에서 계속 건조하십시오. 구멍에 이물질이 없는지 확인하고, 필요한 경우 세척 단계를 반복하십시오. 다음 단계들은 클린룸에서 수행해야 합니다.

광학 또는 기계식 표면 프로파일러를 사용하여 채널의 깊이를 측정하십시오. 클린룸에서 본문에 설명된 대로 웨이퍼와 융융 실리카 커버 글라스를 세척하십시오. 질소 가스를 사용하여 웨이퍼를 최소 5분 동안 충분히 건조하십시오.

그 다음, 작은 유리판과 같이 딱딱하고 평평한 표면 위에 클린룸 와이퍼를 3~4장 쌓고, 그 위에 웨이퍼의 패턴 면이 위로 향하도록 놓습니다. 커버 글라스에 대해서도 동일하게 반복합니다. 커버 글라스의 가장자리를 잡아, 연마된 면이 웨이퍼 위로 향하도록 뒤집어서 덮습니다.

평평한 가장자리를 조심스럽게 맞춘 다음, 웨이퍼 위에 커버 글라스를 떨어뜨려 안착시킵니다. 정렬을 조정하려면 수평으로만 살짝 밀어줍니다. 웨이퍼 중앙을 손가락 하나로 누릅니다. 본딩 전선이 바깥쪽으로 퍼져 나가기 시작하는 것을 확인할 수 있습니다.

필요한 경우, 본딩 전선을 전진시키기 위해 웨이퍼 주변의 다른 위치에 추가적인 압력을 가합니다. 밀봉된 웨이퍼를 본문에 기재된 온도 프로파일로 설정된 고온 오븐에 넣은 후, 웨이퍼 다이싱 쏘(wafer dicing saw)를 사용하여 웨이퍼를 개별 칩으로 다이싱합니다. 믹싱 칩과 용액을 고정하는 매니폴드는 lexan 또는 plexiglass와 같은 플라스틱이나 알루미늄으로 제작할 수 있습니다.

온도 제어를 위해, 작은 o-링을 사용하여 칩을 매니폴드에 결합하고, 칩 중앙의 광학적 관찰이 가능하도록 리테이닝 링으로 고정합니다. 칩에 과도한 압력이 가해지지 않으면서도 밀착이 잘 이루어지도록 O-링 홈은 표준보다 얕게 설계해야 합니다. 칩이 장착되면 중앙 및 측면 저장조에 용액을 추가하되, 웰 바닥에 갇힌 기포를 모두 제거하는 데 주의하십시오.

매니폴드를 도립 현미경 위에 놓고 접안렌즈 또는 카메라 출력을 통해 혼합 영역을 관찰합니다. 매니폴드 상단에 백열 손전등을 배치하면 충분한 조명이 제공됩니다. 제트를 관찰하려면 중앙 채널에 염료 또는 굴절률이 높은 용액을 사용하십시오.

이 믹서에서 사용하는 부피가 매우 작기 때문에, 용액 웰 상단에 공기압을 가하여 흐름을 제어할 수 있습니다. 제트를 시각화하려면 사이드 채널 압력을 0 psi에서 시작하여 센터 채널과 동일한 압력이 될 때까지 천천히 높이십시오. 만약 한쪽 사이드 채널이 막혔다면, 제트가 출구 채널의 벽면 중 한 곳으로 밀려나게 됩니다.

눈에 보이는 막힘 현상이 나타나면, 주사기로 배출 채널에 압력이나 진공을 가하여 이를 제거할 수 있습니다. 단백질이나 기타 유기물로 인해 칩이 막힌 경우, piranha solution에 하룻밤 동안 담가 세척할 수 있습니다. 다이크로익 미러(dichroic mirror)를 현미경 내부 또는 바로 외부에 설치하여 코팅된 레이저 빔을 연구용 현미경으로 유도하십시오.

접안렌즈나 카메라를 통해 혼합 영역 근처에서 초점이 보일 수 있도록 레이저를 정렬하십시오. 믹서 내 단백질에서 발생하는 형광은 대물렌즈에 의해 수집되어 다이크로익 미러를 통과하고, 렌즈에 의해 핀홀로 초점이 맞춰진 후 광자 계수기에 영상으로 나타납니다. 압전 스캐너를 사용하여 x 및 y축으로 칩을 스캔함으로써 혼합 영역을 이미지화하십시오.

제트의 특정 위치를 선택하고 X 및 Y 방향으로 스캔하여 채널 중심의 수직 초점을 찾습니다. 현미경의 피사체 심도는 채널 깊이보다 훨씬 짧으며, 유속은 벽면에서 1 micron 이내의 영역을 제외하고 채널 내에서 균일합니다. 따라서 관찰되는 형광의 시간 분해능은 주로 공초점 스폿(confocal spot)의 크기에 의해 결정됩니다.

분사 방향을 따라 출구 채널 내에서 100 micron 간격으로 수평 스캔하며, 각 위치당 약 1 millisecond 동안 관찰하십시오. 이후 시간을 캡처하려면 현미경 스테이지를 분사 방향으로 80 to 90 microns 이동시키십시오. 또는, 렌즈를 사용하여 빛을 입구 슬릿에 집중시킴으로써 다이크로익 거울 이후의 분광기와 CCD로 빛을 검출할 수 있습니다.

데이터 수집 속도가 광자 계수기보다 느리기 때문에, 일반적으로 광자 계수기로 제트의 이미지를 먼저 촬영한 다음 분광기로 제트를 따라 각 지점을 측정합니다. 광자 계수기 데이터는 각 위치에서 제트 주변의 픽셀 3~5개를 합산하여 거리 대비 강도 그래프를 생성함으로써 분석합니다. 시간은 인가된 압력을 바탕으로 계산된 속도를 이용하여 거리로부터 산출합니다.

마지막 단계로, 텍스트에 설명된 방법 중 하나를 사용하여 분광계의 데이터를 분석합니다. 여기에는 광자 계수기로 측정한 혼합 영역의 강도 등고선 플롯이 표시되어 있습니다. 제트 외부의 출구 채널 배경값은 검출기의 노이즈 플로어에 가까워야 하며, 일반적으로 차감하지 않습니다.

백그라운드가 높게 나타나는 것은 정렬 상태가 불량하거나 단백질이 채널 벽면에 부착되었음을 나타낼 수 있습니다. 반대로, 특히 혼합 영역 근처에서 제트가 꺾이거나 휘어 보인다면 노즐의 식각 상태가 불량함을 의미합니다. Alexa 488 및 Alexa 647로 표지된 protein ACell coenzyme a binding protein 또는 A CBP의 시간 분해 스펙트럼이 제시되어 있습니다.

초록색과 빨간색 직사각형은 각각 공여체(donor) 및 수용체(acceptor) 채널로 지정된 파장을 나타냅니다. 이 데이터는 암전하(dark charge)와 레이저 신호를 제거하기 위해 배경 감산 처리되었습니다. 배경 신호는 0 psi와 같은 중심 채널 압력 조건에서 측정되었습니다.

혼합 시간은 요오드화 칼륨에 의한 트립토판 형광 소광과 같이 혼합보다 훨씬 빠른 급속 반응을 측정함으로써 측정할 수 있습니다. 제트의 크기가 현미경의 광학 해상도보다 작기 때문에, 혼합 영역에서 강도가 크게 감소합니다. 제트가 형성됨에 따라, 용액 조건에 변화를 주지 않은 대조군 측정을 수행함으로써 이러한 기기 응답을 제거할 수 있습니다.

이 그림은 N-Acetyl tryptophan amide 형광의 혼합 및 비혼합 실험 비율을 보여줍니다. 선은 COMSOL Multiphysics 모델링 및 시뮬레이션을 통해 예측된 요오드화 칼륨의 농도를 나타냅니다. 농도가 80% 감소하는 데 걸리는 시간으로 측정된 혼합 시간은 8 µs입니다.

이 그래프는 변성제 농도를 6 M에서 0.06 M로 희석한 후 단백질 A CBP의 FRET 변화를 보여줍니다. 이 데이터는 대조군 실험이 필요하지 않습니다. FRET은 이미 비율 값이며 기기 응답이 제거된 상태이므로, T=0 부근의 급격한 도약은 혼합 시간 내에서 발생하는 FRET 신호의 빠른 변화를 나타냅니다.

이러한 발전 이후, 이 기술은 단백질 접힘 분야의 연구자들이 단백질 구조 형성의 초기 단계를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.