단백질 접기 유학을위한 Microfluidic 믹서

이 절차의 전반적인 목표는 두 가지 용액을 빠르게 혼합하여 마이크로초 시간 척도에서 생화학 반응을 시작하는 것입니다. 이것은 먼저 미세유체 혼합기를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 칩을 커버 유리에 접착하여 채널을 밀봉하는 것입니다.

다음으로, 칩은 용액 저장소(solution reservoirs)를 포함하는 매니폴드(manifold)에 장착된다. 마지막 단계는 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 혼합 용액을 이미지화하는 것입니다. 궁극적으로, 생화학 반응은 출구 채널을 따라 거리를 시간으로 변환하여 마이크로초 시간 척도에 포착됩니다.

흐름 혼합 중지와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 혼합이 난류에 의해 제한되지 않고 몇 마이크로초 내에 발생한다는 것입니다. 이 방법은 단백질 접힘 분야의 주요 질문, 예를 들어 소수성 붕괴는 언제 발생합니까? 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사후 연구원인 ling woo가 미세유체 혼합 칩 제조를 시작할 것입니다.

먼저 이 비디오와 함께 제공되는 서면 프로토콜에 설명된 대로 새로운 피라냐 용액으로 4인치 FU 실리카 웨이퍼를 청소합니다. 다음으로, 저압 화학 기상 증착로를 사용하여 최종 미세유체 채널의 의도된 10미크론 깊이당 약 1미크론 두께의 폴리실리콘 코팅을 적용합니다. 텍스트에 설명 된대로 웨이퍼를 추가 처리 한 후 웨이퍼를 900 나노 미터 두께의 Z 52 14 포토 레지스트 층으로 스핀 코팅 한 다음 섭씨 90도에서 핫 플레이트에서 1 분 동안 직접 또는 섭씨 110도의 오븐에서 30 분 동안 소프트 베이킹합니다.

포토 마스크를 정렬한 후 먼저 포토 레지스트를 UV 광선에 몇 초 동안 노출시켜 단단하고 진공 접촉을 합니다. 그런 다음 서면 프로토콜에 나열된 대로 포토 레지스트의 패턴을 개발합니다. 현미경으로 웨이퍼의 특징을 검사하고 섭씨 115도에서 핫 플레이트에서 2분 동안 직접 하드 베이크합니다.

다음으로, 100와트 RF 전력에서 2.5분 동안 Asher 또는 산소 플라즈마로 웨이퍼를 DCU합니다. 심층 반응성 이온 에칭을 사용하여 폴리 실리카 층을 아래의 융합 실리카까지 완전히 에칭합니다. 나머지 사진을 벗겨내고 저항하고 텍스트의 지시에 따라 웨이퍼를 처리합니다.

에칭 깊이를 측정하여 폴리 코팅을 끝까지 통과하는지 확인합니다. 산화물이 가능한 심층 반응성 이온 에칭을 사용하여 폴리 코팅의 미크론 두께당 약 10미크론 깊이까지 실리카를 융합했습니다. 100와트 RF 전력으로 4분 동안 매트릭스 Asher로 웨이퍼를 청소하고 크세논 디 플루오라이드 에칭기로 폴리실리콘을 벗겨낸 후 후속 처리 중에 채널을 보호하기 위해 새로운 1미크론 포토 레지스트 층으로 웨이퍼 스핀 코트에 구멍을 뚫습니다.

그런 다음 Aqua Bond 55를 사용하여 웨이퍼 면이 아래로 향하게 하여 희생 유리판에 장착합니다. 본더에 거품이 없는 상태를 유지하기 위하여 배려, 마이크로 90 청소 해결책을 가진 컴퓨터 통제되는 다이아몬드 끝 교련. 이렇게 하면 작은 유리 조각이 채널에 달라붙어 사용 중에 칩이 막히는 것을 방지할

각 칩의 구멍을 뚫고 입구 및 출구를 뚫습니다. 주사기를 사용하여 웨이퍼를 탈이온수로 헹구어 각 구멍에 물을 주입합니다. 그런 다음 사진을 제거한 후 한 시간 동안 비눗물에 담그십시오.

텍스트에 설명 된대로 저항하고 접착하십시오. 웨이퍼를 탈이온수와 따뜻한 비눗물로 헹굽니다. 주사기로 각 구멍을 다시 헹구고 웨이퍼 위로 질소를 흘린 후 에칭된 특징을 피합니다.

섭씨 120도로 설정된 진공 오븐에서 계속 건조시킵니다. 구멍을 검사하여 모래가 없는지 확인하고 필요에 따라 청소 단계를 반복합니다. 다음 단계는 클린룸에서 수행해야 합니다.

광학 또는 기계 표면 프로파일러를 사용하여 채널의 깊이를 측정합니다. 웨이퍼와 퓨즈 실리카 커버 유리를 클린룸에서 텍스트에 설명된 대로 청소합니다. 웨이퍼를 질소 가스로 최소 5분 동안 완전히 건조시킵니다.

그런 다음 웨이퍼 특징면이 위로 향하게 놓고 작은 유리판과 같은 단단하고 평평한 표면 위에 놓인 3-4개의 클린룸 와이프 스택 위에 놓습니다. 커버 유리로 반복합니다. 커버 유리의 가장자리를 잡고 광택 면이 웨이퍼 위에 앞면이 아래로 향하도록 뒤집습니다.

평평한 가장자리를 정렬하고 커버 유리를 웨이퍼에 조심스럽게 떨어뜨리고 수평으로 살짝 밀어 정렬을 조정하도록 합니다. 한 손가락으로 웨이퍼 중앙을 아래로 누릅니다. 본딩 전선이 바깥쪽으로 방사되기 시작하는 것을 볼 수 있습니다.

필요한 경우 웨이퍼 주변의 다른 위치에 추가 압력을 가하여 접합 선단을 전진시킵니다. 밀봉된 웨이퍼를 텍스트에 나열된 온도 프로파일로 프로그래밍된 고온 오븐에 넣은 후 웨이퍼 다이싱 톱으로 웨이퍼를 개별 칩으로 깍둑썰기합니다. 혼합 칩과 용액을 고정하기 위한 매니폴드는 렉산 또는 플렉시 유리와 같은 플라스틱 또는 알루미늄으로 만들 수 있습니다.

온도 제어를 위해 작은 O-링으로 칩을 매니폴드에 만들고 칩 중심을 명확하게 광학적으로 볼 수 있도록 하는 고정 링으로 제자리에 고정합니다. O-링 홈은 칩에 너무 많은 압력을 가하지 않고 좋은 짝을 이루기 위해 표준보다 얕아야 합니다. 칩이 장착되면 중앙 및 측면 저장소에 용액을 추가하고 우물 바닥에 갇힌 기포를 제거하도록 주의하십시오.

도립 현미경에 매니폴드를 놓고 접안렌즈 또는 카메라 출력으로 혼합 영역을 검사합니다. 매니폴드 위에 놓인 백열 손전등은 충분한 빛을 제공합니다. 염료 또는 중앙 채널에서 높은 굴절률 용액을 사용하여 제트를 봅니다.

이 믹서에 사용되는 부피가 너무 작기 때문에 용액 웰 위에 가해지는 공기 압력으로 흐름을 제어할 수 있습니다. 제트를 시각화하려면 제곱인치당 0파운드에서 측면 채널 압력으로 시작하여 중앙 채널과 동일한 압력까지 천천히 증가시킵니다. 한쪽 채널이 막히면 제트기가 출구 채널의 벽 중 하나로 밀려납니다.

눈에 보이는 막힘이 나타나면 주사기로 출구 채널에 압력이나 진공을 가하여 막힘을 제거할 수 있습니다. 단백질이나 다른 유기 물질이 칩을 막으면 밤새 피라냐 용액을 담가 청소할 수 있습니다. 현미경 내부 또는 바로 외부에 있는 이색성 거울을 사용하여 코팅된 레이저 빔을 연구용 현미경으로 가져옵니다.

혼합 영역에 약간 가까운 접안렌즈 또는 카메라에서 초점이 보일 수 있도록 레이저를 정렬합니다. 믹서에 있는 단백질의 형광은 대물렌즈에 의해 수집되고 렌즈에 의해 초점이 맞춰진 이색성 거울을 통해 핀홀로 전송되고 광자 계수기에서 이미지화됩니다. pizo 전기 스캐너를 사용하여 x와 y에서 칩을 스캔하여 혼합 영역을 이미지화합니다.

제트기의 위치를 선택하고 X와 Y를 스캔하여 채널 중앙에서 수직으로 초점을 찾습니다. 현미경의 피사계 심도는 채널 깊이보다 훨씬 작으며 유속은 벽의 1미크론 이내를 제외하고는 채널에서 균일합니다. 따라서 관찰된 형광의 시간적 해상도는 주로 공초점 반점의 크기에 의해 결정됩니다.

제트를 따라 100미크론 단위로 출구 채널 내에서 수평으로 스캔하면서 위치당 약 1밀리초 동안 관찰합니다. 제트를 따라 현미경 스테이지를 80-90미크론 이동시켜 나중에 캡처합니다. 또는 렌즈를 사용하여 이색성 거울 후 분광기 및 CCD로 빛을 감지하여 입구 슬릿에 빛을 집중시킬 수 있습니다.

데이터 수집이 광자 계수기보다 느리기 때문에 일반적으로 제트는 먼저 광자 계수기로 이미지화한 다음 제트를 따라 점들을 분광기로 측정합니다. 광자 계수기의 데이터는 각 위치에서 제트 주변의 3-5 픽셀을 합산하여 강도 대 거리의 플롯을 생성함으로써 분석됩니다. 시간은 적용된 압력을 기반으로 계산된 속도를 사용하여 거리에서 계산됩니다.

마지막 단계로, 본문에 설명된 방법 중 하나를 사용하여 분광기의 데이터를 분석합니다. 여기에 표시된 것은 광자 계수기에 의해 측정된 혼합 영역의 강도에 대한 등고선 플롯입니다. 제트 외부 출구 채널의 배경은 검출기의 노이즈 플로어에 가까워야 하며 일반적으로 빼지 않습니다.

백그라운드가 높을수록 정렬이 불량하거나 단백질이 채널의 벽에 달라붙고 있음을 나타낼 수 있습니다. 반대로, 특히 혼합 영역 근처에서 꼬이거나 비뚤어진 것처럼 보이는 제트는 노즐의 식각이 불량함을 나타냅니다. 시간 분해 스펙트럼은 결합 단백질 또는 Alexa 4 88 및 Alexa 6 47로 표지된 A CBP인 ACell 코엔자임 단백질에서 표시됩니다.

녹색 및 빨간색 사각형은 각각 donor 및 accepted channel로 지정된 파장을 보여줍니다. 이 데이터는 암흑 전하와 레이저 신호를 제거하기 위해 배경을 뺀 것입니다. 배경 신호는 제곱인치당 0파운드와 같은 중앙 채널 압력으로 촬영되었습니다.

혼합 시간은 요오드화칼륨에 의한 트립토판 형광 소멸과 같이 혼합보다 훨씬 빠른 빠른 반응을 측정하여 측정할 수 있습니다. 제트가 현미경의 광학 해상도보다 작기 때문에 혼합 영역에서 큰 강도 강하가 있습니다. 제트가 형성됨에 따라 이 기기 응답은 용액 조건이 변경되지 않는 제어 측정을 수행하여 제거할 수 있습니다.

N-아세틸 트립토판 아미드 형광의 혼합 및 비혼합 실험의 비율이 이 그림에 표시되어 있습니다. 이 선은 콘솔 다중물리 모델링 및 시뮬레이션에서 예측된 요오드화칼륨 농도를 보여줍니다. 농도가 80% 감소하는 시간에서 측정된 혼합 시간은 8마이크로초입니다.

이 플롯은 변성을 6대구치에서 0.06대구치로 희석한 후 단백질 A CBP의 프렛 변화를 보여줍니다. 이 데이터에는 대조 실험이 필요하지 않습니다. 프렛은 이미 비율이고 기기 응답은 이미 제거되었기 때문에 T가 0과 같을 때 가까운 빠른 점프는 혼합 시간 내에 프렛 신호의 급격한 변화를 나타냅니다.

이 발달 후에, 이 기술은 단백질 구조의 대형에 있는 가장 이른 단계를 탐구하기 위하여 단백질 접히기의 분야에 있는 연구원을 위한 길을 닦았습니다.