May 30th, 2025
이 프로토콜은 미세소관 고분자 역학을 조사하는 데 적합한 미세유체 장치의 설계 및 제작에 대해 자세히 설명합니다. 미세 가공, 자동화된 흐름 제어 및 컴퓨터 모델링 기술의 합성은 세포 세포골격을 in vitro 프로빙하는 데 이상적으로 적합한 유연한 시스템을 가능하게 합니다.
미세소관은 세포 분열 및 세포 내 수송에 필수적인 역할을 하는 세포골격 중합체입니다. 이 연구에서 우리는 시험관 내에서 미세소관 역학을 연구하기 위해 미세유체학을 채택합니다. 이 연구는 미세유체 장치에서 미세소관을 연구하기 위한 두 가지 특정 한계, 즉 단백질을 변성시킬 수 있는 기포의 가능성과 높은 처리량 분석의 사용 부족을 다룹니다. 당사의 미세유체 장치 및 프로토콜은 이전 플로우 셀 분석보다 더 강력한 고처리량 테스트 기능을 갖춘 다양한 실험 설정을 허용합니다.
[강사] 시작하려면 산소 또는 깨끗하고 건조한 공기 플라즈마를 사용하여 진공 상태에서 5분 동안 3인치 실리콘 웨이퍼를 플라즈마로 세척합니다. 진공 압력이 마이너스 5토의 10의 5곱 미만인지 확인하십시오. 포토 레지스트 증착을 위해 깨끗한 실리콘 웨이퍼를 스핀 코더 (spin coder) 에 중앙에 배치하고 1-2 밀리리터의 SPR 227.0 포토 레지스트를 실리콘 웨이퍼 중앙에 증착합니다. 포토레지스트를 스핀 코팅하여 30초 동안 분당 1000회전으로 13마이크로미터 두께의 층을 만듭니다. 코팅된 표면과의 접촉을 최소화하면서 실리콘 웨이퍼를 섭씨 70도로 설정된 핫 플레이트로 옮깁니다. 핫 플레이트에서 실리콘 웨이퍼를 배양하고 온도가 섭씨 115도에 도달할 때까지 3-5분마다 온도를 섭씨 10도씩 올립니다. 그런 다음 핫 플레이트를 끄고 온도가 섭씨 65도 이하가 될 때까지 실리콘 웨이퍼를 식히십시오. 집게를 사용하여 냉각된 웨이퍼를 마스크 정렬기로 옮깁니다. 제조업체 또는 사이트별 프로토콜에 따라 실리콘 웨이퍼와 적절한 포토 마스크를 모두 얼라이너에 로드하고 이제 웨이퍼를 평방 센티미터당 약 400밀리줄의 에너지로 자외선에 노출시킵니다. 공식을 사용하여 필요한 노출 시간을 계산합니다. 재수화 및 열처리 후 웨이퍼를 적절한 현상액에 담그십시오. 그런 다음 웨이퍼의 양면을 탈이온수로 30초 동안 부드럽게 헹굽니다. 개발된 웨이퍼를 질소 가스로 건조시킨 후 데시케이터로 옮깁니다. 데시케이터에 작은 알루미늄 용기를 넣고 알루미늄 용기에 실란 한 방울을 추가합니다. 건조 후 혼합 및 탈기된 폴리디메틸실록산을 페트리 접시 내부의 마스터 몰드에 붓습니다. PDMS가 완전히 경화될 수 있도록 접시를 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다. 장치 기능 주위에 메스 또는 면도날을 사용하여 마스터 레이어에서 PDMS의 직사각형 조각을 잘라냅니다. 각 부품에 적절한 접착 접촉을 허용하고 22 x 22mm 유리 커버 슬립에 맞도록 적절한 측면 공간이 포함되어 있는지 확인하십시오. PDMS를 여분의 희생 PDMS 레이어에 놓고 단단한 표면을 피합니다. 그런 다음 깨끗한 1.5mm 구멍 펀치를 사용하여 각 PDMS 조각에 입구 및 출구 구멍을 만듭니다. 이제 22 x 22mm 유리 덮개 슬립을 가져와 이소프로필 알코올을 바른 물티슈를 사용하여 청소하십시오. 그런 다음 깨끗하고 건조한 공기 플라즈마를 사용하여 진공 상태에서 5분 동안 유리 덮개 슬립을 플라즈마로 청소합니다. 플라즈마 클리너에 넣기 전에 이소프로필 알코올 결합 물티슈로 유리 커버 슬립과 PDMS의 특징면을 모두 닦고 동시에 깨끗하고 건조한 공기 플라즈마를 사용하여 진공 상태에서 30초 동안 플라즈마 세척합니다. 청소 후 PDMS를 반전시켜 피처 면이 아래쪽을 향하도록 합니다. PDMS를 유리 커버 슬립 위에 놓고 가볍게 눌러 접착을 촉진합니다. 안정화된 미세소관 확장은 성장 방향에 수직으로 흐르는 완충 용액에 의해 구부러져 장치 내에서 방향력을 가할 수 있는 능력을 입증했습니다. 미세소관이 경험하는 표면 근처 유속은 Navier-Stokes 방정식에 기반한 시뮬레이션 및 분석 모델링을 사용하여 초당 92마이크로미터로 계산되었습니다. 전산 시뮬레이션은 예측 가능한 농도 패턴을 보여주는 형광 염료에 의해 실험적으로 확인된 장치 전체에 걸쳐 안정적인 구배의 확립을 보여주었습니다. 이중 표지 미세소관 확장, 장치를 따라 별개의 공간 영역에서 지배하는 다양한 형광 단백질로 기울기 기반 분할을 확인했습니다.
이 연구는 시험관 내에서 미세소관 중합체 역학을 조사하도록 설계된 미세유체 장치를 제시합니다. 이 장치는 공기 기포 형성과 같은 문제를 해결하고 고처리량 테스트 기능을 향상시킵니다.
Microfluidics-based investigation of microtubule polymer mechanics enables high-throughput, quantitative analysis of cytoskeletal dynamics, addressing key bottlenecks in early discovery and mechanistic de-risking. The integration of automated flow control and computational modeling supports robust, reproducible workflows for biopharma R&D teams focused on target validation and predictive confidence. This platform advances the ability to interrogate cellular mechanics in vitro, informing risk-adjusted portfolio decisions.
This microfluidic system fits within the early discovery to lead identification continuum, supporting hypothesis testing and assay readiness for cytoskeletal targets.