Name: 미세소관 고분자 역학 조사를 위한 미세유체역학 기반 접근법 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 학습하세요 미세유체역학 기반 기술을 활용한 미세소관 고분자 역학 분석 방법을. PDMS 몰딩과 유동 제어를 통해 기포 형성 문제를 해결하고 고처리량 실험이 가능한 연구 플랫폼을 구축합니다.

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Microfluidics는 유동성 교류 수로1, 2의 복잡한 디자인 그리고 제작에 의해, 아주 작은 유동성 양의, 수시로 1개 미만 액체의 통제를, 가능하게 한다. microfluidic 장치의 작은 규모는 독특한 엔지니어링 현상을 일으킵니다. 즉, 유체 흐름에서 관성력과 점성력 사이의 비율을 무차원으로 측정하는 레이놀즈 수는 일반적으로 미세유체역학에서 O(10) 이하로 작으며, 이는 미세유체 장치에서 점성력의 중요성을 강조합니다. 또한, 대류 수송과 확산 수송을 비교하는 Péclet 수는 대류 수송이 일반적으로 미세 유체 역학에서 무시할 수 있음을 보여줍니다 3,4,5. 미세유체역학(microfluidics)에서 이러한 확산 구동 층류 체제는 정밀한 유체 구배를 유지하여 단일 장치에서 병렬 실험을 지원하기 때문에 유리합니다.
포토리소그래피는 미세유체 소자 6,7,8을 제조하기 위한 주요 방법으로 남아 있습니다. 요컨대, 이 과정에는 미세유체 설계의 '마스터' 에칭 템플릿 생성이 포함됩니다(그림 1). 감광성 기판이 준비되고 미세유체 설계의 포토마스크가 포토레지스트 영역을 자외선에 선택적으로 노출시킵니다. 후속 에칭 방법은 기판을 개발하여 디자인을 완화합니다. 폴리디메틸실록산(PDMS)은 종종 마스터에 주조 및 경화됩니다. 그런 다음 설계의 부정적인 특징을 채택한 경화된 PDMS를 마스터에서 제거하고 유리 커버슬립에 접착합니다. 이 전체 제작 프로세스는 일반적으로 1-2일이 소요되므로 빠른 설계 반복과 여러 장치의 생산이 가능합니다. 소프트 리소그래피 및 미세 가공 공정에 대한 자세한 검토는 다른 참고 문헌 1,2,3,10,11,12,13에서 확인할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig01.jpg"> 
그림 1: 전통적인 포토리소그래피 공정과 미세 가공 공정의 개요. (A) 전통적인 포토리소그래피 공정 및 (B) 미세 가공 공정. 응용 분야와 원하는 포토레지스트 특성에 따라 네거티브 또는 포지티브 포토레지스트를 사용할 수 있지만 동일한 디자인 마스터를 얻을 수 있습니다. 원하는 피처 높이 또는 포토레지스트 용융 온도와 같은 특성은 적절한 포토레지스트 유형을 결정하는 데 도움이 됩니다. 이 그림은 Rogers (2022)14의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
미세유체역학(microfluidics)의 사용은 많은 연구 분야에서 가능성을 확장했으며, 가장 최근의 영향은 생물학 분야입니다. 그것의 작은 규모를 감안할 때, microfluidics는 세포나 단백질과 같은 제한적이고 가치 있는 자원의 정확한 관리를 가능하게 합니다. 더욱 영향력 있는 것은 기판 강성의 수정, 시편에 가해지는 힘의 가해, 심지어 전류의 적분과 같은 생리학적 조건을 모방하는 미세유체 시스템의 조정입니다. 또한 미세유체역학을 사용하면 여러 시약을 병렬로 조작할 수 있고 시스템 설계를 신속하게 프로토타입화하고 반복적으로 개선할 수 있습니다. 이러한 기능을 통해 일반적으로 "랩온칩"1,6,9,15,16,17,18,19이라고 하는 단일 장치로 전체 실험실 워크플로우를 소형화할 수 있습니다.
microfluidics의 세포 생물학 응용의 한개는 미세소관 중합체의 수사입니다. 미세소관은 세포의 세포골격의 필수 구성 요소로, 세포 분열 및 세포 내 화물 수송과 같은 과정에서 중요한 역할을 합니다20,21. 세포골격의 가장 단단한 요소인 미세소관은 플렉시글라스22,23에 필적하는 탄성 계수를 나타냅니다. 이들의 견고한 기계적 특성은 예를 들어 심장의 수축기 및 이완기 동안 주기적으로 구부리고 이완되는 심근세포 수축을 포함한 다양한 세포 기능에 매우 중요합니다24. 미세유체 장치는 이전에 시험관 내에서 미세소관의 특성과 고차원 구조를 조사하기 위해 채택되었습니다. 실제로, 미세유체역학은 미세소관 중합 역학, 미세소관-미세소관 상호 작용 및 미세소관 관련 단백질이 미세소관 기계적 특성에 미치는 영향을 조사하는 데 사용되었습니다 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41.
미세소관 분야에 미세유체역학을 도입하면서 많은 흥미로운 발견이 이루어졌지만, 미세소관 연구를 위해 이러한 장치를 적용하는 것은 여전히 개선의 여지가 있습니다. 이 연구에서는 미세유체 장치에서 미세소관을 연구하는 데 있어 지속되는 두 가지 특정 제한 사항, 즉 일반적으로 미세유체 장치의 수동 조작에 의해 도입되는 장치 내 기포 형성 가능성과 고처리량 분석법의 활용도 부족을 다룹니다. 첫째, 튜빙 연결 및 분리와 같은 수동 조작은 채널에 기포 형성을 도입할 수 있습니다. 플로우 셀 내의 기포 형성은 기포가 단백질을 변성시키고 미세소관 중합체를 전단시키며 세포 배양에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 치명적입니다42,43. 또한 장치의 날카로운 모서리와 비스듬한 각도로 인해 불균일한 표면 습윤이 발생하여 공기 혼입 가능성이 높아집니다. 기포의 형성, 지속성 및 영향을 줄이기 위해 수많은 기술이 개발되었습니다. 그러나 거품 완화 방법의 사용은 보편적이지 않습니다 42,43,44,45,46. 게다가, microfluidics 사용의 중요한 이점의 한개는 높 처리량 실험의 기능이더라도, microfluidics는 아직 microtubule 연구를 확장하기 위하여 이용되지 않았습니다. 미세유체 장치는 동일한 장치에서 여러 실험 조건을 병렬로 테스트하도록 설계할 수 있습니다. 예를 들어, 유체 구배는 서로 다른 미세소관 관련 단백질 또는 약물의 흐름을 지시하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 동일한 장치 내에서 분할된 미세소관의 특정 영역으로의 표적 전달을 가능하게 할 수 있습니다.
여기에서 우리는 이러한 한계를 해결하는 미세유체 장치를 반복적으로 설계했습니다. 우리는 장치 제작에 대한 단계별 프로토콜을 제공하여 더 많은 청중이 미세소관 연구에 미세유체 기술을 사용할 수 있도록 합니다. 이 장치 설계는 버블 트랩 기능을 통합하고 자동화된 흐름 제어 시스템을 활용하여 수동 개입을 줄이는 동시에 고처리량 분석을 위해 장치에서 솔루션의 기울기를 가능하게 합니다. 요약하면, 이 미세유체 설계의 개발은 미세소관 역학에 대한 광범위한 연구와 이해를 촉진하는 동시에 더 광범위한 미세소관 연구 분야에서 실험 설계에 가치 있는 개선을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.6 mL 미세 원심분리기 튜브(투명)</td><td>모든 브랜드</td><td></td> 저<td>보유 유형이 선호됩니다</td></tr><tr><td>1.5 mL 미세 원심분리기 튜브(투명)</td><td>모든 브랜드</td><td></td> 저<td>보유 유형이 선호됩니다</td></tr><tr><td>1.5 mm 표준 생검 펀치</td><td>Integra LifeSciences</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100x/1.49 개구수 TIRF 대물렌즈</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm 유리 커버슬립</td><td>ThorLabs</td><td>CG15CH</td><td></td></tr><tr><td>3" 단면 광택 실리콘 웨이퍼 University</td><td>Wafer</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>4" 페트리 접시</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 및 마이크로; L, 오픈 탑 얇은 벽 초투명 튜브</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>345843</td> 프로토콜<td>에서 '에어퓨지 튜브'라고 함</td></tr><tr><td>488, 561 및 640nm 고체 레이저</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-95 고정각 로터</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347595</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airfuge 공기 구동 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347854</td><td>프로토콜에서 'airfuge'라고 함</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 마이크로스케일 단백질 라벨링 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon Ultra EM-CCD</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor NEO sCMOS</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Generic 버전 사용 가능</td></tr> 소<tr><td>뇌 라벨 없는 튜불린(정제)</td><td>N/A</td><td></td><td>사내에서 제작되지만 구매 가능</td></tr><tr><td>카제인</td><td>밀리포어시그마</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>카탈라아제</td><td>밀리포어시그마</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>클린 드라이 에어(CDA)(가압 가스)</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr> 압축 <tr><td>공기 공급</td><td>모든 브랜드</td><td></td> 미<td>세유체에 연결 유량 컨트롤러</td></tr><tr><td>COMSOL 다중물리 소프트웨어</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 황동 스테이지 어댑터</td><td>N/A</td><td></td><td>현미경에 22mm x 22mm 커버슬립을 장착하기 위해 사내에서 제작</td></tr> 탈<tr><td>이온수 모든</td><td>브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dessicator</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-포도당</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol(DTT)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow ESI(Smart Interface) 소프트웨어</td><td></td> ETFE &frac14가 있는 Elveflow <td></td><td></td></tr><tr><td>플랜지리스 PFA 피팅; "-28에서 1/16" 외경 페룰&NBSP;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-XP-245X</td> 가<td>압 저장소 랙을 통해 micrewtube 소스 바이알에서 유량 센서로 튜브를 연결하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Fluiwell 4-채널 2mL 저압</td><td>Fluigent</td><td>14002001</td> 유<td>량 제어 시스템을 micrewtube에 연결하는 데 사용됩니다. '가압 저수지 랙'이라고도 함</td></tr> 퓨<tr><td>마 후드</td> 모든 <td>브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포도당 산화효소</td><td>밀리포어시그마</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>예나 바이오사이언스</td><td>NU-405L</td><td></td></tr><tr><td>구아노신 삼인산(GTP)</td><td>밀리포어시그마</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-625 고속 배출 필터 휠</td><td>Finger Lakes Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>N/A</td><td></td><td>오픈 액세스</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td>이</tr><tr><td>소프로필 알코올</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karl Suss MA-6 마스크 얼라이너</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.05833</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 소프트웨어</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAPOSIT SPR 220 7.0 포토레지스트</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세유체 피팅 6-40 - 1/4"-28 어댑터 키트</td><td>다윈 미세유체</td><td>LVF-KFI-08</td> 가<td>압 저장소 랙(Fluiwell 랙)을 통해 미크루튜브 소스 바이알에서 유량 센서로 튜브를 연결하는 데 사용미</td></tr>세<tr><td>유체 피팅 암 루어 잠금 어댑터 키트</td><td>다윈 미세유체 LVF-KFI-04</td><td></td> 주사기를 튜브 미세유체 유량 컨트롤러<td></td></tr><tr><td></td><td>에 연결하는 데 사용Elveflow</td><td>OB1 MK3+</td><td></td></tr><tr><td>미세유체 유량 센서</td><td>Elveflow</td><td>MFS3</td><td>이 유량 센서 범위는 0-80 & mu입니다. L&nbsp;</td></tr><tr><td>MICROPOSIT MF-319 개발자</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>질소(가압 가스)</td> <td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대물렌즈 히터</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One-Piece Fingertight 10-32 1/16" OD 튜브용 원뿔형 피팅&nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-F-120X</td> 주<td>사기를 튜브에 연결하는 데 사용</td></tr><tr><td>파클리탁솔(탁솔)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1097</td><td></td></tr><tr><td>포토리소그래피 마스크</td><td>N/A</td><td></td><td>당사 설계를 사용하여 외부 당사자가 제작</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 유량계 시스템</td><td>Harrick 플라즈마</td><td>PDC-FMG</td><td>플라즈마 클리너와 통합되어 가압 가스의 흐름 제어 가능</td></tr><tr><td>플라스틱 전구 피펫</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic F-127</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2443</td><td>프로토콜에서 '폴록소머 407'이라고 함</td></tr> 염<tr><td>화칼륨</td><td>연구 제품 국제</td><td>P41000</td><td></td></tr><tr><td>생고베인 성능 플라스틱&nbsp; 튜브 Tygon .020 ID</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-206-8921</td><td>프로토콜에서 '1.5mm 튜브' 및 '튜브'로 참조됨</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Any 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>비용 효율적인 장비, LLC.</td><td>200x</td><td>이 모델은 단종될 수 있습니다</td></tr><tr><td>표준 피펫 및 팁 세트</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>표준 플라스틱 주사기</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>10mL 루어 슬립 주사기</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow, Inc.를</td> 사용했습니다.<td></td> 프로토콜<td>에서 'PDMS' 및 '경화제'라고 합니다</td></tr> 립 <tr><td>씰 및 플랫 스크류 캡이 있는 T339 Micrewtube</td><td>Medline Industried, LP.</td><td>T339</td><td>프로토콜에서는 '소스 바이알'이라고 합니다. 0.5mL 및 1.5mL 크기 TAMRA</td></tr><tr><td>, SE; 5-(및-6)-카르복시테트라메틸로다민, 숙시이미딜 에스테르</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td>프로토콜에서 'TTR'이라고 함</td></tr><tr><td>트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸) 실란</td><td>밀리포어시그마</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Trion Phantom RIE ICP&nbsp;</td><td>트리온 테크놀로지, Inc.</td><td></td><td>이 플라즈마 클리너는 프로토콜의 1.1단계에서만 사용됩니다. PDMS 본딩에 사용되는 것과 같은 다른 플라즈마 클리너를 대신 사용할 수 있습니다. 우리는 실리콘 웨이퍼를 청소하기 위해 이 시스템이 달성할 수 있는 훨씬 낮은 진공을 선호</td></tr>합니다 <tr><td>TRITC 다클론 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A6397</td><td>프로토콜에서 '항로다민 항체'라고 함</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td>진공</tr><tr><td>펌프</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

미세소관 고분자 역학 조사를 위한 미세유체역학 기반 접근법 개발

Development of a Microfluidics-Based Approach for Investigating Microtubule Polymer Mechanics

In this protocol, we describe the design and fabrication of a microfluidic device developed for the investigation of microtubule polymer mechanics. The ...

development-microfluidics-based-approach-for-investigating

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 황금 microelectrodes와 실리콘 기판에 폴리 (에틸렌 글리콜) 자기 조립 monolayer을 (PEG - SAM) 형성을위한 절차를 제시한다. PEG - SAM은 단일 단계에서 형성과 실리콘과 금색 표면에 biofouling을 방지합니다. 전기 영동은 다음 nanoscale patterning의 biomolecules에 대한 아래 사용되고 있습니다.

Patterning의 Biomolecules에 대한 Microelectrodes에 자기 조립 Monolayers을 Antifouling

지속성 길이 또는 biopolymers의 굽힘 강성을 측정 할 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 실험적으로 개별 미소의 지속성 길이를 결정하는 kinesin 기반 미세 소관 글라이딩 분석을 사용하고 고를 기반 글라이딩 assays에 적용 할 수 있습니다.

글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정

미세 소관은 본질적으로 불안정 폴리머, 그리고 성장과 단축 사이에 자신의 전환 확률 통제하기가 어렵습니다. 여기에서 우리는 photoablatable 안정 캡으로 분할 미세 소관을 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 분할 된 미세 소관 해중합함으로써 분해 미세 소관의 끝 동작의 분석을 지원, 높은 공간적 해상도로 트리거 될 수 있습니다.

분해 미세 소관 엔드에 힘 입어 모션을 연구하기 위해 분단 미세 소관의 준비

효모 신진 인해 강력한 유전학과 미세 소관 세포 골격의 단순함에 생체 내 미세 소관 역학 연구를위한 유리한 모델입니다. 다음 프로토콜 변환 및 문화 효모 세포, 공 초점 현미경 이미지를 수집하고, 정량적으로 효모 살아있는 세포에서 미세 소관 역학을 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

여기에서 우리는 살아있는 세포 회전 디스크 공초점 현미경 검사법 및 MATLAB 기지를 둔 심상 처리를 사용하여 prometaphase에서 동기화된 세포에 있는 microtubule 역학 분석의 강력하고 상세한 방법을 제시합니다.

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여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

우리는 형광 현미경과 함께 간단한 액틴 필라멘트 미세 유체 분석을위한 프로토콜을 제시하여 개별 액틴 필라멘트를 실시간으로 정확하게 모니터링하면서 순차적으로 다른 단백질 용액에 노출 할 수 있습니다.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

이 기사는 MAP65, 식물 기반 미세 소관 가교제 및 PEG를 크라우밍 제로 사용하여 촉각제 모양의 미세 소관 어셈블리를 형성하기위한 프로토콜을 제시합니다.

미세 소관 선인장체의 자체 조립

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

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