Name: 인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 52 s
Description: 배우세요 영구 치아에서 효소 소화법과 직접 배양법을 이용해 인간 치과 펄프 줄기세포를 분리하고 특성화하는 방법을. 이 기술은 치아 재생의학 연구에 활용됩니다.

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우리는 굉장히 자신의 기술 지원에 대한 자신의 중요한 원반 씨 모하마드 레자 Khadem 샤리프에 박사 라일라 Shakeri 및 박사 Aref Dournaei을 인정합니다.

1. 효소 솔루션 및 확산 매체 (PM)를 준비 <ol><li> Collagenase 종류 나 솔루션을 만들기 : collagenase 유형 I (12 MG / ML)을 무게 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 1 ML PBS와 필터에 용해. 그런 다음 15 ML 튜브를 삽입하고 필요 할 때까지 -20 ° C에 보관하십시오. </li><li> dispase 솔루션을 확인합니다 dispase을 펴라 (16 MG / ML) 1 ML PBS 및 필터는 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 분해. 그런 다음 15 ML 튜브를 삽입하고 필요한 ° C까지 4에 보관하십시오. </li><li> 효소 솔루션을 확인하십시오 : 2 ML 멸균 PBS 100 MG / ML 페니실린, 100 MG / ML의 스트렙토 마이신을 포함하는으로 한 ML collagenase 유형 I 솔루션 (12 MG / ML) 1 ML dispase 솔루션을 (16 MG / ML)를 추가합니다. 최종 볼륨의 dispase과 Collagenase I의 총 농도는 receptively 4 MG / ML, 3 MG / ML,해야합니다. 그런 다음, 네 15 ML 튜브, 각 포함 1 ML 효소 솔루션에에 나누어지는이 볼륨입니다. 각 관은 한 펄프 소화에 사용될 수. </li><li> 솔루션을 세척하십시오 : 100 밀리그램 / ML 페니실린, PBS로 100 MG / ML의 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> 기본 미디어를 만들기 : 이글의 매체의 알파 수정은 (α-가상) 10 % FBS 및 100 단위 / ML 페니실린, 100 MG / ML 스트렙토 마이신과 보충. </li><li> 10% FBS, 100 μM L-아스코르브 산 2 - 인산염, 2 MM L-글루타민, 100 단위 / ML 페니실린, 100 MG / ML로 보충 이글 배지 (α-가상)의 알파 수정 : 확산 미디어 (PM)를 확인 스트렙토 마이신, 0.25 MG / ML amphotericin B. </li><li> Odontogenic 미디어를 만들기 : 이글의 매체의 알파 수정은 (α-가상) 10 % FBS, 100 μM L-아스코르브 산 2 - 인산염, 2 MM L-글루타민, 100 단위 / ML 페니실린, 100 MG / ML의 스트렙토 마이신, 0.01 μM로 보충 Dexamethasone, 5 MM β-글리세롤 인산 1.8 밀리미터 Monopotassium 인산. </li></ol> 2. 치과 펄프 줄기 세포 Isolatio에 대한 인간 치과 펄프 조직을 준비N <ol><li> 일반 인간의 셋째 어금니가 승인 기관 검토위원회 (IRB)에서 이맘 알리의 치과 클리닉의 성인 (세 21-29년)에서 수집되었다. </li><li> 치아는 기본 매체 (α-가상 10 % FBS와 보충)에 배치 된, 4 ° C.에서 실험실로 이송되었다 </li><li> 무균 상태에서 생물학적 층류 후드 내에서 작업, 세트 업을 처리 할 수​​ 있도록 각 치아에 대해 하나의 100mm 배양 접시를 완료했다. 치아 표면은 70 % 에탄올에 의해 청소했다. </li><li> 페트리 - 요리 중 하나에서 작업하는 동안, 치아는 치아 포셉 보관되었으며, 메스 블레이드는 파편과 뿌리에 치주 인대를 닦아하는 데 사용되었다. </li><li> Cemento - 에나멜 접합은 천천히 펄프 챔버을 나타 내기 위해 살균 치과 디스크를 사용하여 절단되었습니다. 이것은 절단 과정은 치과 조직의 과열 줄이기 위해 천천히 수행해야하는 것으로 간주합니다. </li><li> 펄프 조직은 부드럽게 왕관과 루트에서 분리되었다. </리&gt; <li> 펄프 조직은 메스 블레이드의 도움으로 작은 조각으로 절단되었다. </li></ol> 3. 인간 치과 펄프 절연 <ol><li> 펄프 조직은 hDPSCs의 절연을위한 펄프 조직 explants에서 펄프 조직 또는 직접 휴대 가지 중 하나 효소 분해를 받았습니다. </li><li> 펄프 조직의 효소 분해 : <ol><li> 펄프 조직의 작은 조각이 37 ° C.에 1 시간을위한 효소 솔루션으로 이동되었습니다 조직을 파괴하는 데 도움이 소용돌이 매 30 분. </li><li> 그 후 70 μM 셀 스트레이너를 통해 세포를 통과하여 큰 셀을 합산이 삭제되었습니다 및 단일 세포 현탁액을 얻었다. </li><li> 단일 셀 중지는 상온에서 5 분에 1,200 rpm으로 centrifuged했다. </li><li> Supernatants 신중하게 해제 pipetted되었고 펠릿은 1 ML 확산 중간 (PM)에 다시 중지되었습니다. (참고 : 확산 매체에 FBS를 종료 깔 효소sociation.) </li><li> 치과 펄프의 단일 셀 중지는 PM과 25cm 두 문화 플라스크에 놓는 후 5 % CO 2에서 37 ° C에서 incubated되었습니다. </li><li> 셀 confluency가 달성 될 때까지 문화 매체는 매 3 일마다 교체되었습니다. </li></ol></li><li> 펄프 조직 explants에서 직접 세포 가지 : <ol><li> 펄프 조직이 1-2-mm 조각으로 다진되었고, 각 조각은 PM 25-cm 2 문화 플라스크에 배치 된 후 37 incubated ° C 5 % CO 2인치 그것은 세포의 가지에 대한 PM의 총 양이 더 셀 가지에 대한 펄프 조각 (플라스크 당 2 ~ 3 개의 ML)의 첨부 파일을 지원해야 고려되어야한다. </li><li> 가지가 관찰 된 후 보통이 변경되었습니다. </li><li> 합류에 능가 셀 1시 4분의 비율 (통로 1)의 하위 양식이었다. </li></ol></li></ol> 4. Immunophenotyping <ol><li> / 250000 셀통로 3 세포의 두 종류의 튜브는 4 ° C 어두운 곳에서 30 분 동안 PE 또는 isotypes과 FITC-복합 항 인간 항체에 의해 incubated되었습니다. (참고 :. 항체의 농도가 제조 프로토콜에 따라 적용) </li><li> 부화 시간 후, 100 μl PBS 또는 FACS 희석 솔루션은 각 튜브에 추가되었습니다하고 어두운 장소에서 5 분 동안 1,200 rpm으로 centrifuged. </li><li> Supernatants이 삭제되었습니다 &amp; 펠릿는 100 μl PBS 또는 어두운 장소에서 FACS 희석에 다시 일시 중지되었습니다. </li><li> 타겟 표면 마커 (CD 마커)가 BD FACSCalibur에 의해 평가되었다. </li></ol> 5. Mineralized 셀에 DPSCs의 차별화 유도 및은 알리자린 레드 S 분석을 정량화 <ol><li> 펄프 조직 explants (DPSC-OG)에서 펄프 조직의 효소 분해 (DPSC-ED라고도 함) 또는 직접 휴대 가지에 의해 획득 된 DPSCs 3 구절에 대한 하위 양식이었다. </li><li>t 항로 3, 세포는 5000 셀 /도에서 6도 판에 씨앗이되었다. </li><li> 60 % 합류에 odontogenic 매체는 기존의 PM에 의해 대체되었다. 세 우물은 성장 매체를 추가하여 대조군으로 남아 있었다. </li><li> 보통 하루에 21까지 삼일마다 변경합니다. </li><li> 일 21시, 셀 PBS로 세척 한 1 ML / 잘 실온에서 15 분 10 % paraformaldehyde에 의해 수정되었습니다. </li><li> 그런 다음 paraformaldehyde는 조심스럽게 해제 pipetted되었고 세포는 소주 H 2 O.으로 3 회 (각 시간 5-10 분)을 씻어되었습니다 (참고 : monolayer을 방해하지 마십시오.) </li><li> 세척 후, 1 ML / 잘 알리자린 레드 S는 실온에서 20 분에 추가되었습니다. </li><li> 셀은 추가 알리자린의 붉은 색을 제거 할 deionized H 2 O 네 번 (부드러운 요동 각 시간 5 분)에 의해 세척되었다. </li><li> 1 ML / 잘 H 2 O는 건조에서 세포를 방지하기 위해 추가되었습니다. </li><li> 플레이트는 시각적 인 기능으로 간주되었다pection 및 / 또는 이미지 수집. </li><li> 알리자린 레드 S 정량화 분석의 경우, H 2 O가 흔들리고있는 실온에서 30 분 6 - 잘 접시 및 배양의 각 잘 1 ML 10% 아세트산에 의해 대체되었다. </li><li> 그런 다음 잘 세포 monolayer / 털 깎는 &amp; 아세트산 및 세포 모두 별도의 1.5 ML 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송 있었다. (참고 :. 각도 각 ED &amp; OG 그룹에 대한 별도의 튜브 즉 세 테스트 우물 및 세 제어 우물에 전송해야합니다) </li><li> 튜브는 30 초에 힘차게 vortexed했다. </li><li> 85 열 ° C 10 분에. (참고 : 증발을 방지하기 위해 튜브는 parafilm으로 밀봉되었다.) </li><li> 난방 후, 튜브는 5 분에 얼음으로 전송되었습니다. (참고 : 냉각 될 때까지 튜브를 열 수 없습니다.) </li><li> 슬러리는 15 분에 20,000 XG에서 centrifuged했다. centrifuging 있지만, 알리자린 레드 표준은 만들어졌다까지. </li></ol> 알리자린 레드 S 표준은 먼저 희석 버퍼를 diluting 및 테이블을 기반으로 2 배 시리얼 dilutions을 사용하여 준비 하였다. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="7"> 염료의 높은 범위 농도 </td><td colspan="7"> 염료의 낮은 범위 농도 </td></tr><tr><td> 이 MM </td><td> 1 ㎜ </td><td> 500 μM </td><td> 250 μM </td><td> 125 μM </td><td> 62.5 μM </td><td> 31.3 μM </td><td> 15.6 μM </td><td> 7.8 μM </td><td> 3.9 μM </td><td> 1.9 μM </td><td> 0.9 μM </td><td> 0.4 μM </td><td> 공백 </td></tr></tbody></table><ol start="16"><li> 원심 분리 한 후, 표면에 뜨는 / 튜브의 한 ML은 새로운 별도의 1.5 ML 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송되었습니다. </li><li> 산도는 ~ 375 μl 10을 무력화되었다튜브 당 %의 암모니아 수산화. (참고 : pH의 분노 4.1-4.5해야합니다.) </li><li> 표준 및 샘플 (별도 테스트 및 컨트롤을 포함)의 150 μl를 96 - 웰 플레이트 불투명 벽, 투명 하단에 추가되었습니다. </li><li> 흡광도는 405 nm의에서 읽고 있던 샘플의 OD 값은 추가 분석을 위해 표준 계획과 비교되었다. </li></ol>

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</ol>

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이 프로토콜은 두 가지 방법, 효소 분해 및 펄프 조직 explants에서 줄기 세포를 직접 가지를 사용하여 치과 펄프에서 hDPSCs의 절연 및 특성화 과정을 설명합니다. 또한, odontoblasts에 이러한 세포의 체외 차별화에 정량 알리자린 레드 S 검정 &amp; QPCR에 의해 평가되었다. 인간의 치아에서 펄프 조직을 분리에 대한 기존 프로토콜은 이러한 플라이어 (뼈 포셉) 9 근절 바늘 29, 그레이시 퀴렛 30, 치과 균열 (fissure)의 burs 4 등의 낮은 수준을 고려하면서 이러한 방법은 시간이 많이 소요 아르 등 다양한 악기를 사용했다 지속적으로 물을 추가하여 펄프의 과열. 그러나, 현재의 기술로, 치과 다이아몬드 디스크를 한 단계 과정에서 최소 오염과 이빨을 줄일 수있는 빠른 방법입니다 펄프 조직의 격리에 사용되며, 절단 과정에서 펄프의 과열을 최소화 할 수 있습니다. 또한,...

줄기 세포는 멀티 효력과 자기 갱신 15 두명의 놀라운 기능을 가지고 clonogenic 세포입니다. 다른 replicative의 potencies 모든 줄기 세포 중에서 출생 후의 줄기 세포와 같은 치과 줄기 세포 때문에 자신의 접근성, 소성 및 기타 성인 줄기 세포 16에 비해 높은 proliferative 능력의 최근 관심을 모으고있다. 특질 상, 중간 엽 줄기 세포와 유사한, 치과 펄프의 줄기 세포는 여러 차별화를 mesenchyme로 용량 및 / 또는 체외 및 생체에서 모두 비 mesenchyme lineages을 가지고 자기편 clonogenic 세포입니다. 1-8,17,18 DPSCs에 의해 식별됩니다 자신의 부정적인 조혈 항원의 표현 (예를 들어, CD45, CD34, CD14) 및 CD90의 긍정적 인 표현, CD29, CD73, CD105, CD44 및 STRO-1. 19,20 최소 통증 및 병적 쉽게 얻을 가능성이 valu로 인간 DPSCs을MSCS의 수 출처는 골수 중간 엽 줄기 세포 21로 보통 소스에 비해. 일반적으로 DPSCs는 두 가지 방법, 즉 펄프 조직 explants (DPSC-OG) 22-24과 /이나 효소 소화 (DPSC-ED) 4,6,25에 의한 줄기 세포의 이동에 의해 격리되었습니다. 이전 연구는 격리 방법과 문화 조건 체외 통로 26,27의 아래에 다른 인구 나 lineages을 일으킬 수 것으로 나타났습니다. 영구 치아 (pDPSCs)의 경우, 황 외이 효소 소화 pDPSCs이 강해 DPSCs에 비해 높은 확산 가능성이있는 것으로 밝혀졌습니다. 또한 26, 낙엽 치아 (dDPSCs)의 경우,이 입증 된 그 STRO-1 &amp; CD34 마커 dDPSC-OG에 비해 dDPSC-ED에 더 많은 표현. 또한, dDPSC-ED는 정의 osteo / odonto 매체에 높은 mineralization 속도를 표시. 따라서 27으로 인해 연구에서 DPSCs의 뛰어난 잠재력egenerative 약을 더 연구는 서로 다른 분리 방법에서 파생됩니다 가능한 다양한 인구를 더 잘 이해해야합니다. 여기, 펄프 추출의 과정을 촉진 한 단계 치과 다이아몬드 디스크를 사용하여, 펄프 추출의 쉬운 방법을 소개하려고했습니다. 또한, ED 또는 OG 방법을 적용하여 인간의 펄프 - 파생 줄기 세포의 분리 후, 두 그룹 사이의 일반적인 특성 및 차별화 용량도 조사했다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 또는 로트. 수 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> α-가상 </td><td> GIBCO </td><td> 11900-073 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase 유형 I </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C0130-100MG </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> GIBCO </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> GIBCO </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 정의 (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 2 인산 L-아스코르브 산 </td><td> 시그마 </td><td> A8960-5G </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> GIBCO </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Dexamethasone </td><td> 시그마 </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> β-글리세롤 인산 나트륨 소금 하이드레이트, BioUltra </td><td> 시그마 </td><td> G9422-100G </td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일 염기의 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Osteogenesis 분석 키트 </td><td> Millipore </td><td> PS01802031 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 IgG2b-PE isotype 제어 </td><td> BD pharmingen </td><td> 50808088029 </td><td></td></tr><tr><td> FITC 마우스 IgG2b isotype 제어 </td><td> BD pharmingen </td><td> 559532 </td><td></td></tr><tr><td> FITC 마우스 IgG1 κ isotype </td><td> BD pharmingen </td><td> 11471471 </td><td></td></tr><tr><td> FITC / PE 마우스 안티 - 인간 CD34/CD45 </td><td> BD pharmingen </td><td>341071 </td><td></td></tr><tr><td> PE 안티 - 인간 CD146 </td><td> BD pharmingen </td><td> 550315 </td><td></td></tr><tr><td> 단클론 마우스 반 인간 CD90/FITC </td><td> Daka </td><td> 00034418 </td><td></td></tr><tr><td> PE 마우스 반 인간 CD73 </td><td> BD pharmingen </td><td> 550257 </td><td></td></tr><tr><td> 안티-H CD105/Endoglin PE </td><td> BD pharmingen </td><td> FAB10971P </td><td></td></tr><tr><td> PE 마우스 반 인간 CD11b/Mac1 </td><td> BD pharmingen </td><td> 5553888 </td><td></td></tr><tr><td> CD44 PE 마우스 반 인간 </td><td> BD pharmingen </td><td> 555479 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염 완충 용액 (PBS) </td><td> GIBCO </td><td> 003000 </td><td></td></tr><tr><td> 70 μm 세포 스트레이너 </td><td> 매 </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td&gt; 0.2 μm 주사기 필터 </td><td> Millex-GV </td><td> SLGV033RB </td><td></td></tr><tr><td> 25cm 두 문화 플라스크 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> Z707481 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> BD FACSCalibur </td><td> BD </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> multiskan microplate 분광 광도계 </td><td> 열 과학 </td><td> 51119200 </td><td></td></tr><tr><td> Fleurcense 현미경 </td><td> 하늘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 소프트웨어 버전 2.3.1을 흐르는 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

<p class="jove_content"&gt; 개발 사랑니는 일상적인 교정 치료를하여 얻을 수있는 성인 중 줄기 세포의 쉽게 액세스 할 수있는 소스입니다. 인간 펄프 유래 줄기 세포는 (hDPSCs) 성인 줄기 세포의 일반 소스로 비교 멀티 혈통 차별화 용량 높은 확산 가능성을 가지고<sup&gt; 1-8</sup&gt;, 따라서 hDPSCs는 조직 공학 및 재생 의학에서 autologous 이식을위한 좋은 후보자가 될 수 있습니다. 이러한 혜택과 함께, 이러한 immunolodulatory 효과로 중간 엽 줄기 세포 (MSC) 기능을 가진, 심지어 allograft 이식의 경우, hDPSCs 더 가치가<sup&gt; 6,9,10</sup&gt;. 따라서 줄기 세포의 소스를 사용하기위한 기본 단계는 펄프 조직에서 hDPSCs를 분리에 가장 적합한 프로토콜을 선택하는 것입니다. 이러한 목표를 달성하기 위해서는, 이러한 공통의 표면 마커 및 또한 차별화 능력 등 다양한 세포 행동에 다양한 절연 조건의 효과를 조사하기 위해 매우 중요합니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 따라서, 우리가 영향을 셋째 어금니 치아에서 인간의 펄프 조직을 분리하고 분리 hDPSCs을위한 문학을 바탕으로 기존의 프로토콜 모두를 사용<sup&gt; 11-13</sup&gt;<em&gt; 즉,</em조직 explants에서&gt; 효소 펄프 조직의 분리 (DPSC-ED) 또는 가지 (DPSC-OG). 이있어서, 우리는 치과 다이아몬드 디스크를 사용하여 절연 방법을 용이하게하려고했습니다. 그런 다음,이 세포는 CD146 있으며, STRO-1과 같은 stromal - 관련 마커 (CD73, CD90, CD105 및 CD44), 조혈 / 내피 마커 (CD34, CD45 및 CD11b), perivascular 마커의 측면에서 특징. 그 후,이 두 프로토콜은 정량 중합 효소 연쇄 반응 (QPCR) 및 알리자린 레드 얼룩 모두에 의해 odontoblasts에 차별화의 효력에 따라 비교했다. QPCR은 mineralization 관련 유전자의 표현 (; 알프, 매트릭스 세포 phosphoglycoprotein, MEPE 및 상아질 sialophosphoprotein, DSPP 알칼리성 인산 가수 분해 효소)의 평가를 위해 사용되었습니다.<sup&gt; 14</sup</p

<ol><li> 효소 분해 (DPSC-ED)에 의해 획득 된 DPSCs는 하루에 10 15,18 (그림 1)에서 여기에 표시됩니다. 분리 한 후 거의 3-5일에 형성 시작 식민지가. </li><li> 능가 DPSCs (DPSC-OG)는 5 일, 10, 13 &amp; 18 일 그림 2에 표시됩니다. 세포가 병렬 심는 후 약 5 일까지 주문에 의해 펄프 조직에서 병으로 마이그레이션하기 시작 섬유 아세포과 같은. </li><li> 두 방법을 사용하여 통로 3 DPSCs은 그림 3에 표시됩니다. DPSCs 두 종류의 같은 크기 및 형태에 거의이었다. </li><li> DPSC-ED 및 DPSC-OG (그림 4)의 결과를 Immunophenotyping.이 결과는 CD44, CD73, CD105 및 CD90과 같은 중간 엽 줄기 세포의 마커의 존재, 그리고 CD34, CD45 및 CD11b와 같은 조혈 및 내피 마커의 부재를 기재 . CD105 및 CD146...

방법 중 하나를 사용하여 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 (hDPSCs)의 분리 및 특성 설명<strong펄프&gt; 효소 분해 (DPSC-ED)</strong&gt; 또는<strong펄프 조직 explants에서 줄기 세포&gt; 직접 가지 (DPSC-OG). 그런 다음</strong&gt;<em&gt; 체외에서</emodontoblasts에 hDPSCs 두 종류의&gt; 비교 차별화.

발육 중인 사랑니는 성인기 동안 줄기세포를 쉽게 얻을 수 있는 공급원이며, 이는 일상적인 치과 교정 치료를 통해 확보할 수 있습니다. 인간의...

이 절차의 전반적인 목적은 두 가지 방법을 사용하여 영구치로부터 인간 치수 줄기세포를 분리, 특성화 및 분화시키는 것입니다. 이는 건강한 매복 사랑니를 수집한 후, 우선 백세질-법랑질 경계 부위 주변을 절단함으로써 수행됩니다. 치수 줄기세포인 DPSCs는 두 가지 서로 다른 방법을 통해 분리됩니다.첫 번째 방법에서는 polyp 조직을 collagenase type one과 disc space solution에 넣고 배양하여 효소적으로 소화시킵니다. 여기서는 이를 ed라고 부릅니다. 두 번째 방법의 분리 방식에서는 palp 조직을 소화 과정 없이 플라스크에 바로 넣습니다.이러한 방식으로 dpss는 조직에서 플라스크로 이동하기 시작합니다. OG라고 불리는 이 세포들은 외성장 분리법(outgrowth isolation method)을 의미합니다. 절차의 두 번째 단계는 유세포 분석법(flow cytometry)을 이용한 줄기세포의 식별입니다.절차의 세 번째 단계는 odontoblast 분화 유도이며, 마지막 단계는 Alizarin Red 염색과 qPCR을 통해 두 그룹 간의 odontoblast 분화를 비교 평가하는 것입니다. 저는 Rian Institute 줄기세포 및 발생생물학과 소속의 RA Kde입니다. 오늘은 두 가지 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기세포의 분리, 특성 분석 및 비교 분화 과정을 보여드리겠습니다.안녕하세요, Rio 연구소의 Rezaian 박사입니다. 저희는 인간 치수 줄기세포와 관련된 프로젝트를 진행하고 있습니다. 이 세포들은 일종의 중간엽 줄기세포로, 통증과 이환율을 최소화하여 쉽게 얻을 수 있다는 장점이 있습니다.중배엽 줄기세포는 가소성 있는 분화 능력, 콜로니 형성 및 다분화 능력을 통해 특성화됩니다. 안녕하세요, 줄기세포학과의 Ami 박사입니다. 저희 연구소에서는 연구 및 향후 응용을 목적으로 줄기세포를 분리하기 위해 실험실에서 이 절차를 사용하고 있습니다.재생 의학에서 향후 줄기세포 기반 치료를 위해 이러한 줄기세포원을 사용하기 위한 첫 번째 단계는 인체 조직에서 줄기세포를 분리하기 위한 최적의 프로토콜을 선택하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해서는 서로 다른 줄기세포 분리 조건하에서의 세포 행동의 특정 측면을 조사하는 것이 매우 중요합니다. 먼저, 치수 조직의 효소적 해리 또는 조직 이식편으로부터의 줄기세포 외성장법을 사용하여 인간 치수 줄기세포를 분리하겠습니다.그 다음, 이를 특성화하고 오겐 블라스트(ogen blast)로 분화시킵니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 먼저, space와 collagenase Type one을 각각 PBS에 용해합니다.그 후 0.2 micron 시린지 필터를 사용하여 여과합니다. 두 용액을 모두 원추형 튜브(conical tube)에 옮깁니다. 그런 다음 pener와 PBS를 첨가하여 최종 농도를 맞춥니다.건강한 사랑니를 멸균 조건 하에서 차가운 기본 배지에 담아 실험실로 운반하십시오. 분석 전 70% ethanol로 치아 표면을 세척하십시오. 치아 표면의 이물질이 완전히 제거되었는지 확인하십시오.멸균된 치과용 디스크를 사용하여 백시질-법랑질 경계(cement enamel junction) 부위의 치아를 절단하여 치수강을 노출시킵니다. 치과 조직의 과열을 줄이기 위해 절단 과정은 천천히 수행해야 합니다. 그런 다음 Scarpa 블레이드를 사용하여 치수 조직을 치관에서 부드럽게 분리하고, 치수 조직을 1~2mm 크기의 조각으로 나눕니다.작은 치수 조직 조각들을 1 mL의 효소 용액에 넣고 37 °C에서 1시간 동안 배양하며, 치수 조직의 분해를 돕기 위해 30분마다 vortex를 수행합니다. 그 후, 70 µm 셀 스트레이너(cell strainer)에 통과시켜 큰 응집물을 제거합니다. 그런 다음 PENER가 포함된 PBS를 첨가하고 1,200 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그 다음 플레이트를 증식 배지에 현탁하여 배양 플라스크로 옮기고 배지를 추가합니다. 이후 배양합니다.아웃워크(outwork) 방법을 위해 세포 합류도(confluence)가 달성될 때까지 3일마다 배지를 교체하십시오. 절단 과정을 반복합니다. 치아 절단 후에는 조직을 1~2mm 크기의 조각으로 분쇄합니다.그다음 이를 배양 접시에 넣습니다. 증식 배지를 빠르게 채우고 배양합니다. 세포가 추가로 증식하여 퍼져 나갈 수 있도록, 증식 배지의 총 부피가 모든 조각의 부착을 지원할 수 있는 수준이어야 함을 고려해야 합니다.세포 성장을 관찰한 후, 세포 합류(confluence)가 이루어질 때까지 3일마다 배지를 교체하십시오. 면역표현형 분석을 위해, 두 종류의 D PSCs를 PE 또는 FITC가 접합된 항체와 함께 4°C의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음 PBS를 첨가하고 1,200 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 PBS로 플레이트를 세척한 후, 유세포 분석기를 사용하여 표면 마커를 평가합니다. 두 종류의 DPC를 3세대까지 계대 배양합니다. 그 다음 트립신을 처리하고 60% 밀도로 6개의 적색 배양 접시에 분주한 후, PM을 치성 분화 배지로 교체합니다. 3개의 웰은 PM을 첨가하여 음성 대조군으로 유지합니다.3일마다 배지를 교체하고, 21일째에 PBS로 세포를 세척하십시오. 그 후 웰당 1mL의 10% 포름알데히드(formal gel height)를 사용하여 상온에서 15분 동안 고정하십시오.15분 후, 고정액을 조심스럽게 제거하고 증류수로 세포를 3회 세척합니다. 그런 다음 물을 1mL의 red alza 적색 염색액으로 교체합니다. 20분 후, 과량의 염료를 제거하고 탈이온수로 세포를 4회 세척합니다.그 후 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 웰당 1 mL의 물을 추가합니다. 염색 후 현미경으로 관찰하면 대조군과 비교하여 세 개의 상단 레일이 붉은색으로 변한 것을 확인할 수 있으며, 고배율로 세포 주변의 염색 색소 흡수 양상을 관찰하여 붉은색 염색 정도를 정량화할 수 있습니다. 물을 제거한 후, 웰당 1 mL의 10% 아세트산을 추가하고 흔들어주며 30분 동안 배양합니다.그다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 부드럽게 긁어냅니다. 그런 다음 이를 각각의 튜브로 옮깁니다. 30초 동안 격렬하게 볼텍싱(VOR)합니다.그다음 85 °C에서 10분 동안 가열합니다. 증발을 방지하기 위해 튜브를 파라필름으로 밀봉한 후 얼음에 5분 동안 둡니다. 이후 20,000 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다. 그동안 실험 프로토콜에 따라 알리자린 레드 표준 연속 희석액을 조제합니다.원심분리 후, 상층액을 제거하여 새 튜브로 옮깁니다. 10% ammonium hydrocyte를 사용하여 pH를 중화합니다. 그 다음, 표준 시료와 검체를 96-well 플레이트에 첨가합니다.웰 플레이트에 분주한 후 405 nanometer에서 흡광도를 측정하고 표준 연속 희석법에 따라 데이터를 분석합니다. 여기서는 10일, 15일 및 18일에 효소 해리를 통해 분리한 DPSCs와 5일, 10일, 13일 및 18일에 외성장(outgrown)시킨 DPSCs를 볼 수 있습니다. 단계 3의 두 DPSC 유형은 크기와 형태가 거의 동일합니다. 면역표현형 분석 결과, CD 44, CD 73 및 CD 19와 같은 중간엽 줄기세포 마커는 존재하며, CD 34, CD 45 및 CD 11 B와 같은 조혈 및 내피 마커는 부재함을 보여줍니다. 흥미롭게도, CD 1 0 5와 CD 146의 발현은 DPSCED에 비해 외성장된 DPSCs에서 더 높게 나타납니다. 오돈토블라스트(odontoblast) 분화 21일째의 Alizarin Red 염색 정량 결과, DPSCED가 외성장되지 않은 줄기세포에 비해 더 많은 칼슘 침착을 보임을 알 수 있습니다.QPCR 결과는 또한 D-P-S-C-D에서 무기질화 마커인 MEP 및 ALP의 발현이 유출성 치아 줄기세포에 비해 유의하게 더 높음을 나타냅니다. 한편, 두 유전자 모두 분화 과정 동안 조절되었으며, 치성 마커인 DSPP의 발현 또한 분화 과정 동안 증가했습니다. 그러나 ED 그룹과 OG 그룹 간의 분화된 세포에서 DSPP의 발현에는 유의미한 차이가 없었습니다.지금까지 치수 조직의 효소적 해리 또는 조직 절편으로부터의 줄기세포 외성장을 이용하여 인간 치아 유래 줄기세포를 분리하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 여러분의 실험에 이 절차를 성공적으로 적용하시길 바랍니다.감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜 인간의 치과 여 포에서 추출한 치아 줄기 세포의 변이 유전 공학에 설명 합니다. 적용된 비 바이러스 성 수정 전략 치료 줄기 세포 제품의 개선 위한 기초 될 수 있습니다.

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

우리 치과 펄프에서 격리 된 중간 엽 줄기 세포와 공동 문화를 직접 및 간접 방법에 따라 전립선 암 세포 상호 작용의 평가 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 조건 매체 및 트랜스-잘 막 간접 paracrine 활동 분석에 적당 하다. 차동 시드 직접 셀 상호 작용에 대 한 적절 한 모델입니다 함께 셀 스테인드.

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

여기 우리는 프리온 단백질 표정 신경 분화 과정을 평가 하기 위해 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 분리 및 전파에 대 한 프로토콜을 제시.

절연, 전파, 그리고 인간의 치과 펄프의 줄기 세포의 신경 분화 동안 프리온 단백질 표정

이 프로토콜은 생체 외에서췌장 계보로 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 두 가지 다른 유도 프로토콜 사이의 비교를 제시합니다 : 통합 프로토콜 및 비 통합 프로토콜. 통합 프로토콜은 더 많은 인슐린 생산 세포(IPC)를 생성합니다.

시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도

현재 프로토콜은 지속적으로 성장하는 마우스 절개, 마우스 어금니 및 인간 치아로부터 단세포 RNA-seq 분석에 적합한 단일 세포를 격리하는 빠르고 효율적이며 부드러운 방법을 제시합니다.

마우스와 인간의 치아에서 단일 세포의 신속한 격리

이 논문은 외식물 배양 방법을 사용하여 치수 줄기세포의 1차 배양을 확립하고 ICSCRT 지침에 따라 이러한 세포의 특성을 분석하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜에 의해 분리된 세포는 추가 응용을 위한 중간엽 줄기 세포로 간주될 수 있습니다.

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이 프로토콜은 효소 소화를 통해 치수에서 다분화능 줄기 세포의 추출, 배양 및 보존을 강조합니다. 또한 조골세포, 지방세포 및 연골세포로 분화할 수 있는 잠재력을 보여주며 공정에서 정밀도와 일관성의 중요성을 강조합니다.

Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth(인간 낙엽 및 영구치에서 치과용 치수 줄기 세포의 분리, 배양 및 특성화)

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환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

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직접 인체 조직에서 암 줄기 세포 (암줄 기세포)의 분리는 생물학적 특성 분석을위한 필수입니다. 또한 어려운 단계를 문제 해결에 대한 팁을 제공하면서이 원고는, 인간의 조직에서 전립선 암줄 기세포의 분리를위한 방법을 설명합니다.

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