인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

이 절차의 전반적인 목표는 두 가지 방법을 사용하여 영구치에서 인간 이방인 맥박 줄기 세포를 분리, 특성화 및 구별하는 것입니다. 이것은 건강한 매복 사랑니를 수집하여 처음에 시멘트 주위에서 법랑질 접합부로 절단함으로써 달성됩니다. 치과용 폴리 줄기세포 D PSC는 두 가지 다른 방법으로 분리됩니다.

첫 번째 방법에서는 콜라겐분해효소 유형 1 플러스 디스크 공간 용액에서 배양하여 폴립 조직을 효소로 소화합니다. 여기서는 ed라고 합니다. 두 번째 방법의 분리 방법을 고려할 때, 손바닥 조직은 분해되지 않고 플라스크에만 배치됩니다.

이러한 방식으로 dpss는 조직에서 플라스크로 이동하기 시작합니다. OG라고 명명된 이러한 세포는 외성장 격리 방법을 나타냅니다. 절차의 두 번째 단계는 가을 세포 분석을 사용하여 줄기 세포를 식별하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 odontoblast 분화 유도이며, 절차의 마지막 단계는 red staining 및 QBCR에 의한 두 그룹 간의 odontoblast 분화를 비교 평가하는 것입니다. 저는 Rian Institute의 줄기세포 및 발달 생물학과의 RA Kde입니다. 오늘은 두 가지 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기세포의 분리 특성화와 비교 분화를 보여드리려고 합니다.

안녕하세요, 저는 Rio Institute의 Rezaian 박사입니다. 우리는 인간 치아 치수 줄기 세포와 관련된 프로젝트를 진행하고 있습니다. 이 세포는 일종의 메키 줄기 세포로, 최소한의 통증과 이환율로 쉽게 얻을 수 있습니다.

Mechy 줄기 세포는 플라스틱 아란 능력, 군체 형성 및 다중 분화 능력을 나타냅니다. 안녕하세요, 줄기세포학과의 아미 박사님입니다. 연구소에서는 연구실에서 이 절차를 사용하여 연구 및 향후 응용 프로그램을 위해 줄기세포를 분리합니다.

재생 의학에서 미래의 줄기세포 기반 치료를 위해 이 줄기세포 공급원을 사용하기 위한 첫 번째 단계는 인간 조직에서 줄기세포를 분리하기 위한 최상의 프로토콜을 선택하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해서는 다양한 줄기세포 분리 조건에서 세포 행동의 특정 측면을 조사하는 것이 중요합니다. 먼저, 치수의 효소 해리 또는 조직 임플란트에서 줄기 세포의 파생물을 사용하여 인간 치아 치수줄기세포를 분리할 것입니다.

그런 다음 ogen blast로 특성화하고 구별합니다. 시작하겠습니다. 첫 번째 방법은 공간과 콜라겐 분해 효소 유형 1이 모두 PBS에 용해된다는 것입니다.

그런 다음 oh 0.2 미크론 주사기 필터를 사용하여 필터링합니다. 둘 다 원뿔형 튜브로 당깁니다. 그런 다음 pener와 PBS를 추가하여 최종 농도를 달성합니다.

건강한 사랑니를 강철 상태에서 차가운 염기성 매체로 실험실로 옮깁니다. 공부하기 전에 70% 에탄올로 치아 표면을 청소하십시오. 치아 표면에서 불어오는 바람을 꼭 닦아내십시오.

멸균된 치과 디스크를 사용하여 시멘트 에나멜 접합부 주위의 치아를 잘라 치수실을 드러냅니다. 치아 조직의 과열을 줄이기 위해 절단 과정을 천천히 수행해야 한다는 점을 고려해야 합니다. 그런 다음 크라운에서 치수 조직을 부드럽게 분리하여 Scarpa 블레이드를 사용하여 치수 조직을 1-2mm 조각으로 만듭니다.

치수(pq) 조직을 분해하는 데 도움이 되도록 30분마다 섭씨 37도의 소용돌이에서 1시간 동안 작은 치수조직 조각을 1밀리리터 효소 용액으로 옮깁니다. 그런 다음 70 미크론 세포 균주를 통과시켜 큰 응집체를 제거합니다. 그런 다음 PENER 원심분리기가 포함된 PBS를 1, 200RPM에서 5분 동안 추가합니다.

슈퍼넷을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 증식 매체 pm에 플레이트를 매달아 배양 플라스크로 옮기고 배지를 추가합니다. 그런 다음 배양하여 배양합니다.

outwork 방법에 대한 세포 합류점이 달성될 때까지 3일마다 배지를 교체하십시오. 절단 과정을 반복합니다. 치아를 자른 후에는 조직을 1-2mm 조각으로 팝하는 것을 의미합니다.

그런 다음 그들을 문화에 배치하십시오. 증식, 매체 및 배양된 플래시. 증식 배지의 총 부피는 세포가 더 이상 자라지 않도록 모든 조각의 부착을 지원해야 한다는 점을 고려해야 합니다.

성장(outgrowth)을 관찰한 후 배지를 교체하고 세포 합류(cell confluence)가 이루어질 때까지 3일마다 배지를 교체합니다. 면역표현형 분석을 위해 두 가지 유형의 D PSC를 PE 또는 FITC 접합 항체와 함께 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 5분 동안 1, 200RPM에서 PBS 및 centi 보기를 추가합니다.

상층액과 resus를 제거하고 PBS에 플레이트를 현탁시킨 다음 마지막으로 3가지 계대에 대한 두 가지 유형의 DPC인 유세포 분석기 계대배양을 사용하여 표면 마커를 평가합니다. 그런 다음 얼음을 트립하고 60% Co 유창성에서 6개의 붉은 배양 접시로 옮기고 PM을 치아 생성 배지로 대체합니다. 3개의 well은 pm을 추가하여 negative control로 유지됩니다.

3일마다 배지를 교체하십시오.21일째 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 우물당 1밀리리터씩 고정하십시오. 가정 온도에서 15분 동안 10%포멀 젤 높이.

15분 후 정착액을 조심스럽게 제거하고 증류수로 세포를 3회 감습니다. 그런 다음 붉은 얼룩 용액에 붉은 알자당 1밀리리터씩 물을 교체하십시오. 20분 후, 과도한 염료를 제거하고 탈이온수로 세포를 4번 세척합니다.

그런 다음 세포가 마르는 것을 방지하기 위해 우물물 당 1mm를 추가합니다. 염색 후 현미경 아래의 대조군에 비해 3개의 상향 레일이 빨간색으로 변하는 것을 볼 수 있으며, 빨간색 염색의 정량화를 위해 큰 배율로 세포 주변의 염색 색상 흡수를 볼 수 있습니다. 물을 제거한 후 우물당 1밀리리터, 산성 10%를 첨가한 후 흔들면서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 부드럽게 긁어냅니다. 그런 다음 별도의 튜브로 옮깁니다. VOR은 30초 동안 격렬하게 소모됩니다.

그런 다음 섭씨 85도까지 10분 동안 가열합니다. 증발 물개 관을 5 분 동안 얼음에 ParaView 이동 관을 피하기 위하여는, 그들은 20, 000 G에 15 분 동안 사용했다. 한편, 지역 프로토콜에 따라 알츠하이머 레드 표준 직렬 희석을 만듭니다.

원심분리 후 스내트를 제거하고 새 튜브로 옮깁니다. 10%암모늄 하이드로세포로 pH를 중화합니다. 그런 다음 표준물질과 샘플도 96에 추가합니다.

웰 플레이트는 405나노미터에서 흡광도를 측정하고 표준 직렬 희석에 따라 데이터를 분석합니다. 여기에서 10일, 15일, 18일째에 효소 해리에 의해 격리된 DPC를 볼 수 있으며, 5일, 10일, 13일, 18일에는 DPC보다 더 자란 DPC를 볼 수 있습니다. sase three에서 두 가지 유형의 dpss는 거의 동일한 크기와 형태를 가지고 있습니다 면역 표현형 분석 결과는 CD 44, CD 73 및 CD 19와 같은 중간엽 줄기 세포 마커의 존재와 CD 34, CD 45 및 CD 11 B와 같은 조혈 및 내피 마커의 부재를 보여줍니다.흥미롭게도, CD 1 0 5 및 CD 146의 발현은 D-P-S-C-E-D에 비해 자란 d PSC에서 더 많습니다. Odontoblast 분화 21일째에 효소 적색 염색을 정량화한 결과, 치아가 없는 줄기세포에 비해 D-P-S-C-E-D에서 칼슘 침착이 더 많이 나타났습니다.

QPCR 결과는 또한 줄기세포의 발현과 비교하여 D-P-S-C-D에서 광물화 마커로 MEP 및 A LP의 발현이 유의하게 높다는 것을 나타냅니다. 한편, 두 유전자 모두 분화 과정에서 조절되며, 분화 과정에서 치아 형성 마커(odontogenic marker)가 증가함에 따라 DSPP의 발현도 조절됩니다. 그러나 ED와 OG 그룹 간의 분화된 세포에서 DSVP의 발현에는 큰 차이가 없습니다.

우리는 방금 치수의 효소 해리 또는 조직 엑스플랜에서 줄기 세포의 성장을 사용하여 인간 치아 부위 줄기 세포를 분리하는 방법을 보여 드렸습니다. 그게 다야. 실험에서 이 절차를 사용해 보는 행운을 빕니다.

감사합니다.