신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

본 절차의 전체적인 목표는 질환이 있는 인간 심실 표본으로부터 생존 가능한 심근세포를 분리하고 이들의 기능적 변화를 특성화하는 것입니다. 이를 위해 먼저, 과도한 조직 분해와 세포 손상을 방지하고자 얼음처럼 차가운 심정지액 내에서 신선한 심실 샘플을 신속하게 수집하고 잘게 다집니다. 두 번째 단계는 맞춤형 소화 장치와 효소 용액을 사용하여 심근 덩어리를 단계적으로 소화시키는 것입니다.

6회 cycle 동안, 각 cycle마다 완충액이 포함된 세포를 튜브에 수집하고 세포 보존액으로 희석합니다. 마지막 단계는 기능적 특성 분석을 수행하기 위해 6개의 튜브에 담긴 세포를 정상 칼슘 농도의 표준 생리식염수 소량에 재현탁하는 것입니다. 최종적으로, 활동 전위의 패치 클램프 기록과 형광 염료를 이용한 세포 내 칼슘의 동시 평가를 통해 비후성 심근증 환자의 심근세포에서 나타나는 활동 전위 기간 및 세포 내 칼슘 사이클링의 변화를 보여줍니다.

표준 덩어리 소화법(chunk digestion method)과 같은 방법과 비교했을 때 DYS의 주요 장점은 효소 용액과 함께 실리콘 스크레이퍼를 통해 다양한 세포의 공동 해리를 가능하게 하는 맞춤형 소화 장치를 사용한다는 점입니다. 이 방법은 심장 질환과 관련된 잘 알려진 분자적 및 구조적 리모델링이 어떻게 단일 심근세포의 변화로 나타나는지, 그리고 이를 우리 방법으로 분석하고 특정 약물로 표적화할 수 있는지와 같은 심장학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 따라서 이 기술의 적용 범위는 비후성 심근병증과 같은 유전성 심장 질환의 치료까지 확장됩니다.

실제로 이 방법은 심장 수술을 받은 비대성 또는 허혈성 심장 질환 환자의 심실 심근세포를 대상으로 새로운 신경병성 접근법을 테스트하는 데 사용될 수 있습니다. 저희는 심장 수술 중 얻은 인간 동맥 표본과 심실 생검 조직 사이의 유사성을 비교하던 중 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 50 mL 튜브에 Cardioplegic 용액 40 mL를 붓고 얼음에 보관하여 수술실에서 세포 분리 실험실까지 표본을 운송함으로써 이 절차를 시작하십시오. 표본을 실험실 구역으로 신속하게 옮겨 표본 적출 후 10분 이내에 표본 처리를 시작하십시오.

절제 직후 수술실에서 다음의 집단 심실 심근 시료를 수거합니다. 이를 얼음처럼 차가운 CP 용액으로 세척하고, 시료를 차가운 CP 버퍼 상태로 유지하며 튜브에 보관합니다. 이후 미세 가위를 사용하여 심내막 섬유화 층을 조심스럽게 제거합니다.

심근 조직을 2~3mm 길이의 작은 조각으로 자르며, 각 분리 작업당 심실 심근의 총량은 100mg에서 1g 사이가 되도록 합니다. 조각들을 소화 장치의 스크레이핑 챔버로 옮긴 후, 챔버 내의 CP 버퍼를 차가운 칼슘 무첨가 해리 버퍼(calcium free dissociation buffer)로 교체합니다. 그 다음 소화 장치를 항온 수조에 넣습니다.

항온수조를 37.5 °C로 설정하고 전원을 켭니다. 다음으로 소화 장치의 모터를 켜고 회전 속도를 초당 1회전으로 설정합니다. DB로 세척 과정을 3회 수행하며, 8분마다 챔버 내의 용액을 37 °C의 산소 포화된 깨끗한 DB로 교체합니다.

그 후, DB 용액에 250 units/mL의 collagenase type five와 4 units/mL의 protease type 24를 첨가하여 효소 버퍼 1을 준비합니다. 그다음 250 units/mL의 collagenase를 첨가하여 효소 버퍼 2를 준비합니다.

DB 솔루션 산소화 EB 1을 5분 동안 주입하고 37 °C까지 가온합니다. 그 후, 37 °C에서 100% 산소화된 EB 1 3 mL를 사용하여 회전식 소화 장치에서 12분간 소화 사이클을 2회 수행합니다. 각 사이클이 끝날 때마다 피펫 흡입으로 솔루션을 제거하여 폐기합니다.

다음으로, 세포 수집을 위한 15 mL 튜브 6개와 완충액 용출을 위한 4 °C의 craft brew 용액 80 mL를 준비하고, 산소화된 EB 2를 준비하여 37 °C까지 가온합니다. 이어서, 37 °C에서 100% 산소화된 EB 2 3 mL를 사용하여 첫 번째 15분 소화 사이클을 수행합니다. 소화 사이클 후, 첫 번째로 분리된 근세포가 포함된 용액을 15 mL 튜브에 수집하고, 세포 현탁액을 차가운 KB 용액 12 mL로 희석합니다.

튜브를 실온에서 평평하게 보관하고, 3 mL의 EB 용액을 사용하여 37 °C에서 12분간의 소화 사이클을 5회 더 수행하며, 각 사이클마다 근세포가 포함된 완충액을 15 mL 원추형 튜브에 수집하십시오. 또한 각 사이클에서 수집한 3 mL의 완충액을 12 mL의 KB 용액으로 희석해야 함을 기억하십시오. 마지막으로, 세포가 포함된 6개의 튜브를 실온에 보관하십시오.

이 단계에서는 20 mL의 칼슘 제거 Tyro 완충액에 1 mg/mL bovine serum albumin을 첨가합니다. 그다음 용액을 여과한 후, 심근세포가 들어 있는 6개의 원심분리관을 100×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 심근세포를 침전시킨 후, 상청액을 제거하고 실온에서 각 튜브의 세포를 BSA가 포함된 TB의 가변적인 양으로 재부유시킵니다.

첫 번째와 두 번째 단계에서 100 mM CaCl₂ 용액을 소량씩 첨가하여 완충액이 포함된 세포 내의 칼슘 농도를 점진적으로 높입니다. 칼슘 농도는 각각 50 µM 및 100 µM까지 올립니다. 이후의 칼슘 첨가 단계는 5분마다 수행하며, 각 단계마다 농도를 100 µM씩 높여 최종 농도인 0.9 mM에 도달하게 합니다.

분리 절차의 수율을 평가하려면, 심근세포가 포함된 용액 0.5 milliliters를 현미경의 유리 바닥 챔버로 옮깁니다. 10 x 대물렌즈 배율에서 15개의 현미경 시야를 평가하고, 뚜렷한 가로무늬가 있고 유의미한 봉입체가 없는 막대 모양의 세포와 같이 건강한 심근세포의 백분율을 계산합니다. 활동 전위와 세포 내 칼슘 플럭스의 동시 기록을 포함한 인간 심근세포의 기능 평가를 입증하기 위해 예상 수율은 약 20%여야 합니다.

먼저, perforated patch 구성의 패치 클램프 실험을 위한 피펫 용액을 준비합니다. 그다음, calcium free tb에 1.8 millimolar의 calcium chloride를 첨가합니다. 이 용액을 패치 클램프 형광 실험 중 심근세포의 superfusion에 사용합니다.

다음으로, 세포 현탁액 1 mL를 1.5 mL 튜브로 옮기고 10 µM/L flu fort와 10 µL의 power load를 첨가합니다. 튜브를 수평으로 눕힌 상태에서 실온에서 30분 동안 배양하며 농축합니다. 그 후, 튜브를 수직으로 세워 5분 동안 세포가 가라앉도록 둡니다.

그 다음 상층액을 파이펫으로 제거하고, 세포 펠렛을 칼슘이 포함된 tb에 재현탁합니다. 세포 현탁액 25 milliliters를 온도가 제어되는 소형 현미경 장착 기록 챔버로 옮깁니다. 37 °C에서 0.3 milliliters per minute의 유속으로 가열된 마이크로 퍼퓨전 시스템을 통해 중력으로 퍼퓨전합니다.

마이크로 피펫 풀러를 사용하여, ps를 채웠을 때 팁 직경이 3~5 µm이고 저항이 3~4.5 MΩ인 패치 클램프 피펫을 준비합니다. 그 후, PS에 amphotericin B를 250 µg/mL 농도로 첨가하여 전극을 채운 다음, 피펫 홀더에 전극을 장착합니다. 이어서, 뚜렷한 줄무늬가 있고 봉입체가 없는 Ron 모양의 세포를 선택합니다.

기가실(giga seal)을 형성하고 접근 저항이 20 ohm 미만으로 떨어질 때까지 5~10분 동안 기다립니다. 그 후, 서로 다른 빈도의 짧은 자극 펄스를 사용하여 전류 클램프(current clamp) 모드에서 활동 전위를 유도합니다. 기록 단계 동안 492 nanometers에서 명시야 조명을 켜고 505~520 nanometers에서 Fluor fort 형광을 검출합니다.

그런 다음 형광 및 막 전위 신호를 획득합니다. 이 그림은 HCM 샘플의 심실 심근세포에서 활동 전위의 변화를 보여줍니다. 여기 컨트롤 심근세포와 HCM 심근세포에서 0.2 hertz, 0.5 hertz 및 1 hertz로 유도된 대표적인 중첩 활동 전위가 제시되어 있습니다.

대조군 심근세포에서 0.5 hertz로 측정된 중첩된 활동 전위입니다. 10⁻⁷ M isoproterenol이 없을 때와 있을 때의 결과가 나타나 있으며, 여기에는 조기 후탈분극(early after depolarizations)의 여러 자발적 탈분극이 나타난 HCM 환자의 심근세포 막전위 대표 트레이스가 제시되어 있습니다. 이 그림은 HCM 샘플의 심실 심근세포에서 칼슘 트랜지언트(calcium transient)의 변화를 보여줍니다.

다음은 대조군 심근세포와 HCM 세포에서 패치 피펫을 통해 0.2 hertz로 자극했을 때 유도된 대표적인 중첩 칼슘 과도 현상(calcium transient)입니다. 서로 다른 시간대에서의 HCM 및 대조군 심근세포의 칼슘 과도 현상 역학이 나타나 있으며, 세 가지 서로 다른 주파수로 자극하는 동안의 세포 내 칼슘을 보여주는 대표적인 장기 추적 기록이 제시되어 있습니다. 이는 HCM 심근세포에서 높은 페이싱 속도일 때 이완기 칼슘이 증가함을 강조합니다. 이 그림은 인간 심실 심근세포를 이용한 추가적인 실험 적용 사례를 보여줍니다.

서로 다른 막전압에서 기록된 L-타입 칼슘 전류를 보여주는 대표적인 중첩 트레이스가 왼쪽에 표시되어 있으며, HCM 샘플에서 분리한 18개 세포의 막전압별 평균 L-타입 칼슘 전류 피크 밀도가 오른쪽에 표시되어 있습니다. 또한, 1 Hz의 전기장 자극 동안 심실근세포에서 기록된 세포 내 칼슘 트레이스가 여기에 제시되어 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 시료의 신선도를 보장하기 위해 수술실에서 검체를 수집한 직후에 절차를 시작하는 것이 중요합니다. 이 절차를 통해 인간 심실 심근세포를 분리하십시오. 라이브 셀 컨포컬 현미경 관찰이나 면역 화학 분석과 같은 다른 방법들도 수행할 수 있으며, 이는 예를 들어 심장 질환의 진행 과정에서 막 구조와 칼슘 방출 단위의 세포 내 국소화가 어떻게 변화하는지와 같은 근본적인 질문에 답하는 데 결정적인 역할을 할 것입니다.

이 기술은 세포 심장학 분야에서 심실 심근세포의 기능적 이상을 연구하고 새로운 치료 옵션의 잠재적 효용성을 테스트할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 인간 시료에서 생존 가능한 단일 심근세포를 분리하는 방법과 다양한 조건에서 세포 기능을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.