Name: 신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: 학습하세요 신선한 수술 샘플에서 생존 가능한 심실 심근세포를 분리하고 기능적 특성을 분석하는 방법을. 효소 소화와 맞춤형 소화 장치를 사용하여 심근 기능 연구 및 약물 테스트에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 EU (STREP 프로젝트 241577 &quot;큰 마음,&quot;제 7 회 유럽 프레임 워크 프로그램, CP), MENARINI 국제 운영 룩셈부르크 (AM), 텔레 톤 GGP07133 (CP)과 길르앗 과학 (AM)에 의해 지원되었다.

인체 조직에 대한 실험 프로토콜은 Careggi 대학 병원 (, 2009 년 갱신 2006 / 0024713)의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 각 환자는 서면 동의서를 주었다. 1. 솔루션 및 장비 제조 용액은 표 1에 기재되어있다. 세포 격리 절차의 간략화 흐름도는도 1에서 발견된다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 해결 </td><td> CP </td><td> DB </td><td> KB </td><td> TB </td><td> PS </td><td> EB1 </td><td> EB2 </td></tr><tr><td rowspan="23"> 시약 (MM) </td><td> KH 2 PO 4 </td><td> (50) </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 망초 </td><td> 8 </td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 아데노신 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> (140) </td><td> 10 </td><td> (20) </td><td> 10 </td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 만니톨 </td><td> (100) </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 타우린 </td><td> 10 </td><td> (20) </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> (20) </td><td> (20) </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td></td><td> 113 </td><td></td><td> 136 </td><td></td><td> 113 </td><td> 113 </td></tr><tr><td> 의 KCl </td><td></td><td> 4.7 </td><td> 85 </td><td> 5.4 </td><td> 25 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> MgCl2를 </td><td></td><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td></td><td> 0.6 </td><td> (30) </td><td></td><td></td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 </td><td></td><td> 0.6 </td><td></td><td></td><td></td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> 탄산 수소 나트륨 </td><td></td><td> 12 </td><td></td><td></td><td></td><td> 12 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KHCO 3 </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> NA-피루 베이트 </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> BDM </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BHBA </td><td></td><td></td><td> 5 &lt;/ TD&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 숙신산 </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> K 2 - ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 피루브산 </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 크레아틴 </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> KMES </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 115 </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> 효소 (U / ㎖) </td><td> 콜라게나 유형 V </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 250 &lt;/ TD&gt; <td> (250) </td></tr><tr><td> 단백질 분해 효소 타입 XXIV </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td></td></tr><tr><td> pH를 </td><td></td><td> 7.4 KOH </td><td> 7.3의 NaOH </td><td> 7.1 KOH </td><td> 7.35의 NaOH </td><td> 7.2 KOH </td><td> 7.3의 NaOH </td><td> 7.3의 NaOH </td></tr></tbody></table> .. 표 1 표본 수집, 세포 분리 및 근육 세포의 기능 특성 CP = 심정지 솔루션에 사용되는 솔루션; DB = 해리 버퍼; KB는 = 크래프트 - Bruhe 솔루션; TB = 타이로드 버퍼; PS = 피펫 솔루션; EB1 = 효소 버퍼 1; EB2 = 효소 완충액 2. <ol><li> 심정지 (CP) 솔루션을 준비합니다. CP 솔루션은 최대 1 주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 칼슘 2 + 무료 해리 버퍼 (DB)를 준비합니다. 이 솔루션은 일 이내에 사용해야합니다. </li><li> 크래프트 - Bruhe (KB) 솔루션을 준비합니다. KB 솔루션은 최대 1 잠깐 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다K. </li><li> 칼슘 2 + 무료 타이로드 버퍼 (TB)를 준비합니다. 이 솔루션은 일 이내에 사용해야합니다. </li><li> 사용 전에 주사기 필터를 사용하여 모든 해법 필터. </li><li> 소화 장치 (그림 2), 전기 모터에 의해 회전 중 하나는 실리콘 엘라스토머의 마주 보는 두 브러쉬, 만든 긁는 용기를 준비합니다. 소화 장치가 정의되어 있습니다. 소화 장치에 대한 세부 사항은 그림 8에있다; 장치의 이미지는 그림 2 C 및 2D에 있습니다. 70 %의 에탄올과 물과 조직 챔버를 씻으십시오. </li></ol> 심근 샘플 2. 수집 및 처리 <ol><li> 50 ML 튜브에 cardiplegic (CP) 용액 40 ㎖를 붓고는 세포 격리 실험실에 수술 방에서 표본 교통 얼음에 저장합니다. </li><li> 얼음 추위로 씻어, 즉시 절제 후 수술 방에서 심실 심근 표본을 수집CP 솔루션과 튜브에 저장합니다. 심장 수술시 상단 간 심실 중격, 가중치&gt; 100 밀리그램 절제 심 내막 표본을 사용합니다. </li><li> 급속 랩 영역으로 시험편을 전송; 시편 절단에서 10 분 이내에 시료 처리를 시작합니다. </li><li> 아이스 콜드 CP 버퍼의 표본을 유지하면서, 신중하게 실체 현미경 하에서 미세 가위를 사용하여 심 내막 섬유 성 층을 제거; 그 후, 작은 조각 (긴 2-3mm)에 심근 조직을 잘라. 조직 샘플의 크기에 따라, 각각의 분리를 위해 100 밀리그램 1g 사이의 심실의 심근의 총 금액을 잘라. </li><li> 조직 닦지 완료되면 깨끗한 얼음 차가운 CP 솔루션, 소화 장치에 심근 청크를 전송합니다. 더 이상 전체 조직의 1g 이상을 사용하지 않고, 심근 덩어리 두 개의 실리콘 브러쉬의 전체 볼륨 (3-4 ㎖)에 작성하지 마십시오. </li></ol> 3. 세탁 및 심근 덩어리의 소화 <ol><li> 선미덩어리가 소화 장치의 스크 레이 핑 챔버로 전송 어, 차가운 칼슘 2 + 무료 해리 버퍼 (DB)와 챔버의 CP 버퍼를 변경합니다. </li><li> 욕조에서 가열 된 물 (그림 1)과 접촉 될 수있는 챔버에 대한 위해, 온도 조절 욕조에 소화 장치를 놓습니다. 37.5 ° C로 목욕을 설정하고 천천히 조직 챔버의 온도를 올리기 위하여, 전원을 켜십시오. 1 회전 / 초에 회전 속도를 설정, 소화 장치의 모터의 전원을 켭니다. </li><li> 매 8 분 깨끗한 DB와 챔버 내의 용액을 변경 DB로 3 회 세척을 수행한다. DB는 (37 ° C에서)를 따뜻하게하고 산소가 심근 덩어리와 접촉 얻기 전에 포화 상태입니다. </li><li> DB 솔루션에 콜라게나 유형 V와 4 U / ㎖ 프로테아제 유형 XXIV 250 U / ㎖를 추가하여 효소 버퍼 1 (EB1)를 준비합니다. DB 솔루션에 250 U / ㎖의 콜라게나 제 유형 V를 추가하여 효소 버퍼 2 (EB2)을 준비합니다. (37 ℃)과 oxygenat 워밍업전자 EB1과 EB2. </li><li> (37 ° C에서) 100 % 산소 EB1으로 회전 소화 장치에서 소화의 두 12 분주기를 수행합니다. 각주기에서 EB1의 ~ 3 ㎖를 사용합니다. 피펫 흡인하여 솔루션을 제거하고 각 사이클 후 폐기합니다. </li><li> 세포 수집 및 ~ 버퍼를 용출 감기 (4 ° C) KB 용액 80 ㎖를 위해 6 ~ 15 ML 튜브를 준비합니다. </li><li> 37 ℃에서 3 ㎖ 100 % 산소 EB2로 처음 15 분 소화주기를 수행 소화 사이클 후, 15 ㎖의 튜브에서 제 해리 근세포를 포함하는 용액을 수집하고 12 ml의 차가운 KB 용액으로 세포 현탁액을 희석. 실온에서 튜브를 보관. </li><li> 다음 소화 사이클 동안 콜라게나 V의 농도를 반감하기 위해 DB의 동일한 양으로 잔존 EB2 용액을 희석. </li><li> 37 ° C에서 3 ㎖의 EB2와 다른 5 12 분 소화주기를 수행; 각각 후 15 ML 원뿔 튜브에 버퍼를 포함하는 심근 세포의 수집12 ML의 KB 솔루션을 희석. 실온에서 30 분 동안 6 셀 함유 튜브를 저장한다. </li></ol> 4. 셀의 재 부상과 칼슘 2 + Readaptation <ol><li> 20 ㎖ 칼슘 2 + 무료 타이로드 버퍼 (TB)에 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)를 추가합니다. 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 해결하는 심근 세포를 강제로 5 분 100 XG에 여섯 심근 포함하는 원뿔 튜브를 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 실온에서 TB를 포함하는 BSA의 (수율에 따라 1-3 ML) 변수 양의 각각의 튜브에 세포를 재현 탁. </li><li> 점차적으로 100 밀리몰 / L의 염화칼슘 용액을 작은 분량 씩 추가하여 셀이 포함 버퍼에 칼슘 2 + 농도를 증가시킨다. 제 1 및 제 2 단계에서 칼슘 2 + 농도는 각각 50 μmol / L, 100 μmol / L까지 발생합니다. 다음 칼슘 2 + 추가 단계는 5 분마다 수행하고 농도는 각 단계 t에서 100 μmol / L에 의해 발생합니다0.9 밀리몰 / L의 OA 최종 농도 </li><li> 분리 과정의 수율을 평가. 현미경의 유리 바닥 챔버에 심근 함유 용액 0.5 ㎖를 전송합니다. 10 배 목표 배율에서 15 현미경 필드를 평가하고 (클리어 줄무늬와 유의 흠 예를 들어, 막대 모양의 세포, 그림 2) 건강한 심근 세포의 비율을 계산합니다. 예상 수익률은 약 20 %이다. </li></ol> 고립 된 심근 5. 기능 평가. 다음 프로토콜은 활동 전위와 세포 내 칼슘 이온 플럭스의 동시 등을 포함하여 인간의 심근 세포 기능 평가의 예입니다. <ol><li> 천공 패치 구성의 패치 클램프 실험을 위해 피펫 솔루션 (PS)을 준비합니다. 이 솔루션은 최대 3 개월 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 칼슘 2 + 무료 타이로드 버퍼 (TB)에 1.8 밀리몰 / L의 염화칼슘을 추가합니다. 유SE 패치 클램프 / 형광 실험 도중 심근 superfusion이 솔루션입니다. </li><li> 1.5 ML 튜브로 전송 세포 현탁액 1 ㎖를 10 μmol / L Fluoforte 10 μL의 Powerload 집중을 추가합니다. RT에서 30 분 동안 품어. 그 후, 수직으로 튜브를 설정하고 5 분 동안 정착 셀을 떠나; 캘리포니아에있는 세포를 재현 탁 2 + TB를 포함. </li><li> (: 37 ± 0.5 ° C의 온도)의 작은 (0.5 ㎖)에 세포 현탁액 0.25 ㎖의 전송, 온도 조절 현미경은 0.3 ㎖ / 분의 유속으로 가열 microperfusor 시스템 중력 superfused 기록 챔버를 탑재. </li><li> 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 3 ~ 5 ㎛의 팁 직경 PS 가득 3 M 4.5에의 저항으로 패치 클램프 피펫을 준비합니다. </li><li> PS (250 ㎍ / ㎖)의 배치에 암포 테리 신 B를 추가하고 전극을 채우기 위해 사용합니다. </li><li> 흠없는 명확한 줄무늬가있는 막대 모양의 세포, FO를 선택접속 저항이 20 MΩ을 떨어질 때까지 RM, 5 ~ 10 분 기가 씰을 기다립니다. </li><li> 자극의 상이한 주파수 (Hz에서 0.2, 0.5 Hz에서 1 Hz의 각 주파수에서 1 분)에서 짧은 펄스 (&lt;3 밀리 초)를 사용하여 전류 클램프 모드에서 활동 전위를 유도. 녹음 단계에서 492 ± 3 nm의 시야 조명을 켜고 505-520 nm에서 Fluoforte 형광을 감지합니다. 형광을 획득하고 Digidata 1440A와 pClamp 10.0 소프트웨어를 사용하여 잠재적 인 신호를 멤브레인. 필요한 경우 기록 순서를 여러 번 반복; 그러나, 각 셀에 대한 15 분 아래의 총 녹화 시간을 유지. </li></ol>

<ol><li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+cardiac+myocytes.+I.+Preparation+of+adult+myocytes+and+their+homology+with+the+intact+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue.</a> Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).</li>
<li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+cardiac+myocytes.+II.+Functional+aspects+of+mature+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells.</a> Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).</li>
<li>Harding, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+dependence+of+contraction+velocity+in+single+isolated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardioscience%22%5BJournal%5D)">Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes.</a> Cardioscience. 1, 49-53 (1990).</li>
<li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Medical+Association+Journal%22%5BJournal%5D)">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+calcium-current+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+handling+in+isolated+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation. 85, 1046-1055 (1992).</li>
<li>Cohen, N. M., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+in+single+human+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Calcium current in single human cardiac myocytes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+K%2B+currents+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation Research. 73, 379-385 (1993).</li>
<li>Virag, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+component+of+the+delayed+rectifier+potassium+current+in+undiseased+human+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes.</a> Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).</li>
<li>Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+ventricular+and+atrial+cardiomyocytes%3A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Cardioscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note.</a> Cardioscience. 4, 111-116 (1993).</li>
<li>Benitah, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+inward+current+in+single+cells+isolated+from+adult+human+ventricles.+Pflugers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).</li>
<li>Verkerk, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+delayed+afterdepolarizations+in+ventricular+cells+isolated+from+human+end-stage+failing+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts.</a> Circulation. 104, 2728-2733 (2001).</li>
<li>Cerbai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+hyperpolarization-activated+current%2C+I%28f%29%2C+in+ventricular+myocytes+from+human+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart.</a> Circulation. 95, 568-571 (1997).</li>
<li>Kohncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li>
<li>Tomaselli, G. F., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+remodeling+in+hypertrophy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure.</a> Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).</li>
<li>Maron, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).</li>
<li>Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+from+developmental+biology+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).</li>
<li>Maron, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy+is+predominantly+a+disease+of+left+ventricular+outflow+tract+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction.</a> Circulation. 114, 2232-2239 (2006).</li>
<li>Peeters, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+human+ventricular+myocytes+from+single+endocardial+and+epicardial+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies.</a> The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).</li>
<li>Lippiat, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recording+using+the+perforated+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique.</a> Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127, 575-584 (2013).</li>
<li>Kuusisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-grade+inflammation+and+the+phenotypic+expression+of+myocardial+fibrosis+in+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy.</a> Heart. 98, 1007-1013 (2012).</li>
<li>Yan, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+2+early+afterdepolarization+as+a+trigger+of+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+acquired+long-QT+syndrome+%3A+direct+evidence+from+intracellular+recordings+in+the+intact+left+ventricular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall.</a> Circulation. 103, 2851-2856 (2001).</li>
<li>Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+outward+and+delayed+rectifier+currents+in+canine+atrium%3A+properties+and+role+of+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods.</a> The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).</li>
<li>Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+two+components+of+delayed+rectifier+K%2B+current+in+human+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes.</a> Circulation research. 78, 689-696 (1996).</li>
<li>Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+IKr+and+IKs+heterogeneity+on+action+potential+duration+and+its+rate+dependence%3A+a+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study.</a> Circulation. 99, 2466-2474 (1999).</li>
<li>Volders, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+contribution+of+IKs+to+canine+ventricular+repolarization%3A+key+role+for+beta-adrenergic+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation.</a> Circulation. 107, 2753-2760 (2003).</li>
<li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoproterenol+antagonizes+prolongation+of+refractory+period+by+the+class+III+antiarrhythmic+agent+E-4031+in+guinea+pig+myocytes.+Mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action.</a> Circulation Research. 68, 77-84 (1991).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+approach+to+treatment+of+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+pre-clinical+rationale+and+design+of+a+prospective+randomized+pilot+trial+with+ranolazine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine.</a> Circulation. 125, 1(2012).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리하는 방법을 확인했다. 성공적으로 병에 걸린 심실의 심근에서 하나의 실행 가능한 심근 세포의 분리가 개발 및 미세 조정 된 수 있도록 심방 외과 샘플, 기술에서 고립 된 세포에 사용되었던 이전에 설명한 프로토콜에서 시작. 초기 보고서는 선택적으로, 생리 학적 자극 8,24에 변경된 전기 생리학 특성 및 응답의 결과로, 칼륨 전류를 repolarizing 장애인 심방과 심실 조직의 덩어리에서 단일 심근 분리 관상 동맥 관류를 통해 버퍼를 포함하는 효소의 배달이 지연 정류기을 손상하지 않은 반면 것으로 나타났다 분리 셀 (25)의 전류. 불행하게도, 심실 심근의 수술 표본에서 인간의 심실의 심근 세포의 분리는 관상 동맥 분지의 무결성 이후 관상 동맥 재관류에 의해 수행 할 수 없습니다외식 마음과 모순, 손실됩니다. 우리의 방법을 사용하여 심근 덩어리에서 분리 된 심근 페이싱 주파수의 변화에​​ 따라 활동 전위 기간...

심근의 전기 생리학 속성의 해부는 하나의 심장 근육 세포의 분리를위한 기술의 개발 이후에 현저하게 진행되고있다. 심장 흥분 수축 커플 링 (EC-커플 링)의 이해의 최근 발전은 그대로 조직의 모든 생리 학적 특성을 보유 가능한 단일 심근를 분리하는 능력에 의해 가능하게되었다. 패치 클램프 방법은 일상적 sarcolemmal 심장 이온 전류의 함수 및 약리학 적 변조를 연구하기 위해 사용된다. 칼슘 2 +에 민감한 염료와 세포 내 칼슘 역학의 녹음은 정기적으로 EC-커플 링의 생리에뿐만 아니라 내 Ca 2 +의 병리학 적 변화에 중요한 데이터를 제공하고, 건강하고 병에 걸린 다양한 모델에서 하나의 심장 근육 세포에서 수행됩니다 기계적 손상과 심장 질환의 증가 부정맥 부담으로 이어지는 항상성. 인포이 연구에서 기 임상 설정에서 약물의 전기 생리학 및 기계적 효과를 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 횡단 전류와 심장 활동 전위와 심장 역학의 특정 기능을 설명 EC-커플 링 단백질의 종 특정 차이가 있습니다. 비 인간의 포유 동물에서 분리 된 심근 세포의 연구는 생물 물리학 적 특성과 특정 횡단 이온 채널과 EC-결합 단백질의 생리 학적 역할을 밝혀 반면 따라서, 그들은 반드시 인간의 심장 근육 세포의 관련 모델을 제공하지 않습니다. 인간의 심근에서 실행 가능한 심근 세포의 분리는 완전히 심장 질환의 병태 생리를 이해하고 새로운 치료 방법을 확인하는 것이 필수적이다. 심방 부속기는 종종 수술 과정에서 폐기 될 때 인간의 심방 조직을 쉽게 사용할 수 있습니다. 성인의 심장 활동 전위와 이온 CU의 초기 양적 연구rrents는 효소 고립 심방 세포 1-4을 채택했다. 활동 전위 또는 격리 된 성인의 심실 세포에서 전류의 기록은 이후 3,5-10을보고되었습니다. 이러한 연구의 대부분은 외식 마음에서 얻은 고립 된 세포를 얻기 위해 콜라하는 관상 동맥 세그먼트 또는 절제된 조직의 상대적으로 많은 양의 노출의 콜라게나 제 관류 중 하나를 활용 한 세포를 사용했습니다. 이러한 연구는 건강한 마음에서 인간의 심실의 심근에서 터미널 심부전 환자에서 횡단 이온 전류의 수의 상세한 특성을 허용했다. L 형의 기록은 칼슘 2 + 전류 (I CA-L) 5-7, 일시적인 외부 칼륨 전류 (I가) 8, 정류기의 칼륨 내향 전류 (I가 κ1) 8, 지연 정류기의 칼륨 전류의 다른 구성 요소는 (나는 κ ) 9가보고되었습니다. 발전 및 정제분리 절차 (10)는, 활동 전위 연장 (11)를 포함하는 단말기 심장 마비의 증가 부정맥 가능성의 이온 기준의 명확한 특성을 허용 depolarizations 12 후 지연 및 이완기 탈분극과 조기 박동을 선도 재미 현재 13 증가. 성인 심장 근육 세포는 일반적으로 다양한 효소 혼합물과 온 마음, 칼슘 2 + 허용 전지 (14)의 높은 수율을 생산하는 기술의 역 행성 관류 작은 동물에서 격리됩니다. 조직의 파편에서 심장 근육 세포의 분리는 아마 때문에 관상 동맥의 관류에 의해 달성과 비교하여 각각의 근육 세포에 효소의 제한된 액세스의 본질적으로 덜 성공합니다. 인해 미사용 도너 하트 매우 제한된 가용성, 정기적으로 통상의 인간 심실 세포를 얻는 유일한 실용적인 방법은 효소 digestio입니다선택적 수술 중에 절제 종종 매우 작은 조직 조각의 명. 철저하게 세포 수준에서 특징으로 한 인간 질병 모델은 이식 마음에 접근성으로 인해 터미널 심장 마비입니다. 그러나 터미널 심장 마비 환자의 소수에서 발생하고 종종 근본적인 원인 (15)의 상대적으로 독립적 인 심근 세포의 심한 개조의 일반적인 경로를 포함한다. 질병의 초기 단계에서 비 실패한 환자에서 단일 심장 근세포의 기능을 평가하는 능력은 다른 상속 또는 취득 조건의 구체적인 기전을 이해하는 것이 중요하다. 비후성 심근증 (HCM)는 말하고 예입니다. HCM은 일반 (1 / 500 개인) 심장 비대 특징으로 상속 심장 조건으로 인해 유출로 협착 및 이완기 기능 장애 16 부정맥 위험과 수축 변경을 증가합니다. HCM의 마음에서 심근 U셀 구조의 변화 (비대, 근원 섬유 혼란)과 EC-커플 링 (17)을 포함하는 복잡한 리모델링 프로세스를 ndergo. 그러나, HCM의 심장 세포 기능 장애의 대부분의 정보는 형질 전환 동물 모델에서왔다. HCM 환자의 소수에 불과 터미널 심부전으로 발전과 심장 이식을 필요로하기 때문에, HCM 마음은 표준 방법과 세포의 분리에 매우 드물게 사용할 수 있습니다. 그러나, HCM 환자의 30 % 이상은 수축기 (HCM) 18시 대규모 중격 비대 바꾸는 유출 요로 혈액의 흐름에 의한 폐색 증상을 개발할 수 있습니다. HCM에 방해의 기복을위한 가장 효과적인 가능한 치료 옵션은 수술 중격 절제술​​입니다 :이 수술하는 동안, 상단 격막의 변수 크기의 부분은 트랜스 대동맥 접근 방식에 의해 제거된다. 비대 격막의이 부분은 신선한 조직에서 세포 분리를위한 따라서 사용할 수 있습니다. 인간 ventricula의 분리를위한 방법R 하나의 작은 경정맥 심 내막 심근 생검 조직에서 근육 세포는 이전에 개발 된 19를 발표하고있다. 우리는 중격 절제술​​ 및 밸브 교체 절차를받은 환자를받은 HCM 환자를 포함하여 심장 수술을받은 환자에서 심실의 심근 샘플에서 단일 중격 근육 세포를 분리하는 방법을 구현했습니다. 분리 프로토콜, 대표적인 전기 생리학 및 CA 2 + 형광에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 측정은 고립 된 인간의 심실의 심근 세포의 생존 및 패치 클램프 및 세포 내 칼슘 2 + 연구의 가능성을 보여되게됩니다.

<table><tbody><tr><td>인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p9791?lang=it&amp; region=IT">P9791 </a></td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO4*7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m1880?lang=it&amp; region=IT">M1880 </a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it&amp; region=IT">H3375 </a></td><td></td></tr><tr><td>아데노신</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9251?lang=it&amp; region=IT">A9251 </a></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도당</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8270?lang=it&amp; region=IT">G8270 </a></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it&amp; region=IT">M4125 </a></td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨 (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it&amp; region=IT">S7653</a></td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it&amp; region=IT">P9333 </a></td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨이염기성(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7907?lang=it&amp; region=IT">S7907 </a></td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s6297?lang=it&amp; region=IT">S6297 </a></td><td></td></tr><tr><td>중탄산칼륨 (KHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/237205?lang=it&amp; region=IT">237205</a></td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2256?lang=it&amp; region=IT">P2256 </a></td><td></td></tr><tr><td>2,3-부탄디온 모노심</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b0753?lang=it&amp; region=IT">B0753 </a></td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it&amp; region=IT">S8045 </a></td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산 모노칼륨염 일수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/49601?lang=it&amp; region=IT">49601</a></td><td></td></tr><tr><td>피루브산</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/107360?lang=it&amp; region=IT">107360</a></td><td></td></tr><tr><td>3-하이드록시부티르산</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/166898?lang=it&amp; region=IT">166898</a></td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5&prime;-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it&amp; region=IT">A8937</a></td><td></td></tr><tr><td>크레아틴</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0780?lang=it&amp; region=IT">C0780 </a></td><td></td></tr><tr><td>숙신산</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s3674?lang=it&amp; region=IT">S3674 </a></td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N&프라임;,N&프라임;-테트라아세트산(EGTA)</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e0396?lang=it&amp; region=IT">E0396 </a></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청의 알부</td>민 <td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a0281?lang=it&amp; region=IT">A0281</a></td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8266?lang=it&amp; region=IT">M8266 </a></td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum의 콜라겐분해효소, V형</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9263?lang=it&amp; region=IT">C9263 </a></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase, 박테리아, XXIV형</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 용액, H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/21115?lang=it&amp; region=IT">21115</a></td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 0.1M 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/53704?lang=it&amp; region=IT">53704</a></td><td></td></tr><tr><td>칼륨 메탄설포네이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/83000?lang=it&amp; region=IT">83000</a></td><td></td></tr><tr><td>FluoForte 시약</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-52015</td><td></td></tr><tr><td>전력부하 농축액, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>P10020</td><td></td></tr><tr><td>관류 패스트 스텝 시스템</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-77SP</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B 가용화</td><td>시그마-알드리치</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9528?lang=it&amp; region=IT">A9528 </a></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 패치 클램프 증폭기</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0&nbsp;</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소화 장치</td><td>CUSTOM</td><td>CUSTOM</td><td>이 장치는 플라스틱 튜브, 주조 실가드 및 모터를 사용하여 우리 실험실에서 맞춤 제작됩니다. 그림 1C-1D 및 그림 7에 자세히 설명되어 있습니다. 요청 시 추가 세부 정보를 제공할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>소화 장치의 브러시용 실리콘 엘라스토머</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>소화 장치용 가변 속도 회전 모터</td><td>Crouzet</td><td>Crouzet 178-4765</td><td></td></tr><tr><td>주조 브러시용 금형</td><td>N.A.</td><td>해당 없음</td><td>금형은 표준 PTFE 2.5cm 직경 막대로 맞춤 제작되었습니다.</td></tr></tbody></table>

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

병에 걸린 심장에서 심근 세포는 세포 구조의 변화, 여진 수축 결합 및 막 이온 전류를 포함하는 복잡한 리모델링 과정을 실시한다. 이러한 변화는 증가 부정맥 위험과 심장병 환자의 수축기 및 이완기 기능 장애로 이어지는 수축 변경에 대한 책임을 져야 할 가능성이있다. 그러나, 심장 질환에서 심근 기능의 변화에​​ 대한 대부분의 정보는 동물 모델에서왔다. 여기에 우리가 설명하고 심장 수술 작업을받은 환자에서 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리 할 수​​있는 프로토콜을 확인합니다. 프로토콜 상세하게 설명한다. 전기 생리학 및 세포 내 칼슘 측정이 방법으로 얻은 인간의 심실의 심근에서 단일 세포 측정의 숫자의 타당성을 입증하는 것으로보고있다. 이 프로토콜은 그에게보고다시 다른 심장 질환의 존재에서 인간의 마음의 기능 변경의 세포 및 분자 단위의 미래 연구에 유용 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 세포 수준에서 새로운 치료 표적을 식별하고 직접 병진 값으로, 인간의 심장 근세포에서 신규 화합물의 효과를 시험하는데 사용될 수있다.

비 실패한 비 비후성 수술 환자 (21)와 비교하여 상술 한 방법은, 조작 절제술을 시행 비대성 심근증 (HCM)를 가진 환자의 심실 중격으로부터 격리 심근의 기능적 이상을 특성화하기 위해 사용 하였다. 이 섹션에 포함 된 결과를 해당 워크 (21)로부터 유도되며이 기술은 심장 질환 조건에서 심근 세포 기능의 변화를 특성화하는 데 사용될 수있는 방법의 예로서 여기에 도시되어있다. HCM을 가진 환자의 담당자 수술 샘플은 그림 2A에 표시됩니다. 수술 용 샘플은 크기 및 내막 섬유상 줄무늬의 두께의 점에서 매우 변수되었습니다. 우리는 HCM 샘플에서 각각의 분리 절차를 사용 심근 조직의 양을 1g 주위에 있었다. 대신, 제어 샘플에 사용 조직의 양 (100 ~ 500 밀리그램). 작았 로우로 인해연구 조직의 가용성을 제공합니다. 조직 내에서 실행 가능한 심근 세포의 상대적인 양이 HCM 심근의 감소와 심 내막...

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

본 절차의 전체적인 목표는 질환이 있는 인간 심실 표본으로부터 생존 가능한 심근세포를 분리하고 이들의 기능적 변화를 특성화하는 것입니다. 이를 위해 먼저, 과도한 조직 분해와 세포 손상을 방지하고자 얼음처럼 차가운 심정지액 내에서 신선한 심실 샘플을 신속하게 수집하고 잘게 다집니다. 두 번째 단계는 맞춤형 소화 장치와 효소 용액을 사용하여 심근 덩어리를 단계적으로 소화시키는 것입니다.6회 cycle 동안, 각 cycle마다 완충액이 포함된 세포를 튜브에 수집하고 세포 보존액으로 희석합니다. 마지막 단계는 기능적 특성 분석을 수행하기 위해 6개의 튜브에 담긴 세포를 정상 칼슘 농도의 표준 생리식염수 소량에 재현탁하는 것입니다. 최종적으로, 활동 전위의 패치 클램프 기록과 형광 염료를 이용한 세포 내 칼슘의 동시 평가를 통해 비후성 심근증 환자의 심근세포에서 나타나는 활동 전위 기간 및 세포 내 칼슘 사이클링의 변화를 보여줍니다.표준 덩어리 소화법(chunk digestion method)과 같은 방법과 비교했을 때 DYS의 주요 장점은 효소 용액과 함께 실리콘 스크레이퍼를 통해 다양한 세포의 공동 해리를 가능하게 하는 맞춤형 소화 장치를 사용한다는 점입니다. 이 방법은 심장 질환과 관련된 잘 알려진 분자적 및 구조적 리모델링이 어떻게 단일 심근세포의 변화로 나타나는지, 그리고 이를 우리 방법으로 분석하고 특정 약물로 표적화할 수 있는지와 같은 심장학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 따라서 이 기술의 적용 범위는 비후성 심근병증과 같은 유전성 심장 질환의 치료까지 확장됩니다.실제로 이 방법은 심장 수술을 받은 비대성 또는 허혈성 심장 질환 환자의 심실 심근세포를 대상으로 새로운 신경병성 접근법을 테스트하는 데 사용될 수 있습니다. 저희는 심장 수술 중 얻은 인간 동맥 표본과 심실 생검 조직 사이의 유사성을 비교하던 중 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 50 mL 튜브에 Cardioplegic 용액 40 mL를 붓고 얼음에 보관하여 수술실에서 세포 분리 실험실까지 표본을 운송함으로써 이 절차를 시작하십시오. 표본을 실험실 구역으로 신속하게 옮겨 표본 적출 후 10분 이내에 표본 처리를 시작하십시오.절제 직후 수술실에서 다음의 집단 심실 심근 시료를 수거합니다. 이를 얼음처럼 차가운 CP 용액으로 세척하고, 시료를 차가운 CP 버퍼 상태로 유지하며 튜브에 보관합니다. 이후 미세 가위를 사용하여 심내막 섬유화 층을 조심스럽게 제거합니다.심근 조직을 2~3mm 길이의 작은 조각으로 자르며, 각 분리 작업당 심실 심근의 총량은 100mg에서 1g 사이가 되도록 합니다. 조각들을 소화 장치의 스크레이핑 챔버로 옮긴 후, 챔버 내의 CP 버퍼를 차가운 칼슘 무첨가 해리 버퍼(calcium free dissociation buffer)로 교체합니다. 그 다음 소화 장치를 항온 수조에 넣습니다.항온수조를 37.5 °C로 설정하고 전원을 켭니다. 다음으로 소화 장치의 모터를 켜고 회전 속도를 초당 1회전으로 설정합니다. DB로 세척 과정을 3회 수행하며, 8분마다 챔버 내의 용액을 37 °C의 산소 포화된 깨끗한 DB로 교체합니다.그 후, DB 용액에 250 units/mL의 collagenase type five와 4 units/mL의 protease type 24를 첨가하여 효소 버퍼 1을 준비합니다. 그다음 250 units/mL의 collagenase를 첨가하여 효소 버퍼 2를 준비합니다.DB 솔루션 산소화 EB 1을 5분 동안 주입하고 37 °C까지 가온합니다. 그 후, 37 °C에서 100% 산소화된 EB 1 3 mL를 사용하여 회전식 소화 장치에서 12분간 소화 사이클을 2회 수행합니다. 각 사이클이 끝날 때마다 피펫 흡입으로 솔루션을 제거하여 폐기합니다.다음으로, 세포 수집을 위한 15 mL 튜브 6개와 완충액 용출을 위한 4 °C의 craft brew 용액 80 mL를 준비하고, 산소화된 EB 2를 준비하여 37 °C까지 가온합니다. 이어서, 37 °C에서 100% 산소화된 EB 2 3 mL를 사용하여 첫 번째 15분 소화 사이클을 수행합니다. 소화 사이클 후, 첫 번째로 분리된 근세포가 포함된 용액을 15 mL 튜브에 수집하고, 세포 현탁액을 차가운 KB 용액 12 mL로 희석합니다.튜브를 실온에서 평평하게 보관하고, 3 mL의 EB 용액을 사용하여 37 °C에서 12분간의 소화 사이클을 5회 더 수행하며, 각 사이클마다 근세포가 포함된 완충액을 15 mL 원추형 튜브에 수집하십시오. 또한 각 사이클에서 수집한 3 mL의 완충액을 12 mL의 KB 용액으로 희석해야 함을 기억하십시오. 마지막으로, 세포가 포함된 6개의 튜브를 실온에 보관하십시오.이 단계에서는 20 mL의 칼슘 제거 Tyro 완충액에 1 mg/mL bovine serum albumin을 첨가합니다. 그다음 용액을 여과한 후, 심근세포가 들어 있는 6개의 원심분리관을 100×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 심근세포를 침전시킨 후, 상청액을 제거하고 실온에서 각 튜브의 세포를 BSA가 포함된 TB의 가변적인 양으로 재부유시킵니다.첫 번째와 두 번째 단계에서 100 mM CaCl₂ 용액을 소량씩 첨가하여 완충액이 포함된 세포 내의 칼슘 농도를 점진적으로 높입니다. 칼슘 농도는 각각 50 µM 및 100 µM까지 올립니다. 이후의 칼슘 첨가 단계는 5분마다 수행하며, 각 단계마다 농도를 100 µM씩 높여 최종 농도인 0.9 mM에 도달하게 합니다.분리 절차의 수율을 평가하려면, 심근세포가 포함된 용액 0.5 milliliters를 현미경의 유리 바닥 챔버로 옮깁니다. 10 x 대물렌즈 배율에서 15개의 현미경 시야를 평가하고, 뚜렷한 가로무늬가 있고 유의미한 봉입체가 없는 막대 모양의 세포와 같이 건강한 심근세포의 백분율을 계산합니다. 활동 전위와 세포 내 칼슘 플럭스의 동시 기록을 포함한 인간 심근세포의 기능 평가를 입증하기 위해 예상 수율은 약 20%여야 합니다.먼저, perforated patch 구성의 패치 클램프 실험을 위한 피펫 용액을 준비합니다. 그다음, calcium free tb에 1.8 millimolar의 calcium chloride를 첨가합니다. 이 용액을 패치 클램프 형광 실험 중 심근세포의 superfusion에 사용합니다.다음으로, 세포 현탁액 1 mL를 1.5 mL 튜브로 옮기고 10 µM/L flu fort와 10 µL의 power load를 첨가합니다. 튜브를 수평으로 눕힌 상태에서 실온에서 30분 동안 배양하며 농축합니다. 그 후, 튜브를 수직으로 세워 5분 동안 세포가 가라앉도록 둡니다.그 다음 상층액을 파이펫으로 제거하고, 세포 펠렛을 칼슘이 포함된 tb에 재현탁합니다. 세포 현탁액 25 milliliters를 온도가 제어되는 소형 현미경 장착 기록 챔버로 옮깁니다. 37 °C에서 0.3 milliliters per minute의 유속으로 가열된 마이크로 퍼퓨전 시스템을 통해 중력으로 퍼퓨전합니다.마이크로 피펫 풀러를 사용하여, ps를 채웠을 때 팁 직경이 3~5 µm이고 저항이 3~4.5 MΩ인 패치 클램프 피펫을 준비합니다. 그 후, PS에 amphotericin B를 250 µg/mL 농도로 첨가하여 전극을 채운 다음, 피펫 홀더에 전극을 장착합니다. 이어서, 뚜렷한 줄무늬가 있고 봉입체가 없는 Ron 모양의 세포를 선택합니다.기가실(giga seal)을 형성하고 접근 저항이 20 ohm 미만으로 떨어질 때까지 5~10분 동안 기다립니다. 그 후, 서로 다른 빈도의 짧은 자극 펄스를 사용하여 전류 클램프(current clamp) 모드에서 활동 전위를 유도합니다. 기록 단계 동안 492 nanometers에서 명시야 조명을 켜고 505~520 nanometers에서 Fluor fort 형광을 검출합니다.그런 다음 형광 및 막 전위 신호를 획득합니다. 이 그림은 HCM 샘플의 심실 심근세포에서 활동 전위의 변화를 보여줍니다. 여기 컨트롤 심근세포와 HCM 심근세포에서 0.2 hertz, 0.5 hertz 및 1 hertz로 유도된 대표적인 중첩 활동 전위가 제시되어 있습니다.대조군 심근세포에서 0.5 hertz로 측정된 중첩된 활동 전위입니다. 10⁻⁷ M isoproterenol이 없을 때와 있을 때의 결과가 나타나 있으며, 여기에는 조기 후탈분극(early after depolarizations)의 여러 자발적 탈분극이 나타난 HCM 환자의 심근세포 막전위 대표 트레이스가 제시되어 있습니다. 이 그림은 HCM 샘플의 심실 심근세포에서 칼슘 트랜지언트(calcium transient)의 변화를 보여줍니다.다음은 대조군 심근세포와 HCM 세포에서 패치 피펫을 통해 0.2 hertz로 자극했을 때 유도된 대표적인 중첩 칼슘 과도 현상(calcium transient)입니다. 서로 다른 시간대에서의 HCM 및 대조군 심근세포의 칼슘 과도 현상 역학이 나타나 있으며, 세 가지 서로 다른 주파수로 자극하는 동안의 세포 내 칼슘을 보여주는 대표적인 장기 추적 기록이 제시되어 있습니다. 이는 HCM 심근세포에서 높은 페이싱 속도일 때 이완기 칼슘이 증가함을 강조합니다. 이 그림은 인간 심실 심근세포를 이용한 추가적인 실험 적용 사례를 보여줍니다.서로 다른 막전압에서 기록된 L-타입 칼슘 전류를 보여주는 대표적인 중첩 트레이스가 왼쪽에 표시되어 있으며, HCM 샘플에서 분리한 18개 세포의 막전압별 평균 L-타입 칼슘 전류 피크 밀도가 오른쪽에 표시되어 있습니다. 또한, 1 Hz의 전기장 자극 동안 심실근세포에서 기록된 세포 내 칼슘 트레이스가 여기에 제시되어 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 시료의 신선도를 보장하기 위해 수술실에서 검체를 수집한 직후에 절차를 시작하는 것이 중요합니다. 이 절차를 통해 인간 심실 심근세포를 분리하십시오. 라이브 셀 컨포컬 현미경 관찰이나 면역 화학 분석과 같은 다른 방법들도 수행할 수 있으며, 이는 예를 들어 심장 질환의 진행 과정에서 막 구조와 칼슘 방출 단위의 세포 내 국소화가 어떻게 변화하는지와 같은 근본적인 질문에 답하는 데 결정적인 역할을 할 것입니다.이 기술은 세포 심장학 분야에서 심실 심근세포의 기능적 이상을 연구하고 새로운 치료 옵션의 잠재적 효용성을 테스트할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 인간 시료에서 생존 가능한 단일 심근세포를 분리하는 방법과 다양한 조건에서 세포 기능을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

isolation-functional-characterization-human-ventricular

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를...

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

인간의 심장 조직 심근 재생에 적합 할 수있는 다 능성 혈관 주위 전구체 세포 집단을 항구. 주연 세포와 CD34 + CD146 - - 외막 세포, 인간 심근에서 여기에 설명 된 기술은 원시 혈관, 즉 CD34 + CD146와 연관된 두 능성 간질 세포 집단의 동시 분리 및 정제를 허용한다.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

이 문서에서는, endomyocardial bioptic 샘플의 arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 mesenchymal stromal 세포를 분리 하는 방법을 제공 됩니다. 그들의 특성 및 그들의 adipogenic 차별화를 강화 하는 프로토콜을 설명 합니다.

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

이 프로토콜은 피부 심장 근구를 사용하여 심장 기능의 추출 및 평가 기술을 단계별로 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론은 마우스에서 남성에 이르기까지 다른 심장 위치에서 수집 할 수있는 작은 냉동 생검을 사용하여 myofilament 기능의 측정 및 급성 변조를 허용합니다.

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&amp;50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

학습하세요 신선한 수술 샘플에서 생존 가능한 심실 심근세포를 분리하고 기능적 특성을 분석하는 방법을. 효소 소화와 맞춤형 소화 장치를 사용하여 심근 기능 연구 및 약물 테스트에 활용할 수 있습니다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

더 많은 동영상 탐색