신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

이 절차의 전반적인 목표는 질병 인간 심실 표본에서 생존 가능한 심근세포를 분리하고 기능적 변화를 특성화하는 것입니다. 이는 과도한 조직 분해와 세포 손상을 방지하기 위해 먼저 얼음처럼 차가운 심정지 용액에서 신선한 심실 샘플을 신속하게 수집하고 다지않음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 맞춤형 분해 장치와 효소 용액을 사용하여 심근 덩어리를 단계적으로 분해

6 사이클에서 세포를 포함하는 완충액은 각 사이클에서 튜브에 수집되고 세포 보존 용액으로 희석됩니다. 마지막 단계는 기능적 특성화를 수행하기 위해 6개의 튜브에 포함된 세포를 정상적인 칼슘 농도로 더 낮은 부피의 표준 생리학적 용액에 재현탁시키는 것입니다. 궁극적으로, 비후성 심근병증 환자의 심근세포에서 활동전위, 전위기간 및 세포내 칼슘 순환의 변화를 보여주기 위해 형광 염료를 사용한 활동전위의 패치 클램프 기록과 세포간 칼슘의 동시 평가를 사용합니다.

표준 청크 방출 방법과 같은 16가지 방법에 비해 고유한 DYS의 주요 장점은 효소 용액과 관련하여 실리콘 긁힘 덕분에 가변 세포의 결합 de 결합을 허용하는 맞춤형 소화 장치를 사용한다는 것입니다. 이 방법은 심장 질환과 관련된 잘 알려진 분자 및 구조적 리모델링이 당사의 방법으로 분석하고 특정 약물에 의해 표적화할 수 있는 단일 심근세포의 변형에 어떻게 반영되는지와 같은 심장학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술의 의미는 비후성 심근병증과 같은 유전적 심장 질환의 치료로 확장됩니다.

실제로, 이 방법은 심장 수술을 받은 비대성 또는 허혈성 심장 질환 환자의 심실 심근세포에 대한 새로운 신경병학적 접근 방식을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 심장 수술 중에 얻은 인간 동맥 표본과 심실 생검의 유사성을 비교할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 50ml 튜브에 심마비 용액 40ml를 붓고 수술실에서 세포 분리 실험실로 검체 운송을 위해 얼음에 보관하고, 검체를 실험실 구역으로 신속하게 옮기고, 검체 절제 후 10분 이내에 검체 처리를 시작하는 것으로 이 절차를 시작합니다.

다음 집단 심실 심근 표본은 절제 직후 수술실에서 채취되었습니다. 얼음처럼 차가운 CP 용액으로 세척하고 시료를 얼음처럼 차가운 CP 버퍼에 보관하면서 튜브에 보관하십시오. 그 후 가는 가위를 사용하여 심내막 섬유층을 조심스럽게 제거합니다.

심근 조직을 2-3mm 길이의 작은 조각으로 자르고 심실 심근의 총량은 100mg에서 1g 사이입니다. 덩어리가 분해 장치의 스크래핑 챔버로 옮겨진 후 챔버의 CP 버퍼를 차가운 칼슘이 없는 해리 버퍼로 변경합니다. 그런 다음 소화 장치를 자동 온도 조절 수조에 넣으십시오.

욕조를 37.5°C로 설정하고 켭니다. 그런 다음 소화 장치의 모터를 켜고 회전 속도를 초당 1회전으로 설정합니다. DB로 세 번의 세척 주기를 수행하고 8분마다 섭씨 37도의 산소 포화 클린 DB로 챔버의 용액을 교체합니다.

그 후, 콜라겐 분해 효소 5 형 밀리리터 당 250 단위와 밀리리터 단백질 분해 효소 당 4 단위를 첨가하여 효소 완충액 1을 준비합니다. DB 솔루션에 24를 입력합니다. 그런 다음 콜라겐 분해 효소 1 밀리리터당 250 단위를 추가하여 효소 완충액 2를 준비합니다.

DB 용액에 5를 입력하여 EB 1에 산소를 공급하고 섭씨 37도까지 가열합니다. 그런 다음 회전하는 소화 장치에서 100% 산소화된 EB 3밀리리터를 사용하여 섭씨 37도에서 12분 동안 두 번의 소화 주기를 수행합니다. 피펫 흡인으로 용액을 제거하고 각 주기 후에 폐기하십시오.

다음으로, 세포 채취를 위한 15밀리리터 튜브 6개와 완충액이 EB 2에 산소를 공급하는 것을 피하기 위해 섭씨 4도의 크래프트 추출 용액 80밀리리터를 준비하고 섭씨 37도까지 작업합니다. 그 후, 섭씨 37도에서 100% 산소화된 EB 2 3밀리리터로 처음 15분 소화 사이클을 수행합니다. 분해 주기 후, 15ml 튜브에 첫 번째 관련 myocyte(첫 번째 관련 근육세포)가 포함된 용액을 수집하고 12ml의 차가운 KB 용액으로 세포 현탁액을 희석합니다.

튜브를 실온에 평평하게 보관하고, 섭씨 37도에서 3ml의 EB 2로 12분 동안 5번의 다른 분해 사이클을 수행하고, 15ml 원추형 튜브에서 각 사이클에서 근세포를 포함하는 완충액을 수집합니다. 또한 각 사이클에서 3밀리리터 수집 버퍼를 12밀리리터의 KB 용액으로 희석하는 것을 잊지 마십시오. 마지막에는 튜브가 들어있는 6개의 셀을 실온에서 보관합니다.

이 단계에서는 20ml의 칼슘이 없는 티로 완충액에 소 1밀리리터당 1mg의 혈청 알부민을 첨가합니다. 그런 다음 용액을 여과하고 원뿔형 튜브가 들어있는 6 개의 근세포를 100 치즈에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 근세포가 강제로 침전되도록 하려면 상층액을 제거하고 실온에서 TB를 포함하는 다양한 양의 BSA로 각 튜브의 세포를 재현탁합니다.

첫 번째 및 두 번째 단계에서 리터당 100밀리몰 염화칼슘 용액의 작은 OTT를 추가하여 완충액을 포함하는 세포의 칼슘 농도를 점차적으로 증가시킵니다. 칼슘 농도는 각각 리터당 50 마이크로 어금니와 리터당 100 마이크로 어금니로 증가합니다. 다음 칼슘 첨가 단계는 5분마다 수행되며, 각 단계에서 리터당 100마이크로몰씩 농도를 리터당 0.9밀리몰의 최종 농도로 높입니다.

분리 절차의 수율을 평가하려면 0.5ml의 근세포 함유 용액을 현미경의 유리 바닥 챔버로 옮깁니다. 10 x 대물렌즈 배율에서 15개의 현미경 필드를 평가하고 선명한 줄무늬가 있고 유의미한 내포물이 없는 막대 모양의 세포와 같은 건강한 근세포의 비율을 계산합니다. 예상 수율은 활동 전위 및 세포 내 칼슘 플럭스의 동시 기록을 포함하여 인간 심근 세포 기능 평가를 입증하기 위해 약 20%여야 합니다.

먼저, 천공 패치 구성에서 패치 클램프 실험을 위한 피펫 용액을 준비합니다. 그런 다음 1.8밀리몰의 염화칼슘을 무칼슘 결핵에 첨가합니다. patch clamp 형광 실험 중 심근세포의 과융합을 위한 용액을 사용하십시오.

다음으로, 1ml의 세포 현탁액을 1.5ml 튜브로 옮기고 1리터당 10마이크로몰의 독감 포트와 10마이크로리터의 전력 부하를 추가합니다. 농축액을 실온에서 수평 위치로 설정하여 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 수직 위치에 놓고 세포가 5분 동안 안정되도록 둡니다.

그런 다음 상등액을 피펫으로 빼내고 세포 펠릿을 칼슘이 함유된 결핵에 재현탁합니다. 25 밀리리터의 세포 현탁액을 작은 온도 제어 현미경에 장착된 기록 챔버로 전달합니다. 섭씨 37도에서 분당 0.3밀리리터의 유속으로 가열된 마이크로 푸어 시스템과 중력에 의해 융합됩니다.

마이크로 피펫 풀러를 사용하여 팁 직경이 3-5 마이크로 미터이고 ps로 채워질 때 3-4.5 메가 옴의 저항을 가진 패치 클램프 피펫을 준비합니다. 그런 다음 밀리리터당 250마이크로그램의 PS에 암포테리신 B를 첨가하고 이를 사용하여 전극을 채운 다음 피펫 홀더에 전극을 장착합니다. 다음으로, 줄무늬가 명확하고 내포물이 없는 Ron 모양의 셀을 선택합니다.

기가 씰을 형성하고 접근 저항이 20옴 이하로 떨어질 때까지 5-10분 동안 기다립니다. 그 후 서로 다른 자극 주파수에서 짧은 펄스를 사용하여 전류 클램프 모드에서 활동 전위를 유도합니다. 기록 단계에서 492나노미터에서 명시야 조명을 켜고 505-520나노미터에서 Fluor fort 형광을 감지합니다.

그런 다음 형광 및 막 전위 신호를 획득합니다. 이 그림은 HCM 샘플에서 심실 심근세포의 활동 전위 변화를 보여줍니다. 다음은 제어 근세포와 HCM 근세포에서 0.2Hz, 0.5Hz 및 1Hz에서 도출된 대표적인 중첩 활동 전위입니다.

제어 근세포에서 0.5 헤르츠에서 중첩된 활동 전위. 10 내지 7개의 몰 이소프로테레놀이 유무 및 존재 시 이소프로테레놀이 나타나며, 다음은 탈분극 후 초기에 여러 자발적 탈분극을 나타낸 HCM 환자의 심근세포의 막전위의 대표적인 흔적입니다. 이 그림은 HCM 샘플에서 심실 심근 세포의 칼슘 일시적 변화를 보여줍니다.

다음은 대조군 근세포와 HCM 세포에서 패치 피펫을 통해 0.2 헤르츠에서 자극 중에 유도된 대표적인 중첩된 칼슘 과도 현상입니다. 서로 다른 시간에 HCM의 칼슘 과도 상태와 제어 심근세포의 동역학이 표시되며, 다음은 HCM 근세포에서 높은 페이싱 속도에서 증가된 이완기 칼슘을 강조하는 세 가지 다른 주파수에서 자극 중 세포 내 칼슘을 보여주는 대표적인 긴 흔적입니다. 이 그림은 인간 심실 근세포를 사용한 추가 실험 응용 프로그램을 보여줍니다.

서로 다른 막 전압에서 기록된 L형 칼슘 전류를 보여주는 대표적인 중첩 흔적이 왼쪽에 나타나 있고, 서로 다른 막 전압에서 HCM 샘플로부터 분리된 18개 세포의 평균 L형 칼슘 전류 피크 밀도가 오른쪽에 나타나 있으며, 여기에 표시된 것은 1헤르츠에서 전기장 자극 동안 심실 근세포에서 기록된 세포 내 칼슘 흔적입니다. 이 절차를 시도하는 동안, 수술실에서 검체를 채취한 직후 절차를 시작하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 라이프스타일 컨포칼 현미경 또는 면역화학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있으며, 이는 예를 들어 심장 질환에서 막 구조 및 칼슘 방출 단위의 세포 내 국소화가 발달 후 어떻게 지연되는지와 같은 근본적인 질문에 답하는 데 중요할 것입니다.

이 기술은 심실 심근세포의 기능적 이상을 연구하고 새로운 치료 옵션의 잠재적 유용성을 테스트하기 위한 세포 심장학의 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 표본에서 생존 가능한 단일 심근세포를 분리하는 방법과 다양한 조건에서 세포 기능을 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.