사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 CENO R elegance에서 다음 실험의 전반적인 목표는 유기체, 세포 및 단백질의 세 가지 수준에서 잘못 접힌 단백질을 모니터링하는 것입니다. 운동성 또는 내열성과 같은 행동 표현형은 온도에 민감하거나 자연적으로 발생하는 유기체 수준에서 단백질 항상성의 변화를 판독하는 역할을 합니다. 메타 안정 단백질은 단백질 잘못 접힘과 관련될 수 있는 단백질 mis-localization을 추적하는 데 사용됩니다.

체외 부분 분해 분석법은 단백질 안정성을 직접 모니터링합니다. 결과는 열 저항성 분석, 면역 형광 현미경 검사 및 서양 혈액 분석을 기반으로 다양한 배양 온도에서 단백질 분해 용량의 변화를 보여줄 수 있습니다. 이러한 절차는 제 연구실의 대학원생들이 시연할 것입니다.

행동 분석은 ish ido에 의해 입증되고 Shai는 면역 염색을 입증하고 ANA는 flunking을, sheron은 부분 소화를 입증합니다. 온도 내성을 측정하기 위한 이 프로토콜에는 동물을 동기화하기 위한 준비 단계와 움직임 분석이 수반됩니다. 둘 다 텍스트 프로토콜에 설명되어 있으며, 최소 20마리의 동기화된 동물을 포함하는 복제물을 수집하는 것으로 시작합니다.

24에서는 450마이크로리터의 열 충격 버퍼를 포함하는 잘 재생된 우물. 각 웰에 9마이크로리터의 시톡신을 보충하십시오. 이제 접시를 온수 욕조로 옮깁니다.

열 충격, 온도 및 지속 시간은 성장 조건에 크게 좌우됩니다. 특히, 재배 온도는 동물의 다이 흡수를 모니터링하여 동물의 생존 점수를 매깁니다. TXR 필터가 있는 형광 입체경을 사용하면 주사위를 차지하는 동물이 죽습니다.

kine과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점인 수동 채점에 의한 내성은 동물 사망률에 대한 시각적 판독을 사용하여 이 에세이를 훨씬 빠르고 재현 가능하게 만든다는 것입니다. 필요한 단계에서 최소 30마리의 동물을 M nine 버퍼가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. M nine으로 짧고 낮은 속도의 원심분리 단계를 수행하고 M nine에서 Resus를 매달아 동물을 몇 번 씻습니다.

그런 다음 튜브를 얼음 위에 몇 분 동안 올려 식힙니다. 냉각되면 여분의 액체를 제거하고 튜브를 배양합니다. 얼음 차가움의 500 마이크로 리터에서, 4 % PARAFORM 알데히드.

배양 시간은 검사한 각 단백질에 대해 보정해야 하며 실온에서 약 5-30분이어야 합니다. 이제 고정된 동물을 원심분리에 의해 pH 7.2에서 PBS 트윈으로 세 번 세척합니다. 원심분리는 달리 명시되지 않는 한 항상 3000RPM에서 1분 또는 2분 동안 수행됩니다.

후드에서 대부분의 상등액을 제거하고 펠릿을 1ml의 빔 메르캅토에탄올 용액에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 동물을 부화시키고 다음 날 후드에서 부드럽게 흔들어 줍니다. PBST로 원심분리와 Resus로 동물을 세 번 씻습니다.

50-100 마이크로 리터의 PBST로 세척을 마치고 다른 원심 분리 후이 PBST의 대부분을 제거합니다. 다음으로, 100-150 마이크로 리터의 콜라겐 분해 효소 용액을 넣고 섭씨 37도에서 강한 교반으로 동물을 배양합니다. 써모 믹서 또는 진탕 인큐베이터를 사용하십시오.

5분 후 실체 현미경으로 주기적인 검사를 시작합니다. 동물의 5분의 1이 망가졌을 때, 얼음 위에 튜브를 올려 반응을 멈춘다. 이 단계는 매우 민감합니다.

치료 기간은 고정 조건에 따라 다르며 균주간에 크게 달라질 수 있습니다. 장기간의 부화는 동물의 완전한 퇴화를 초래할 수 있습니다. 각 효소 배치 전에 조건을 보정해야 하며 분해를 주의 깊게 모니터링해야 합니다.

다음으로, PBST에서 동물을 두 번 씻습니다. 원심분리로 동물을 수집하고 대부분의 PBST를 제거합니다. 그런 다음 BA 용액의 1 밀리리터를 추가하고 실온에서 한 시간 동안 부드러운 락킹으로 인큐베이션을 선행하여 원심분리로 동물을 수집하고 b의 200 마이크로 리터에서 다시 현탁액, A.Now 1 차 항체를 추가하고 실온에서 부드러운 락킹으로 하룻밤 배양을 시작합니다.

이러한 매개변수는 보정해야 합니다. 다음으로, 원심 분리로 동물을 씻으십시오. b, A의 밀리리터에 다시 현탁시키고 실온에서 15 분에서 1 시간 동안 부드러운 혼합으로 배양하십시오.

이 시점에서 형광 염료를 선택적으로 첨가할 수 있습니다. 다음으로, BA 완충액 세척을 3회 더 반복하고 1 대 100 희석으로 적절한 형광 표지된 2차 항체로 BA 100마이크로리터에 현탁하여 Resus로 세척을 마칩니다. 2 차 물질을 제거하기 위해 빛으로부터 보호 된 실온에서 몇 시간 동안 흔들면서 샘플을 배양하십시오.

a, b, a로 세 번 씻습니다. 그런 다음 먼저 Resus로 동물을 슬라이드에 장착하고 10 마이크로 리터의 b, a에 매달아 놓은 다음 넓은 구경 피펫을 사용하여 1 또는 2 마이크로 리터의 샘플을 각 슬라이드로 옮기고 동일한 부피의 장착 매체를 추가하고 슬라이드를 덮습니다. 매니큐어로 슬라이드를 부드럽게 밀봉합니다.

슬라이드는 섭씨 영하 20도에서 장기간 보관할 수 있습니다. 일반적으로 이 프로토콜을 처음 접하는 개인은 프로토콜이 길고 효율성에 영향을 줄 수 있는 많은 단계를 포함하여 문제 해결을 어렵게 만들기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 약 1560mm 플레이트에서 동물을 1 또는 2 밀리리터의 M nine 버퍼로 수집하는 것으로 시작하십시오.

동물이 너무 붐비지 않아야 합니다. M nine buffer로 동물을 원심분리하여 몇 번 씻고 동물을 매달아 다시 호흡합니다. 최종 회전 후, resus는 100마이크로리터의 M nine 버퍼에 동물을 현탁시킵니다.

그런 다음 동물을 급속 동결하고 식힌 절굿공이와 드릴을 사용하여 얼음 위에서 샘플을 갈아냅니다. 동물이 충분히 갈렸는지 확인하기 위해 자주 멈춥니다. 동물이 완전히 분쇄되면 벌레 추출물의 부피를 추정합니다.

그런 다음 동일한 부피의 2 x 웜 용해 용액을 추가하고 샘플을 얼음에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 냉각된 원심분리 사이클로 파편을 제거하고 상층액을 깨끗한 마이크로 fuge 튜브로 옮깁니다. Bradford 분석 후 샘플을 밀리리터당 3-3.5mg의 단백질로 희석합니다.

그런 다음 갓 준비한 냉장 카모 트립신 용액을 1:1200 비율로 추가합니다. 이 시점에서 샘플을 한 시간 동안 배양하도록 설정합니다. 배양 중에는 주기적으로 20마이크로리터 분취액을 취하여 즉시 SDS 완충액과 혼합한 다음 섭씨 96도에서 5분간 혼합합니다.

샘플을 추출하고 서양 혈액 분석을 수행하여 단백질의 상대적 안정성을 확인합니다. 이 절차를 시도하는 동안 분해 샘플에 프로테아제 억제제 칵테일을 추가하지 말고 대신 샘플을 얼음 위에 신속하게 보관해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 45의 근육 샤페론(muscle chaperone)에서 E 781 K ts 돌연변이는 미오신 접힘(myosin folding)과 조립(assembly)에 큰 영향을 미치므로 동물의 운동성에 영향을 미친다.

이 돌연변이가 섭씨 20도 이상의 온도에서 자랐을 때 완전히 마비되었지만 섭씨 15도에서는 그렇지 않았습니다. 섭씨 25도에서 자란 야생형 동물은 장기간의 열 충격을 받았을 때 대부분 살아남았습니다. 열 충격 반응에 대한 효과적인 조절자를 모니터링하기 위해 섭씨 15도에서 20도에서 올리면 30%만 생존했지만, 대조 스트레스 조건은 야생형 동물의 생존율이 70%로 높아졌습니다.

동물들은 6시간 동안 섭씨 37도의 열 충격에 노출되었습니다. 성인이 된 첫날, cyt orange 흡수 분석법으로 생존을 분석했습니다. 죽은 동물은 흰색 화살표로, 살아있는 동물은 노란색 화살표로 표시합니다.

여러 메타 안정 단백질의 국소화는 특정 항체를 사용하여 시각화되었습니다. 예를 들어, paramin ts mis는 제한적인 조건 하에서 근육 sarcomere 대신 다결정 조립체로 국한됩니다. 마찬가지로, 미오신 TS는 제한 온도에서 고도로 정렬된 필라멘트 구조 대신 무질서한 필라멘트를 형성합니다.

myo three와 함께 발현된 다양한 TS 돌연변이 단백질을 발현하는 동물. GFP는 미오신 확인에 있는 GFP 변화를 감시해서 검출된 것과 같이 근 필라멘트 조직에 있는 급속한 나쁘게 하는 것을 보여주었다, 근육 세포의 접히는 수용량에 있는 변화를 반영할 수 있다. UNC 45 Ts와 함께 발현된 미오신 중쇄의 단백질 분해 단편화 패턴은 미오신 접힘이 UNC 45의 영향을 받는다는 주장을 뒷받침하는 야생형 동물의 미오신 소화 프로파일과 비교하여 뚜렷한 특성을 보여줍니다.

기능 상실. 이 방법은 바다 우아함에서 proteostasis의 조절에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 다른 모델 유기체와 같은 다른 시스템에도 적용 할 수 있습니다.