Name: 사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 단백질 항상성 연구 방법으로, 행동 분석 및 면역형광 현미경을 활용하여 단백질 오접힘을 모니터링합니다. 노화와 세포 스트레스 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작업에 사용된 모든 선충 균주는 NIH National Center for Research Resources(NCRR)의 자금 지원을 받는 Caenorhabditis Genetics Center에서 제공했습니다. H.F. 엡스타인(H.F. Epstein)이 개발한 단클론 항체는 NICHD의 후원 하에 개발되고 아이오와 대학교 생물학과에서 유지 관리하는 발달 연구 하이브리도마 은행(Developmental Studies Hybridoma Bank)에서 얻었습니다. N. Shemesh는 Fay and Bert Harbour 상의 지원을 받았습니다. A.B.-Z. 이스라엘 고등교육위원회 알론 펠로우십(Alon Fellowship), 마리 퀴리 국제 재통합 보조금, 양국 과학 재단 및 이스라엘 과학 재단(보조금 번호 91/11)의 보조금의 지원을 받았습니다.

살아있는 유기체의 단백질 접힘을 모니터링하기 위한 행동 분석 사용
1. 행동 분석을 위한 동물 동기화
<ol>
	<li>예쁜꼬마선충36의 유지를 위한 배지 및 플레이트 준비, 음식 준비 및 동물 성장 조건을 포함한 표준 방법을 따르십시오. 온도(15-25 °C), 개체군 크기 및 식량 가용성을 포함한 재배 조건을 신중하게 제어하십시오. 박테리아 또는 곰팡이 오염이 보이는 접시는 버리십시오.</li>
	<li>15-30개의 배아를 선택하여 새 플레이트로 옮기고 실험 기간 동안 원하는 온도(15-25°C)에서 성장합니다. 또는 접시에 10-20마리의 육식 성체를 놓고 30-60분 동안 알을 낳게 한 다음 접시에서 꺼냅니다. 배아를 직접 채취하는 것과 임신 성체를 설정하는 것 모두 연령(±6시간)에 약간의 변동성을 줄 것입니다. 이러한 변동성을 줄이려면 특정 단계(예: 쉼표 단계)에서 배아를 선택하거나 이제 막 알을 낳기 시작한 성인 10-20명(성인기 2일차)을 설정합니다. 이 치료법은 스트레스가 많고 단백질화에 영향을 줄 수 있으므로 가능하면 표백을 통한 동기화를 피하십시오.</li>
	<li>동기화된 동물을 선택하고 채점을 위해 분석 플레이트로 옮긴 다음 폐기합니다.</li>
</ol>
2. 이동 분석
 동기화 된 동물을 선택하고 움직임 점수 (15-25 ° C)를 위해 원하는 온도에서 깨끗한 플레이트로 옮깁니다. 각 생물학적 복제에 대해 >20마리의 동물을 채점하고 실험 조건당 최소 3회 반복 분석을 수행합니다. Wilcoxon Mann-Whitney 순위합 검정을 사용하여 두 개의 독립적인 실험 조건을 비교할 수 있습니다.
<ol>
	<li>가벼운 운동 장애를 분석하기 위해 깨끗한 박테리아 잔디밭 중앙에 5-7마리의 동물을 함께 놓고 동물들이 접시 위에서 2분 동안 움직이도록 합니다. 이 시간 간격은 야생형 동물의 90%가 1cm 원을 지우는 데 걸린 시간을 기준으로 결정되었습니다.</li>
	<li>2분 이내에 1cm 원을 지우지 않은 동물의 수(예: 설정된 지점에서 반경 1cm 이내에 남아 있는 동물)를 조정되지 않은 것으로 계산합니다.</li>
	<li>심각한 운동 장애를 분석하려면 동물을 깨끗한 박테리아 잔디밭에 놓으십시오.</li>
	<li>시간 0(t=0)과 5분 후(t=5)에 여러 동물을 촬영합니다. 5분 후에도 몸길이가 하나도 움직이지 않은 동물을 마비된 것으로 점수를 매깁니다.</li>
</ol>
3. 내열성
<ol>
	<li>>20마리의 동기화된 동물을 선택하여 450μl 열 충격(HS) 완충액이 포함된 24웰 플레이트로 옮깁니다(표 1). 각 생물학적 복제에 대해 >20마리의 동물에 점수를 매기고 실험 조건당 최소 4회 반복 분석을 수행합니다.</li>
	<li>24웰 플레이트를 가열된 수조에 옮깁니다. HS 온도와 지속 시간은 성장 조건, 특히 재배 온도에 크게 좌우됩니다.</li>
	<li>HS 완충액에 SYTOX 오렌지 9μl를 보충합니다.</li>
	<li>TXR 필터가 있는 형광 입체경을 사용하여 염료 흡수를 모니터링하여 동물의 생존 점수를 매깁니다. 염료를 섭취한 동물들은 죽었다. Wilcoxon Mann-Whitney 순위합 검정을 사용하여 두 개의 독립적인 실험 조건을 비교할 수 있습니다.</li>
</ol>
면역염색 및 태그가 지정된 단백질을 사용하여 특정 세포의 단백질 접힘 모니터링
4. 면역염색을 통한 단백질 국소화 모니터링
<ol>
	<li>필요한 단계에서 최소 30마리의 동물을 M9 buffer36이 들어있는 Eppendorf tube로 옮깁니다.</li>
	<li>짧은 저속 원심분리 단계(3,000rpm/900 x g, 2분)를 수행하고 다시 현탁하여 M9 버퍼로 동물을 몇 번 세척합니다.</li>
	<li>튜브를 얼음 위에 몇 분 동안 올려 식히십시오.</li>
	<li>여분의 액체를 제거하고 500μl의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 용액으로 배양합니다(표 2). 배양 시간은 검사한 각 단백질에 대해 보정해야 하며 실온에서 약 5-30분이어야 합니다. 4°C에서 장기간 배양을 수행할 수도 있지만 이는 샘플 투과성을 손상시킬 수 있습니다.</li>
	<li>원심분리(3,000rpm, 1-2분)로 PBS-Tween(pH 7.2) 완충액으로 고정 동물을 3회 세척합니다. 이 단계에서 동물은 4 ° C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>원심분리(3,000rpm, 1-2분)로 동물을 수집합니다.</li>
	<li>후드에서 대부분의 상층액을 제거하고 펠릿을 1ml β-메르캅토에탄올(β-ME) 용액에 재현탁합니다(표 2).</li>
	<li>37°C에서 밤새 배양하고 너트레이터에서 부드럽게 흔듭니다.</li>
	<li>후드에서 PBS-Tween(pH 7.2) 버퍼로 동물을 3번 세척합니다.</li>
	<li>동물을 50-100 μl의 PBS-Tween (pH 7.2)에 재현탁시킵니다. 이 단계에서 동물은 4 ° C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>원심분리(3,000 rpm, 1-2분)로 동물을 수집하고 PBS-Tween 완충액의 대부분을 제거합니다.</li>
	<li>각 튜브에 100-150 μl의 콜라겐 분해 효소 용액을 추가하고 37 ° C에서 강한 교반으로 배양합니다 (Thermo-mixer 또는 진탕 인큐베이터 사용).</li>
	<li>부화 5분 후부터 실체현미경으로 동물을 자주 검사합니다. 동물의 20%가 망가졌을 때, 얼음 위에 튜브를 올려 반응을 멈춥니다. 이 단계는 매우 민감합니다! 치료 기간은 고정 조건에 따라 다르며 균주에 따라 크게 다를 수 있습니다. 장기간의 부화는 동물의 완전한 퇴화를 초래할 수 있습니다. 사용된 각 효소 배치에 대해 조건을 보정해야 하며 분해를 주의 깊게 모니터링해야 합니다.</li>
	<li>PBS-Tween(pH 7.2)에서 동물을 두 번 세척한 다음 원심분리(3,000rpm, 1-2분)로 동물을 수집하고 PBS-Tween 완충액의 대부분을 제거합니다.</li>
	<li>1ml의 AbA 용액(표 2)을 넣고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 이 단계에서 동물은 4 ° C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>원심분리(3,000rpm, 1-2분)로 동물을 수집하고 200μl AbA에 재현탁합니다.</li>
	<li>1:100-1:1,000으로 희석된 1차 항체를 AbA 용액에 넣고 부드럽게 흔들어 배양합니다. 배양 온도와 기간은 항체마다 다를 수 있으며 검사하는 각 단백질에 대해 보정해야 합니다. 우리는 실온에서 하룻밤 배양으로 시작합니다.</li>
	<li>원심분리(3,000rpm, 1-2분)로 동물을 씻습니다.</li>
	<li>AbA 완충액(1ml)을 추가하고 실온에서 15-60분 동안 부드럽게 혼합하여 배양합니다. 이 단계에서 동물은 4 ° C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>선택 사항: 샘플은 형광 염료로 염색할 수도 있습니다. 이를 위해 염료(예: DAPI(2mg/ml) 또는 Phalloidin(1:100))을 200μl AbA에 첨가하고 최대 1시간 동안 부드럽게 배양합니다. 이 단계는 2차 항체를 세척하는 단계 중 하나 중에 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>4.18-4.19단계를 반복하여 동물을 3번 씻깁니다.</li>
	<li>100μl AbA에 적절한 형광 표지된 2차 항체를 1:100으로 희석하여 추가합니다.</li>
	<li>샘플을 덮고(또는 어두운 튜브에) 실온에서 몇 시간 동안 흔들면서 배양합니다.</li>
	<li>AbA 완충액(1ml)에서 배양하고 실온에서 15-60분 동안 부드럽게 혼합한 후 원심분리(3,000rpm, 1-2분)하여 동물을 3회 세척합니다. 이 단계에서 동물은 4 ° C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>슬라이드에 동물을 장착하려면 모든 액체를 제거하고 동일한 완충액 10μl에 재현탁합니다.</li>
	<li>동물이 깎이지 않도록 피펫 끝의 끝을 자르고 샘플의 1-2 μl를 슬라이드로 옮깁니다.</li>
	<li>1:1 비율로 장착 매체를 추가합니다.</li>
	<li>커버슬립으로 슬라이드를 부드럽게 덮고 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드를 즉시 모니터링하지 않으면 슬라이드를 -20°C에서 장기간 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>
5. 태그가 지정된 단백질의 국소화 모니터링
<ol>
	<li>필요한 단계에서 슬라이드의 M9 버퍼 10ml 드롭에 최소 15마리의 동물을 수집합니다.</li>
	<li>"지렁이 선택"을 사용하여 동물을 파라포름알데히드 용액 10ml 방울(4%)(표 2)로 옮기고 모든 동물이 움직임을 멈출 때까지 기다립니다(약 5분).</li>
	<li>"웜 픽(worm pick)"을 사용하여 동물을 M9 버퍼 2ml 드롭과 장착 매체(1:1)로 이동합니다(표 2).</li>
	<li>커버 슬립으로 동물을 부드럽게 덮고 매니큐어로 밀봉하십시오.</li>
</ol>
단백질 접힘 및 안정성을 모니터링하기 위해 ex vivo 분석 사용
6. 부분 분해
<ol>
	<li>마이크로분리 튜브에 1-2ml M9 완충액을 사용하여 15개의 플레이트(60mm)에서 동물을 세척합니다. 동물이 붐비지 않아야 하며 실험 기간 동안 충분한 음식을 구할 수 있어야 합니다.</li>
	<li>원심분리(3,000rpm, 2분)하고 동물을 다시 매달아 M9 버퍼로 동물을 몇 번 씻습니다.</li>
	<li>마지막 회전 후 100μl M9 완충액에 동물을 다시 현탁시킵니다.</li>
	<li>액체 N에서 급속 동결2. 샘플은 -80°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>냉각된 유봉과 전동 드릴(휴대용 조직 배양 드릴도 사용할 수 있음)을 사용하여 샘플을 분쇄합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하고 과열을 피하십시오.</li>
	<li>분쇄가 완료되었는지 확인하기 위해 실체 현미경으로 동물을 자주 검사합니다. 온전한 동물이 남아 있으면 절차를 반복하십시오.</li>
	<li>웜 추출물을 피펫팅하여 부피를 추정합니다.</li>
	<li>(2x) 웜 용해 용액을 1:1 비율로 추가합니다(표 3). 어떤 종류의 프로테아제 억제제도 사용하지 마십시오.</li>
	<li>얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>예냉각된 원심분리기(4°C)에서 원심분리(1,000 x g에서 2분 동안)로 이물질을 제거합니다.</li>
	<li>상층액을 깨끗한 마이크로분리 튜브에 옮깁니다. 시료는 직접 사용하거나 -80°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>키모트립신 용액(표 3)을 준비하고 사용할 때까지 얼음에 보관합니다.</li>
	<li>Bradford 분석을 사용하여 총 단백질 농도를 측정합니다.</li>
	<li>필요한 경우 총 단백질 농도가 3-3.5 mg/ml가 되도록 샘플을 희석합니다.</li>
	<li>총 단백질 용해물(1:1,200)에 키모트립신 용액을 추가합니다.</li>
	<li>배양 시간을 결정하기 위해 60분 동안 chymotrypsin으로 샘플을 배양합니다. 다른 시점(예: 0, 5, 20, 40 및 60분)에서 샘플에서 20μl 분취액을 제거하고 즉시 SDS 샘플 버퍼와 혼합하고 96°C에서 5분 동안 끓입니다. *또는 다른 농도의 chymotrypsin으로 샘플을 배양하고 SDS 샘플 버퍼를 추가하고 5분 동안 끓여서 특정 시간 후에 반응을 중지합니다. 96 °C에서.</li>
	<li>SDS-PAGE 젤에서 샘플을 실행합니다.</li>
	<li>단백질의 상대적 안정성을 결정하기 위해 적절한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다.</li>
	<li>시료 간에 유의미한 변화를 보이는 최적의 조건(키모트립신 농도 및 분해 시간)을 결정하고 이러한 조건을 향후 실험에 사용합니다.</li>
	<li>NIH 이미지 겔 모듈과 같은 밀도 측정 소프트웨어를 사용하여 다양한 분해 산물(저분자량 분절)의 강도를 측정합니다.</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

세포 단백질 정체 용량의 프로브는 접힘 환경의 변화에 매우 민감해야 하며 단백질 접힘 품질 관리 기능을 실시간으로 평가할 수 있도록 쉽게 모니터링할 수 있어야 합니다. 준안정 단백질을 단백질 정체 능력의 프로브로 사용하여 표현형, 세포내 단백질 국소화 및 단백질 형태의 변화를 모니터링했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 운동성, 근육 필라멘트 조직 및 미오신 안정성을 포함한 근육 단백질 관련 표현형에 중점을 둡니다. 그러나 이러한 프로토콜은 다른 접이식 센서를 모니터링하기 위해 수정할 수 있습니다. 행동 표현형의 경우 유기체 수준에서 단백질 기능을 결정하기 위한 간단하고 강력한 분석을 설계하는 것이 중요합니다. 예를 들어, dyn-1 의 ts 돌연변이는 제한 조건에서 엔도사이토시스 및 시냅스 소포 재활용의 급속한 손실로 이어집니다. 결과적으로, 체강액으로 분비된 GFP의 흡수 또는 GFP(SNB-1::GFP)로 태그된 시냅스 단백질인 시냅스토브레빈-1의 국소화에 의해 각각 모니터링될 수 있습니다28</su...

단백질 접힘, 전좌 및 조립/분해뿐만 아니라 mRNA 전사, 처리 및 번역과 같은 단백질 생합성의 다양한 단계의 상호 작용은 기능을 위해 세포 단백질 품질 관리 기계에 의존하는 준안정 단백질의 부하를 결정합니다1. 따라서 단백질 품질 관리 기계의 부재 또는 오작동은 다양한 유형의 세포 기계의 기능 저하와 단백질 잘못 접힘 질환의 발병을 초래할 수 있습니다2-7. 단백질 접힘 및 제거 기계의 용량이 준안정 단백질의 부하와 균형을 이룰 때 단백질 항상성(proteostasis)이 달성되며, 이는 궁극적으로 잘못 접힌 단백질의 축적과 세포 내 응집을 방지하는 상태6입니다. 잘못 접힌 단백질의 축적은 열 충격 인자(HSF-1)와 같은 스트레스 유도 전사 인자를 활성화하고 세포 보호 스트레스 반응을 활성화하는 신호로 생각됩니다6,8.
후생동물에서 단백질분해 네트워크의 기능에 대한 우리의 이해는 대부분 체외 재구성 연구와 조직 배양 세포 및 단세포 유기체에 대한 관찰에서 파생되었습니다9. 예를 들어, 단백질 손상을 예방하고 해결하는 분자 샤페론에 대한 연구는 샤페론 매개 단백질 접힘, 분해 및 전좌 메커니즘에 대한 생화학적 및 세포 생물학적 연구에 중점을 두었습니다10-13. 이에 비해 후생동물의 서로 다른 세포와 조직에 있는 다양한 단백질분해 성분의 통합 기능에 대한 정보는 "정상적인" 성장 조건과 스트레스에 대한 반응에 대한 제한된 정보만 얻을 수 있습니다11. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 세포 단백질의 품질 관리는 세포를 비자율적으로 조절할 수 있다는 발견은, 온도를 감지하는 두 뉴런의 돌연변이가 열 충격 반응의 활성화를 차단하고 내열성을 감소시킬 수 있다는 것을 보여주는 실험에서 반영된 바와 같이, 다세포 유기체의 단백질 단백 조절을 연구할 필요성을 보여주었습니다14-17. 그러나 다양한 분자 샤페론 패밀리(molecular chaperone family)와 같은 단백질분해 네트워크(proteostasis network)가 온전한 후생동물(metazoan)의 조직에서 어떻게 기능하는지, 그리고 이러한 네트워크가 발달 및 노화 과정에서 얼마나 역동적인지에 대한 응집력 있는 그림이 빠져 있습니다. 이 목표를 달성하기 위해서는 발달 및 노화 과정에서 다세포 유기체의 다양한 세포의 단백질 생성 능력을 결정하기 위해 살아있는 동물의 단백질체 유지 관리를 모니터링하기 위한 신뢰할 수 있는 센서가 필요합니다.
주어진 단백질이 세포 프로테오스타시스(cellular proteostasis)의 센서로 기능하기 위해서는 세포 내 관련 없는 단백질의 접힘을 최소한으로만 방해하면서 세포 접힘 환경의 변화에 반응해야 합니다. 살아있는 유기체에서 세포 단백질화(proteostasis)의 유지 및 회복을 탐구하기 위해 접힘 센서에 의존하는 두 가지 보완적인 접근 방식을 취할 수 있습니다. 첫 번째는 반딧불이 루시페라제18-20 또는 degron21-24로 태그된 GFP와 같은 단백질 단백 분해 기계에 의존하는 것으로 알려진 실험적으로 확인된 준안정 단백질을 기반으로 설계된 접힘 센서에 의존합니다. 두 번째 접근법에서는 세포 환경의 점진적인 변화에 반응하는 온도에 민감한 단백질(ts) 또는 연령 의존적 응집 단백질과 같은 내인성 준안정 단백질을 추적하여25-27. 설계된 접힘 센서는 필수적인 생물학적 기능을 제공하지 않지만 GFP 표지 단백질과 같은 강력한 보고 분석법으로 검출할 수 있는 이점을 제공하며 다양한 세포 및 동물 모델에 사용할 수 있습니다18. 그러나, 단일 외래 단백질을 도입하는 것은 접힘 환경에 영향을 미칠 수 있기 때문에(27), 이러한 폴리펩티드는 세포 단백질화 기계에 과부하를 일으킬 수 있다. 대안적으로, 그들이 보고하는 세포에 고유하지 않은 설계된 접힘 센서는 세포의 단백질 작용 용량의 변화에 영향을 받지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 하나의 GFP 표지된 프로테아솜 리포터 기질은 표현형이 검출되기 전에 프로테아솜의 ~90%가 억제되어야 했습니다23. 대조적으로, 세포의 단백질 단백질(proteostasis machineries)에 의존하는 내인성 준안정 단백질은 세포 민감도 범위 내에 있다는 이점을 제공합니다. 그러나 이러한 단백질의 잘못된 접힘과 관련된 기능 상실은 세포 기능과 유기체의 생존력에도 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서는 내인성 C. elegans 접는 센서의 사용에 중점을 둘 것입니다.
C. elegans는 발달 및 노화 연구를 위한 잘 정립된 후생동물 모델로, 많은 보존된 생물학적 경로를 활용하고 세포 생물학, 생화학 및 유전적 접근법의 조합을 사용하여 세포의 단백질 접힘을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 준안정 단백질을 표현형, 국소화 및 안정성의 변화를 모니터링하여 단백질 발식 능력의 프로브로 사용했습니다. 또한 간단한 행동 분석을 통해 다양한 단백질 기능을 연구할 수 있습니다. 마찬가지로, 단백질의 실질적인 국소화 오소화(mislocalization)는 세포 단백질 품질 관리 네트워크가 세포의 요구에 적응하지 못할 때 발생합니다. 단백질은 형광 표지된 단백질을 사용하거나 면역 염색을 통해 살아있는 동물의 세포에서 쉽게 시각화할 수 있습니다. 마지막으로, ex vivo 방법을 사용하여 단백질 발현 및 안정성을 모니터링할 수 있습니다. 이를 통해 단백질 국소화 및 안정성에 대한 심층 분석과 함께 행동 및 생리학적 변화를 빠르고 간단하게 스크리닝할 수 있어 단백질 단백질 변형제(proteostasis modifier)를 모니터링할 수 있습니다. 이러한 다양한 방법을 결합하면 세포의 단백질 접힘 환경에 대한 광범위한 관점을 얻을 수 있습니다. 실제로, 이 전략은 예쁜꼬마선충(C. elegans), 효모, 조직 배양 및 박테리아15,25-35에서 프로테오스타시스 섭동을 모니터링하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>항체 staning 및 fiaxtion</td><td>파라포름알데히드</td><td>Merc</td><td>8187151000</td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소</td><td>시그마</td><td>C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merc</td><td>8034560100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>&beta; -ME</td><td>Sigma</td><td>8057400250</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Di Cam</td><td>000-40-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 부분 다이제스트&nbsp;</td><td>Chymotrypsin</td><td>Sigma</td><td>C4129-250MG</td></tr><tr><td>내열성</td><td>SYTOX 오렌지</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Amaresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC 형광 입체경</td><td>Leica</td><td></td><td>TXR 필터</td></tr><tr><td>EXi 블루 형광 현미경 카메라</td><td>QImaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>ConfoCor 3/510 META 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펠릿 유봉</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>펠릿 유봉 무선 모터</td><td>Kontes</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17 마이크로 원심분리기 시리즈</td><td>열</td><td>75002455</td><td>냉장, , 230 V 50/60 Hz, ClickSeal 생물 봉쇄 뚜껑이 있는 24x 1.5/2.0 ml 로터 포함</td></tr></tbody></table>

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

단백질의 접힘과 조립은 단백질 기능, 세포의 장기적인 건강 및 유기체의 수명에 필수적입니다. 역사적으로 단백질 접힘의 기능과 조절은 시험관 내, 분리된 조직 배양 세포 및 단세포 유기체에서 연구되었습니다. 최근 연구에서는 단백질 항상성(단백질분해), 신진대사, 발달, 노화 및 온도 감지 사이의 연관성을 밝혀냈습니다. 이러한 발견은 모델 메타 동물 유기체 Caenorhabditis elegans에서 단백질 접힘을 모니터링하기위한 새로운 도구의 개발로 이어졌습니다. 저희 실험실에서는 단백질의 잘못 접힘을 모니터링하기 위해 온도에 민감하거나 자연적으로 발생하는 준안정 단백질을 접힘 환경의 센서로 사용하여 행동 분석, 이미징 및 생화학적 접근 방식을 결합합니다. 특정 단백질의 잘못된 접힘과 관련된 행동 분석은 단백질 접힘에 대한 간단하고 강력한 판독값을 제공하여 접힘을 조절하는 유전자 및 조건을 빠르게 스크리닝할 수 있습니다. 마찬가지로, 이러한 잘못된 접힘은 세포의 단백질 오국소화와 관련될 수 있습니다. 따라서 단백질 국소화를 모니터링하면 다양한 발달 단계와 변화하는 조건에 직면하여 서로 다른 조직에서 발생하는 세포 접힘 용량의 변화를 강조할 수 있습니다. 마지막으로, 생화학적 도구를 ex vivo 사용하여 단백질의 안정성과 형태를 직접 모니터링할 수 있습니다. 따라서 행동 분석, 이미징 및 생화학 기술을 결합함으로써 각각 유기체, 세포 및 단백질의 해상도에서 단백질 잘못 접히는 것을 모니터링할 수 있습니다.

손상된 접힘 환경은 단백질의 미스폴딩(misfolding) 및 응집을 유발할 수 있습니다. 단백질 미스폴딩은 구조적 변화와 관련이 있으며 단백질 기능의 상실을 초래합니다. 본 연구에서는 온전한 동물, 특정 세포 및 단백질 추출물 내에서 단백질 접힘과 기능을 모니터링하기 위해 상호 보완적인 접근 방식을 사용합니다. 알려진 불안정화 돌연변이와 관련된 강력한 행동 및 세포 표현형에 근거하여 접힘 센서를 지능적으로 선택하면, 이를 통해 단백질 접힘 환경의 변화를 모니터링할 수 있습니다. 내인성 온도 민감성 돌연변이 단백질의 예로는 굵은 근육 필라멘트 단백질인 파라미오신(C. elegans UNC-15)의 L799F 돌연변이가 있습니다37. 이 미스센스 돌연변이는 코일드-코일(coiled-coil) 상호작용에 영향을 주어, 제한 온도에서 파라미오신(ts)이 미스폴딩되고 근육 근절 대신 파라결정성 조립체(paracrystalline assemblies)로 잘못 국소화되게 합니다. 이러한 국소화 오류는 굵...

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 CENO R elegance에서 다음 실험의 전반적인 목표는 유기체, 세포 및 단백질의 세 가지 수준에서 잘못 접힌 단백질을 모니터링하는 것입니다. 운동성 또는 내열성과 같은 행동 표현형은 온도에 민감하거나 자연적으로 발생하는 유기체 수준에서 단백질 항상성의 변화를 판독하는 역할을 합니다. 메타 안정 단백질은 단백질 잘못 접힘과 관련될 수 있는 단백질 mis-localization을 추적하는 데 사용됩니다.체외 부분 분해 분석법은 단백질 안정성을 직접 모니터링합니다. 결과는 열 저항성 분석, 면역 형광 현미경 검사 및 서양 혈액 분석을 기반으로 다양한 배양 온도에서 단백질 분해 용량의 변화를 보여줄 수 있습니다. 이러한 절차는 제 연구실의 대학원생들이 시연할 것입니다.행동 분석은 ish ido에 의해 입증되고 Shai는 면역 염색을 입증하고 ANA는 flunking을, sheron은 부분 소화를 입증합니다. 온도 내성을 측정하기 위한 이 프로토콜에는 동물을 동기화하기 위한 준비 단계와 움직임 분석이 수반됩니다. 둘 다 텍스트 프로토콜에 설명되어 있으며, 최소 20마리의 동기화된 동물을 포함하는 복제물을 수집하는 것으로 시작합니다.24에서는 450마이크로리터의 열 충격 버퍼를 포함하는 잘 재생된 우물. 각 웰에 9마이크로리터의 시톡신을 보충하십시오. 이제 접시를 온수 욕조로 옮깁니다.열 충격, 온도 및 지속 시간은 성장 조건에 크게 좌우됩니다. 특히, 재배 온도는 동물의 다이 흡수를 모니터링하여 동물의 생존 점수를 매깁니다. TXR 필터가 있는 형광 입체경을 사용하면 주사위를 차지하는 동물이 죽습니다.kine과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점인 수동 채점에 의한 내성은 동물 사망률에 대한 시각적 판독을 사용하여 이 에세이를 훨씬 빠르고 재현 가능하게 만든다는 것입니다. 필요한 단계에서 최소 30마리의 동물을 M nine 버퍼가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. M nine으로 짧고 낮은 속도의 원심분리 단계를 수행하고 M nine에서 Resus를 매달아 동물을 몇 번 씻습니다.그런 다음 튜브를 얼음 위에 몇 분 동안 올려 식힙니다. 냉각되면 여분의 액체를 제거하고 튜브를 배양합니다. 얼음 차가움의 500 마이크로 리터에서, 4 % PARAFORM 알데히드.배양 시간은 검사한 각 단백질에 대해 보정해야 하며 실온에서 약 5-30분이어야 합니다. 이제 고정된 동물을 원심분리에 의해 pH 7.2에서 PBS 트윈으로 세 번 세척합니다. 원심분리는 달리 명시되지 않는 한 항상 3000RPM에서 1분 또는 2분 동안 수행됩니다.후드에서 대부분의 상등액을 제거하고 펠릿을 1ml의 빔 메르캅토에탄올 용액에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 동물을 부화시키고 다음 날 후드에서 부드럽게 흔들어 줍니다. PBST로 원심분리와 Resus로 동물을 세 번 씻습니다.50-100 마이크로 리터의 PBST로 세척을 마치고 다른 원심 분리 후이 PBST의 대부분을 제거합니다. 다음으로, 100-150 마이크로 리터의 콜라겐 분해 효소 용액을 넣고 섭씨 37도에서 강한 교반으로 동물을 배양합니다. 써모 믹서 또는 진탕 인큐베이터를 사용하십시오.5분 후 실체 현미경으로 주기적인 검사를 시작합니다. 동물의 5분의 1이 망가졌을 때, 얼음 위에 튜브를 올려 반응을 멈춘다. 이 단계는 매우 민감합니다.치료 기간은 고정 조건에 따라 다르며 균주간에 크게 달라질 수 있습니다. 장기간의 부화는 동물의 완전한 퇴화를 초래할 수 있습니다. 각 효소 배치 전에 조건을 보정해야 하며 분해를 주의 깊게 모니터링해야 합니다.다음으로, PBST에서 동물을 두 번 씻습니다. 원심분리로 동물을 수집하고 대부분의 PBST를 제거합니다. 그런 다음 BA 용액의 1 밀리리터를 추가하고 실온에서 한 시간 동안 부드러운 락킹으로 인큐베이션을 선행하여 원심분리로 동물을 수집하고 b의 200 마이크로 리터에서 다시 현탁액, A.Now 1 차 항체를 추가하고 실온에서 부드러운 락킹으로 하룻밤 배양을 시작합니다.이러한 매개변수는 보정해야 합니다. 다음으로, 원심 분리로 동물을 씻으십시오. b, A의 밀리리터에 다시 현탁시키고 실온에서 15 분에서 1 시간 동안 부드러운 혼합으로 배양하십시오.이 시점에서 형광 염료를 선택적으로 첨가할 수 있습니다. 다음으로, BA 완충액 세척을 3회 더 반복하고 1 대 100 희석으로 적절한 형광 표지된 2차 항체로 BA 100마이크로리터에 현탁하여 Resus로 세척을 마칩니다. 2 차 물질을 제거하기 위해 빛으로부터 보호 된 실온에서 몇 시간 동안 흔들면서 샘플을 배양하십시오.a, b, a로 세 번 씻습니다. 그런 다음 먼저 Resus로 동물을 슬라이드에 장착하고 10 마이크로 리터의 b, a에 매달아 놓은 다음 넓은 구경 피펫을 사용하여 1 또는 2 마이크로 리터의 샘플을 각 슬라이드로 옮기고 동일한 부피의 장착 매체를 추가하고 슬라이드를 덮습니다. 매니큐어로 슬라이드를 부드럽게 밀봉합니다.슬라이드는 섭씨 영하 20도에서 장기간 보관할 수 있습니다. 일반적으로 이 프로토콜을 처음 접하는 개인은 프로토콜이 길고 효율성에 영향을 줄 수 있는 많은 단계를 포함하여 문제 해결을 어렵게 만들기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 약 1560mm 플레이트에서 동물을 1 또는 2 밀리리터의 M nine 버퍼로 수집하는 것으로 시작하십시오.동물이 너무 붐비지 않아야 합니다. M nine buffer로 동물을 원심분리하여 몇 번 씻고 동물을 매달아 다시 호흡합니다. 최종 회전 후, resus는 100마이크로리터의 M nine 버퍼에 동물을 현탁시킵니다.그런 다음 동물을 급속 동결하고 식힌 절굿공이와 드릴을 사용하여 얼음 위에서 샘플을 갈아냅니다. 동물이 충분히 갈렸는지 확인하기 위해 자주 멈춥니다. 동물이 완전히 분쇄되면 벌레 추출물의 부피를 추정합니다.그런 다음 동일한 부피의 2 x 웜 용해 용액을 추가하고 샘플을 얼음에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 냉각된 원심분리 사이클로 파편을 제거하고 상층액을 깨끗한 마이크로 fuge 튜브로 옮깁니다. Bradford 분석 후 샘플을 밀리리터당 3-3.5mg의 단백질로 희석합니다.그런 다음 갓 준비한 냉장 카모 트립신 용액을 1:1200 비율로 추가합니다. 이 시점에서 샘플을 한 시간 동안 배양하도록 설정합니다. 배양 중에는 주기적으로 20마이크로리터 분취액을 취하여 즉시 SDS 완충액과 혼합한 다음 섭씨 96도에서 5분간 혼합합니다.샘플을 추출하고 서양 혈액 분석을 수행하여 단백질의 상대적 안정성을 확인합니다. 이 절차를 시도하는 동안 분해 샘플에 프로테아제 억제제 칵테일을 추가하지 말고 대신 샘플을 얼음 위에 신속하게 보관해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 45의 근육 샤페론(muscle chaperone)에서 E 781 K ts 돌연변이는 미오신 접힘(myosin folding)과 조립(assembly)에 큰 영향을 미치므로 동물의 운동성에 영향을 미친다.이 돌연변이가 섭씨 20도 이상의 온도에서 자랐을 때 완전히 마비되었지만 섭씨 15도에서는 그렇지 않았습니다. 섭씨 25도에서 자란 야생형 동물은 장기간의 열 충격을 받았을 때 대부분 살아남았습니다. 열 충격 반응에 대한 효과적인 조절자를 모니터링하기 위해 섭씨 15도에서 20도에서 올리면 30%만 생존했지만, 대조 스트레스 조건은 야생형 동물의 생존율이 70%로 높아졌습니다.동물들은 6시간 동안 섭씨 37도의 열 충격에 노출되었습니다. 성인이 된 첫날, cyt orange 흡수 분석법으로 생존을 분석했습니다. 죽은 동물은 흰색 화살표로, 살아있는 동물은 노란색 화살표로 표시합니다.여러 메타 안정 단백질의 국소화는 특정 항체를 사용하여 시각화되었습니다. 예를 들어, paramin ts mis는 제한적인 조건 하에서 근육 sarcomere 대신 다결정 조립체로 국한됩니다. 마찬가지로, 미오신 TS는 제한 온도에서 고도로 정렬된 필라멘트 구조 대신 무질서한 필라멘트를 형성합니다.myo three와 함께 발현된 다양한 TS 돌연변이 단백질을 발현하는 동물. GFP는 미오신 확인에 있는 GFP 변화를 감시해서 검출된 것과 같이 근 필라멘트 조직에 있는 급속한 나쁘게 하는 것을 보여주었다, 근육 세포의 접히는 수용량에 있는 변화를 반영할 수 있다. UNC 45 Ts와 함께 발현된 미오신 중쇄의 단백질 분해 단편화 패턴은 미오신 접힘이 UNC 45의 영향을 받는다는 주장을 뒷받침하는 야생형 동물의 미오신 소화 프로파일과 비교하여 뚜렷한 특성을 보여줍니다.기능 상실. 이 방법은 바다 우아함에서 proteostasis의 조절에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 다른 모델 유기체와 같은 다른 시스템에도 적용 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을...

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

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SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

비브리오 cholerae : 박테리아 Pathogenesis을 공부 모델 생물체 - 인터뷰

배우세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 단백질 항상성 연구 방법으로, 행동 분석 및 면역형광 현미경을 활용하여 단백질 오접힘을 모니터링합니다. 노화와 세포 스트레스 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

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