Name: 기본 Caenorhabditis elegans 방법 : 동기화 및 전망 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 학습하세요 C. elegans 동기화 방법을 알칼리성 하이포클로라이트 용액을 이용한 1령 유충 단계 동기화 기술입니다. 이 프로토콜은 발달생물학 연구에서 균일한 실험군을 확보하여 유전자 기능 분석에 필수적인 기초 기술을 제공합니다.

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저자는 금융에 대한 MICINN (PTA 프로그램 몬트 세 라트 포르 드 라 Riva을 지원), AGAUR (로라 Fontrodona로 박사 원정대), Instituto 드 건배 카를로스 III (미구엘 Servet 프로그램 줄리안 Cerón을 지원), 그리고 마리 퀴리 IRG, ISCIII 및 IDIBELL을 인정하고 싶습니다 실험실.

1. 프로토콜 : 11 표백을위한 Culturing 웜 C의 대형 인구 elegans은 액체 언론이나 접시의 단단한 미디어 중 culturing 그들에 의해 얻을 수 있습니다. 그들은 일반적으로 E.으로 고체 NGM (선충류 성장 미디어)와 수사관에 재배되는 대장균의 (열에 13 또는 냉간 14에 의해, 자외선 12 시까지 사망) 생사 중 접시에 추가됩니다 세균. 가장 일반적인 절차는 라이브 OP50 E.을 사용합니다 uracil의 합성에 결함이 있고 벌레를 가리는 것이 두꺼운 레이어로 자라다 수 없습니다 대장균. <ol><li> NaCl 3 G, 한천의 17g 및 펩톤 2.5 g을 섞어서 H 2 O에의 975 ML에 추가 50 분 동안 압력솥. </li><li> 55 ° C.에 플라스크를 냉각 </li><li> 1 M CaCl 2 일 ML, 에탄올 5 MG / ML 콜레스테롤 1 ML, 1 M MgSO 4 개 중 1 개 ML과 1 M KPO 4 버퍼의 25 ML (그들 모두 있지만 콜레스테롤 이전 autoclav 추가ED). </li><li> 멸균 절차를 사용하여 페트리 접시에 NGM 솔루션을 분배, 그들의 부피의 2 / 3로 접시를 채우십시오. </li><li> 일단 건조, 그것은 오염 물질의 검출을위한 사용하기 전에 2-3 일동안은 실온에서 번호판을 떠날 것이 좋습니다. OP50 중에 행진을 준비한다 글리세롤 주식에서 대장균 (OP50이 Caenorhabditis 유전학 센터에서 구할 수 있습니다.) </li><li> 하나의 식민지를 선택하고 교반과 함께 37 ° C에서 하룻밤 LB에 들어라. </li><li> 층류에서 뚜껑을 제거하여 접시에서 증발하고 멸균 파스퇴르 피펫으로 접시의 중앙에 OP50를 추가하는 수분을 초과 허용합니다. </li><li> OP50 E. 허용 대장균의 잔디는 8 시간 동안 실온이나 37 ° C에서 하룻밤 사이에 성장합니다. </li><li> 접시 (37시 incubated 경우 ° C 플레이트를 사용하기 전에 룸 온도에서 냉각한다)에 웜의 원하는 금액을 추가합니다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 미디어의 동일한 금액의 용탕 주입피펫이나 펌프 디스펜서와 함께 접시에 접시에 한천 같은 볼륨을 보장하고 stereomicroscope를 집중할 필요가없이 번호판 이동을 용이하게합니다. </li><li> 실온 또는 4 ° C.에서 컨테이너에 보관하면 플레이트 (씨앗을 품고 및 박테리아와 unseeded 모두) 몇 주 준비된 후 사용할 수 있습니다 </li><li> 접시의 가장자리에 박테리아를 도금하지 마십시오. 잔디 벌레들이 측면을 크롤 링하는 접시의 가장자리에 확장하면 밖으로 건조, 죽습니다. </li><li> 접시에 놓는 박테리아가 이미 15 사라졌으면 벌레가 더 오래 살고 있습니다. </li></ul> 2. 프로토콜 B : 알카라인 염소산 솔루션과 치료 ( &quot;표백&quot;) 11 표백 기술은 C를 동기화하는 데 사용됩니다 최초의 애벌레 단계에서 elegans 문화 (L1). 알 껍질은 전자를 보호하면서 방법의 원리는 벌레는 표백제에 민감있다는 사실에있다그것에서 mbryos. 알칼리 염소산 용액과 치료 후, 배아는 부화를 허용하지만, 앞으로의 개발을 방지 음식,하지 않고 액체 매체 incubated됩니다. <ol><li> 벌레가 성인 무대까지 성장하도록 허용합니다. </li><li> M9 버퍼로 접시를 씻는이 15 ML 튜브의 gravid 성인 복구할 수 있습니다. </li><li> 룸 온도 400xg (표준 테이블 원심 분리기에서 ~ 1,500 RPM)에서 2 분 동안 centrifuging와 뜨는 폐기하여 펠렛의 웜. </li><li> 버퍼가 박테리아의 맑은 나타날 때까지 1-3 세차장을 수행합니다. </li><li> 원하는 표백 솔루션 (표 I) 추가 (성인 조직의 파괴가 해부 현미경으로 모니터와 성인의 흔적이 아직도 볼 때 반응은 일반적으로 몇 가지에 따라 3시 사이에 9 분 정도 걸립있는 중단해야 몇 분 동안 선동 이러한 논의에 언급 웜 펠렛의 볼륨) (그림 3)과 같은 문제. </li><li> M9 buffe을 추가하여 반응을 정지R은 튜브를 기입합니다. </li><li> 신속하게 400 XG에서 1 분 (치료가 계속 활성화될 수 있기 때문에) 원심 분리기와 뜨는 버리고. </li><li> M9 버퍼와 함께 튜브를 작성하여 펠렛보다 세 번 씻는다. </li><li> 펠렛에 M9 버퍼 1 ML 추가하거나 unseeded NGM 접시에 계란을 배치하고, 부드러운 교반하여 원하는 온도에 부화. 적절한 폭기는 (그림 4)을 제공하여야한다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 다른 표백 해결책이 있습니다 (표 1, 그림. 1) 당신의 손에 더 잘 작동 하나를 선택합니다. </li><li> 이미 접시에 알을 낳았 같은 X 선 필름 조각 같은 부드러운 소재로 한천의 표면을 scrapping하여 복구할 수 있습니다. </li><li> 그들이 최근에 부화 유충에 대한 식량 공급을 구성으로 성인 동물의 너무 많은 유적들이 동기화를 손상 수 있습니다. </li><li> 높은 온도는 약간 불편 개발을 빠르게 전동기 및 비동기 웜 사이에 개발의 차이가 더 높은 온도에서 커야 때문에 F 어떠한 웜 생략 동기화. </li><li> 표백 용액은 그 사용 직전에 수행되어야합니다. 그것이 잠시 동안 오픈 이후 또한, 표백제는 photosensitivity로 인해 부분적으로 힘을 잃는. 우리는 이러한 손실을 방지하고 빛을에 대한 노출을 최소화하기 위해 작은 황색 병으로 나누어지는 각 새로운 병을 좋습니다. </li></ul> 3. 프로토콜 C : 웜 도금 <ol><li> 표백이 수행 후에 12 24 시간 (배아 개발을 완료하는 데 시간이 온도에 따라 다름) 사이에두고 원심 분리 (400 XG에서 2 분)에 의해 벌레를 복구합니다. </li><li> 필수 접시에 뜨는, 종자 웜을 무시하고 나머지 액체를 건조하게. </li><li> 필요한 온도에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> M9 버퍼에 L1의 애벌레는 ° C에서 1 주일 동안 적어도 출렁 WI 15 보관하실 수 있습니다명백한 변경을 thout. </li><li> 너무 많은 분들이 예상보다 빠르게 음식을 소진하고 실험을 망칠 수 있기 때문에 당신이 씨앗이됩니다 벌레를 계산할 때 조심하세요. 약 500 L1 음식이 다 실행하지 않고 55mm 판에서 성인기에 도달할 수 있습니다. </li></ul> 4. 프로토콜 D : C. elegans 관측 D.1 Nomarski 관찰 미분 간섭 대비 현미경은 흠없는 투명한 표본의 콘트라스트를 향상시키기 위해 사용되는 광학 현미경 조명 기술이다. 단어 Nomarski 그의 발명가의 이름을 따서 명명에 사용되는 프리즘,을 말합니다. 살아있는 동물을 관찰함으로써 우리는 고정에서 파생된 유일한 변경과 동물 생리학을 확인하실 수 있습니다. 더 정착액가 추가되지 않습니다로서뿐만 아니라, 형광 마커는 생체내에서 볼 수 있습니다. 이것은 사실과 흥미 유전자에 융합 형광 마커의 가능성은 가능 w에서 프로세스를 따르도록 할연구의 단백질이 관련되어있을 수도 hich. 이 프로토콜에 설명된 기술을 사용하여 라이브 벌레뿐만 아니라 관찰할 수 있지만 역시 다시 회수 및 도금 수 있습니다. 한천 패드 준비 (바로 사용 전) <ol><li> 물에 아가로 오스 2 % 준비하고 용융. 65 녹인 유지 ° C. </li><li> 셋째, 깨끗한 슬라이드의 양쪽에서 그들에 테이프 조각으로 두 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 파스퇴르 피펫 장소에게 깨끗한 표면 한천의 방울을 사용합니다. </li><li> 수직 세 슬라이드 위에 놓여 다른 깨끗한 슬라이드로 한천을 커버. </li><li> 그래서 한천 드롭이 테이프 스페이서의 두께로 평평하게되어 부드럽게 누르십시오. </li><li> 한천이 굳은 후 부드럽게 녹화 슬라이드를 당겨하고 다른 한 상대를 밀어서 남은 두 슬라이드를 구분합니다. </li></ol> 살아있는 동물 마운트 <ol start="7"><li> t쪽으로 놓으 levamisole 1mM의 방울 (10 μl) 또는 나트륨 azide 10-30 MM그는 패드의 중심지. </li><li> 웜 피크를 사용하여 드롭으로 동물을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 동물 위에 coverslip을 배치하고 일부 매니큐어이나 실리콘과 양쪽에서 해결. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 4 ° C.에 아가로 오스 2 % aliquots 유지 </li><li> 녹은 아가로 오스는 적어도 하루에 65 ° C에 보관하실 수 있습니다. </li><li> 참고 : Levamisole이 경직 근육 마비에게 16 elicits nicotinic 수용체 작용제이다. </li><li> 주의, 나트륨 Azide은 매우 독성이 있습니다! </li></ul> D.2 에탄올 고정 및 DAPI의 염색법 여기에서 설명한 프로토콜은 그러나 때문에 웜 dissecation의 일부 구조가 일부 변경을 제시 수, DAPI로 벌레를 염색의 빠른 방법을 나타냅니다. 이러한 나은 웜 17 무결성을 보존 Carnoy의 솔루션이나 포름 알데히드와 고정 등 DAPI 염색법의 이전에 벌레를 해결하기 위해 여러 가지 다른 방법이 있습니다. 에탄올 고정 (18에서 수정) <ol><li> 장소 ~ 현미경 슬라이드에 M9 버퍼의 10 μl (또는 물). </li><li> 벌레를 이용하는 것은 신중하게 드롭으로 10-25 웜을 전송 선택하십시오. </li><li> 벌레를 제거하거나 건조시키는없이 여과지 또는 가능한 마이크로 피펫 제거할만큼 M9 버퍼를 사용합니다. </li><li> 90 % 에탄올의 ~ 10 μl를 추가하고 말리면. </li><li> 한두 번 4 단계를 반복합니다. </li></ol> 4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색법 <ol start="6"><li> 이 NG / μl의 최종 농도로 원하는 설치 미디어와 DAPI를 섞습니다. </li><li> 장착 미디어 혼합물 : 에탄올이 완전히 증발되면, DAPI 7 μl를 추가합니다. </li><li> coverslip을 놓고 일부 매니큐어이나 실리콘과 양쪽에서 해결. 슬라이드는 DAPI의 추가 관찰 후에 약 5 분, 준비가 될 것입니다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 장착 의대IA는 글리세롤을 포함, 작은 금액은 전체 준비를 충당 충분하므로. </li><li> 상업 장착 미디어의 다양한 (Fluoromount 또는 연장, 예를 들어)이 존재의 품질 및 가격은 샘플을 저장할 얼마에 따라 달라집니다. </li><li> 조심해, DAPI DNA가 풍부한 지역 시에에 강력하게 바인딩 알려진 mutagen입니다. </li></ul> 조리법 선충류 성장 매체 (NGM) 1.7 % (W / V) 한천 50 MM NaCl 0.25 % (W / V) 펩톤 1 ㎜ CaCl 2 5 μg / ML 콜레스테롤 25 MM KPO 4 1 ㎜ MgSO 4 M9 버퍼 22mM KH 2 PO 4 42 MM 나 2 HPO 4 86 MM NaCl 1 ㎜ MgSO 4 표백 솔루션 테스트 <table border="1"><tbodY&gt; <tr><td></td><td> 제조법 # 1 </td><td> 제조법 # 2 </td><td> 제조법 # 3 </td><td> 제조법 # 4 </td><td> 제조법 # 5 </td></tr><tr><td> 물 (ML) </td><td> 2.75 </td><td> 3.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 (ML) </td><td> 1.25 (1M) </td><td> 0.5 (5M) </td><td> 2.5 (1M) </td><td> 2.5 (2M) </td><td> 2.5 (1M) </td></tr><tr><td> 나트륨 차아 염소 산염은 4 % (ML)를 낙제야 </td><td> 일 </td><td> 일 </td><td> 일 </td><td> 2 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 총 (ML) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> 표 I. 다른 표백 솔루션 요리법이 기사에 대한 테스트. 조리법 # 3와 # 4 배이며, M9 같은 볼륨에 추가되어 있어야합니다. # 1, # 2와 # 5에 대한 조리법는 이전에 2, 11, 19보고되었습니다. 최종 농도 : # 1 NaOH 0.25M, NaOCl은 0.8 % 였죠<html> , # 2 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0.8 %, # 3 0.625M NaOH, NaOCl ~ 1 %, # 4 1 M NaOH, NaOCl ~ 1.6 %, # 5 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0.8 %. 5. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 두 개의 서로 다른 배양 시간에 다섯 가지의 표백 솔루션의 비교. N2 벌레는 M9와 함께 두 번 쓸려는 각 표백 용액을 포함하는 다섯 15 ML 원뿔 튜브로 분할되었다. 튜브는 적극적으로 떨면서 1 ML은 지정된 시간 후에 반응을 막을 M9로 새 튜브로 전송되었습니다. 표백 후 절차 웜은 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 1 ML 함께 incubated되었다. 각각의 경우에 더 낮은 그림 단지, 24 시간 후에 상위 사진을 표백 후 찍은. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;고도 =&quot;그림 2 &quot;/&gt; 그림 2. 표백 용액의 온도는 치료의 효과에 영향을 미칩니다. N2 벌레의 평등 볼륨 중 이전에 20 분 동안 얼음으로 차게하거나 같은 시간 ° C ~ 25 살에 계속 같은 표백 솔루션을 표백했다. 단 표백 후 왼쪽 그림 표시에있는 두 개의 기둥. 치료 웜은 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 1 ML로 15 ML 원뿔 튜브에 incubated 있었다 후에. 24 시간 후에 바로 디스플레이 사진에 대한 열. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 비율 벌레 펠릿 : 알칼리성 염소산 보육 시간은 치료의 효과에 영향을 미치는 웜 펠렛의 50, 100, 250, 500 μl가 3, 6 및 9 분 동안 해결책 # 3을 표백 2 ML 함께 incubated되었다.. 부화 L1, 죽은 태아와 성인 파편의 유적은 2 20 ° C에서 배양 후 계량되었습니다<html> 4 M9 버퍼 1 ML과 15 ML 원뿔 튜브의 시간. 어른 벌레로 약 세 합류 55mm 판은 100 μl 벌레 펠렛을 얻을 필요합니다. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 적절한 폭기는 부화와 C의 생존을 위해 필요합니다 elegans의 배아. N2의 웜의 100 μl 펠릿는 6 분 동안 표백 및 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 중에 지정된, 1, 5 또는 10 ML로 15 ML 원뿔 튜브에 incubated했다. 화살표가 부화하지 않은 알을을 나타낼 위치를 그림의 상단 부분은 24 시간 후에 문화 사진을 표시합니다. 맨 아래에 명시된 조건에 표백 후 유충 (밝은 회색)과 죽은 태아 (어두운 회색) 48 시간의 금액을 묘사한 그래프가있다. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;고도 =&quot;그림 5 &quot;/&gt; 그림 5. C의 라이프 사이클 elegans. . 다른 단계에서 웜의 대략 길이. 시간 온도 (20에서 수정) 지정된 발달 단계에서의 서로 다른 웜니다. 나. Nomarski (최대) 및 DAPI (아래) 사진에 따라 각 단계에 도달하는 데 필요합니다. 각 단계에서 가장 중요한 기능은 확대되고 L1 : 화살표는 체세포의 생식선과 배아 라인의 엽 성의 전구 물질을 나타냅니다 L4 상순 : 검은 화살표 (Nomarski)은 개발 소문을 나타냅니다; 흰색 화살표 (DAPI)는 두 gonadal 무기를 나타냅니다 중순... L4 후반 : 화살표가 소위 크리스마스 트리 단계에서 개발 외음부를 나타냅니다 젊은 성인 :. 검은색 화살표가 자궁 안에 배아를 나타냅니다, 화살촉은 포인트가 spermatheca에, 흰 화살표 oocyte를 나타냅니다 Gravid 성인 :. 화살촉 (DAPI) 포인트 아웃은 수정된 배아. DAPI 이미지의 화살표가 spermatheca을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="그림 6" /> 6 그림. L3, L4와 성인 단계에 벌버의 형태학. L3 단계에서는 외음부가 형성되는 경우에만 작은 루멘을 볼 수 있습니다. L4에서는이 루멘은 소위 &quot;크리스마스 트리&quot;를 형성 확장합니다. 성인에서는 외음부가 이미 닫힙니다. 옐로우 라인이 세 단계에 산문의 위치를​​ 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. L3에서 DAPI의 염색법, 초기 L4, L4 지각하고 성인 단계. L3에서는 배아 라인은 늘어나지 않습니다. L4에, 생식선은 팔 현재 U-모양의 형태를. 늦은 L4 단계 정자에서 생식선의 말초 부분에서 볼 수 있습니다. 젊은 성인 oocytes을 제시. 성인 배아 라인 oocytes과 배아를 제공합니다. 옐로우 라인 회에서 배아 라인 경계를 정하다전자 다르게 명시된 단계. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="그림 8" /> 그림 8. C. 15 25 ° C. N2의 웜에서 elegans 개발 15시 M9와 교반 ° C, 접시에 양도하고 명시된 온도에서 지정된 시간을 성장에서 하룻밤 incubated, 표백되었다.

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<li>Protocols [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://protocols.mmml.nl">http://protocols.mmml.nl</a> (2012).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

선충류 동기화 여러 표백 솔루션은 설명했습니다. 우리는 다섯 가지 요리법 (표 I)하려하고, 우리의 손에, 그들은 웜 인구의 동기화에 큰 차이 (그림 1)을 표시하지 않았다. 벌레의 부피 (그림 3)과 배아는 (그림 4) 부화를 위해 incubated하고있는 M9의 볼륨에 영향을 수행하지만, 우리의 실험은 온도 (그림 2)의 비율 표백 용액과 같은 매개 변수가있는 공연을 한 벌레의 생존은 문화의 적절한 폭기에 관한되고있다. 15 ML의 튜브에 1 ML의 볼륨은 모든 벌레의 생존을 허용하면서 우리 떨고있는 상황에서, 5 ML의 볼륨 (표시되지 않음) 적절한 계란을 부화 15 ML의 최대 볼륨과 비교를 허용하도록 이미 너무 많이이다 . C. elegans 개발 <p ...

기본<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

선충류의 Caenorhabditis elegans의의 분자 및 발달 생물학에 대한 연구는 시드니 브레너에 의해 초기 70 년대 시작되었고 이것은 이후 모델 생물 1로 광범위하게 사용되었습니다. C.는 elegans은 그것 수년 2에 대한 기초 생물 학적 연구에 적합한 실험적인 시스템을 만들어 단순, 투명성과 짧은 수명주기와 같은 주요 특성을 가지고 있습니다. 많은 세포와 분자 프로세스 제어 동물 개발 진화 보존되어 세는 것을 때문에이 선충류에서 발견 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다. 동물들이 성인기에 도달하기 전에 C. elegans 수명주기는 배아 단계 넷 애벌레 단계를 진행합니다. 개발은 온도에 따라 2-4일 소요될 수 있습니다. 단계의 각에는 몇 가지 특징적인 특성을 볼 수 있습니다. 깊은 annotat과 함께 4,5의 완전한 세포 혈통의 지식그 게놈의 이온 7,8를 노화 신경 생물학 6,, 줄기 세포 생물학 9, 배아 라인 생물학 10 다양한으로 분야에서 훌륭한 모델에이 선충류를 켜십시오. C를 만들어 부가 기능 와 일할 수있는 매력적인 모델을 elegans 것은 비교적 쉬운 프로토콜을 통해 특정 단계에서 동기화된 웜의 인구를 얻기의 가능성이다. 이 선충류을 유지하고 전파의 용이성은 이러한 RNAi 스크린, microarrays, 대규모 시퀀싱 작게하거나 높은 처리량 실험의 다양한 사용될 수 웜은 대량의를 얻기 위해 강력한 도구를 제공 동기화의 가능성에 추가 타인 간의 immunoblot 또는 원위치 하이브리드화에서. 의 투명성, C. 때문에 elegans 구조도 Nomarski 마이크로로 알려진, 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 현미경으로 구분할 수복사합니다. 형광 유전자 바인더, DAPI (4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole)의 사용은 예를 들어, 특정 식별 및 현지화 개별 세포뿐만 아니라, subcellular 구조 / 그들에게 관련된 결함을 초래할 수 있습니다.

선충류을 유지하고 증식의 아마<em&gt; C. elegans</em&gt; 그것으로 일하기 좋은 모델 생물하십시오. 동기화 웜의 가능성이 많은 동물에서 하나의 특정 프로세스의 연구를 용이하게 무엇 동일한 발달 단계에서 주제들을 상당히로 작업이 가능합니다.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

선충인 *Caenorhabditis elegans*의 분자 및 발생 생물학에 대한 연구는 70년대 초 Sydney Brenner에 의해 시작되었으며, 이는 ...

이 영상에서는 *C. elegans*를 L1 단계에서 동기화하는 방법을 보여드리겠습니다. 이는 간단한 방법이지만 매우 흔히 사용되므로, 입문자분들에게 상당히 유용할 것입니다.C 언어 전문가라면 본 프로토콜을 최적화하기 위한 몇 가지 팁을 여기서 찾으실 수 있을 것입니다. 웜의 동기화 원리는 성체 웜과 배아가 알칼리성 차아염소산염 용액에 대해 가지는 상대적인 저항성 차이에 기반합니다. 많은 배아를 품고 있는 성체 웜을 차아염소산염 용액과 함께 배양하여 성체는 사멸시키고 배아만 남게 하는 방식입니다.동기화의 두 번째 단계는 먹이의 부족을 통해 이루어지며, 이를 통해 배아가 서로 다른 시간에 부화하더라도 L1 단계 이상으로 발달하지 않게 합니다. 블리칭 프로토콜을 시작하기 위한 첫 번째 단계는 벌레가 산란 단계에 있고 플레이트에 여러 개의 알이 흩어져 있도록 하는 것입니다. 성체들을 회수하여 수확하기 위해 M9을 사용하십시오.또한, 플레이트 표면에 이미 도달한 배아들은 엑스레이 필름 조각과 같은 부드러운 재료로 긁어낸 후, 여러 번의 M9 세척을 통해 회수된 박테리아를 씻어낼 수 있습니다. 보통 두 번 정도면 충분합니다. 벌레들을 세척하고 나면, 선호도에 따라 갓 조제한 표백 용액을 첨가할 차례입니다.튜브를 흔들면서 배양 시간을 조절하십시오. 실체 현미경을 통해 성체의 생성을 관찰할 수 있습니다. 사체가 거의 남지 않았다고 판단되면, 튜브가 완전히 찰 때까지 M nine을 첨가하여 반응을 중단시키십시오.프로토콜을 마무리하려면 최소 3회 세척을 수행하십시오. M9 버퍼에서 밤새도록 지속적으로 흔들어주며 알을 배양하면, 부화는 가능하지만 선충의 추가적인 발달은 억제됩니다. 동기화는 15°C에서 25°C 사이의 어떤 온도에서도 수행할 수 있지만, 15°C를 권장합니다.발달 속도가 더 느리기 때문에, 앞서 언급한 바와 같이 C. elegans는 성체가 되기 전 4단계의 유충 단계를 거치며, 그 소요 시간은 사육 온도에 따라 달라집니다. C형 C. elegans는 15에서 25도 사이의 성장 온도에서도 생존할 수 있지만, 온도가 높을수록 성장 속도가 더 빠릅니다.높은 온도에서의 결과를 보면, 24시간 후에 벌레들의 발달 단계가 서로 다르다는 것을 알 수 있습니다. 15°C와 25°C에서 비교했을 때, 25°C에서는 48시간 후에 이미 배아가 관찰됩니다. 반면, 플레이트 표면에서 배아를 확인하려면 80시간 이상 기다려야 합니다

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 불임 성인 예쁜꼬마선충의 발달 동기화된 개체군을 생산하는 방법을 보여줍니다. 예제 프로토콜은 살아있는 동물의 산소 소비율을 연구하기 위해 벌레를 동기화합니다.

선충 동기화(Nematode Synchronization): 동일한 발달 단계에 있는 벌레 개체군을 얻는 방법

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

여기서, 표준화된 프로토콜은 분자 수준에서 RT-qPCR을 이용하여, 세포 수준에서 형광 기자, 유기체 수준에서의 열회수를 사용하여 Caenorhabditis elegans에서 열 충격 반응(HSR)의 유도를 평가하기 위해 제시된다.

Caenorhabditis elegans의 열 충격 반응 유도를 측정하는 표준화된 방법

여기에서, 우리는 Caenorhabditis elegans embryos 를 준비하고 장착하고, 4D 현미경으로 개발을 기록하고 세포 계보를 추적하기위한 프로토콜을 제시합니다.

4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

이 연구는 C. elegans 복합 I 질병 가스-1(fc21)웜, 즉 ZebraLab (중간 처리량 분석) 및 WormScan (고처리량 분석)에서 두 개의 반 자동 운동 활동 분석 접근 에 대한 프로토콜을 제시하고 nematode 행동과 통합 신경 근육 기능을 정량화하는 광범위한 연구 방법 중 비교 분석을 제공합니다.

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

이것은 항체 염색을 통해 면역형광을 위한 생식계열 샘플을 생성하거나 DNA를 시각화하기 위한 간단한 DAPI 염색을 위해 C. elegans 생식선 해부 후 동결 균열에 일반적으로 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜은 연구실과 과정 기반 학부 연구 경험의 학부생에게 성공적이었습니다.

C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

이 프로토콜은 노화 중 예쁜꼬마선충 의 여러 조직에서 미토콘드리아 형태를 이미징하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공합니다.

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

이 연구는 가장 큰 Lyapunov 지수(LLE)를 측정하여 C. elegans 의 운동에 대한 연령의 영향을 조사합니다. 나이가 들수록 C. elegans 는 운동 조절이 증가하고 그에 따른 감소를 보입니다. 결과는 5일 후에 LLE가 최고조에 달하고 벌레가 나이가 들면서 감소하는 것으로 나타났습니다.

Caenorhabditis elegans의 운동의 연령 의존적 역학: Lyapunov 지수 분석

학습하세요 C. elegans 동기화 방법을 알칼리성 하이포클로라이트 용액을 이용한 1령 유충 단계 동기화 기술입니다. 이 프로토콜은 발달생물학 연구에서 균일한 실험군을 확보하여 유전자 기능 분석에 필수적인 기초 기술을 제공합니다.

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