에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정 토토에서 이미징 C. 엘레 개발

이 절차의 전반적인 목표는 형광 광시트 현미경을 사용하여 C Allergan의 개발 과정을 이미지화하는 것입니다. 이는 먼저 정립 현미경과 작은 광기계 요소 세트로 구성된 광시트 기반 현미경을 설정하여 광시트를 생성함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 배아를 장착하는 것입니다.

마지막 단계는 배아에 광시트를 조정하고 배아의 발달을 기록하는 것입니다. 그 결과 3D 및 타임랩스 비디오 분석을 통해 CL egan의 개발 과정에서 형광 표지된 단백질의 역학을 보여줄 수 있습니다. 컨포칼 현미경 검사와 같은 다른 기존 방법에 비해 Lightship 현미경 검사의 주요 장점은 더 낮은 광독성으로 더 빠른 이미징이 가능하다는 것입니다.

셋째, 이 방법은 개발에 대한 밀봉에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 roil 또는 zebrafish와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 명확할 것입니다.

셰일즈는 내 연구실의 엔지니어였고, 폴린 리낙은 밴 연구실의 엔지니어였다. 이 섹션에서는 설정 어셈블리에 대해 설명하며 모든 실험을 위해 조립된 상태로 둘 수 있습니다. 레이저, 필터, 망원경 및 잠망경이 모두 광학 테이블에 배치되면 원통형 렌즈를 고정하여 광 시트를 생성합니다.

초점을 맞추기 위해 다른 렌즈가 조정됩니다. 조명 대물렌즈의 초점은 감지 대물렌즈의 물체 초점과 일치해야 합니다. 이제 빔을 벽이나 스크린에 투사하고 프로젝션의 윤곽이 날카로워질 때까지 빔 축을 따라 조명 대물렌즈를 이동합니다.

현미경 설정에 쿼드 라인 방출 필터와 E-M-C-C-D 카메라를 포함합니다. 두 번째 수동 변환 단계를 첫 번째 단계에 수직으로 고정합니다. 어셈블리를 기존 현미경 스테이지에 나사로 고정합니다.

설정된 원통형 렌즈 조명 대물렌즈를 제거한 후 어셈블리를 현미경에 배치하고 조명 세트를 스테이지에 다시 놓습니다. 조명 경로와 감지 경로의 수직 교차점에 qve 홀더를 부착합니다. 이제 라이트 시트를 확인하십시오.

유리 베트에 플루오레세인 용액을 채우고 스테이지의 홀더에 놓습니다. 라이트 시트가 보여야 합니다. 그것은 수평이어야 하며 감지 대물 렌즈에 대해 중앙에 있어야 합니다.

다음으로 원통형 렌즈를 제거합니다. 조명 대물렌즈의 3D 변환으로 광시트를 최적화하고 광시트의 두께를 측정하기 위한 이미지를 획득합니다. 이것은 대물 렌즈의 조리개에 따라 다릅니다.

그런 다음 원통형 렌즈를 교체하십시오. 먼저 1mm 두께의 유리 조각을 10mm x 20mm로 자릅니다. 다이아몬드 마킹 펜을 사용하십시오.

다음으로, 한쪽에 20마이크로리터의 폴리 L 라이신을 추가하고 건조되면 두 번째 슬라이드에 병치합니다. 고정 된 위치에서 5 % 한천 한 방울을 추가하고 맨 위에 설정된 세 번째 슬라이드의 무게로 부드럽게합니다. 한천이 건조된 후 세 번째 슬라이드를 제거하고 폴리 L 라이신이 없는 슬라이드 위의 나머지 두 슬라이드의 가장자리에서 한천 패드를 3mm 자릅니다.

그런 다음 고정 슬라이드를 제거하여 한천의 돌출부를 남겨 둡니다. 한천에 20마이크로리터의 폴리 L 라이신을 코팅하고 건조시킵니다. 이제 해부 현미경으로 M nine medium으로 채워진 시계 유리에 GR 웜을 넣습니다.

메스 수준으로 벌레를 외음부까지 잘라 알을 풀어줍니다. 그런 다음 관심 단계에 있는 배아를 식별하고 마이크로 모세관 피펫으로 수집합니다. 배아를 한천의 경계가 아니라 슬라이드의 가장자리 바로 옆에 있는 준비된 슬라이드에서 돌출부로 옮깁니다.

그런 다음 액체를 제거하는 동안 배아를 마이크로 모세관 피펫으로 정렬합니다. 흡인에 의해, 배아는 폴리올 라이신에 달라붙을 것입니다. 좋은 기록을 얻기 위해서는 배아를 잘 배치하는 것이 매우 중요하며, 이를 위해서는 올바른 접합부를 가진 모세혈관이 필요합니다.

너무 작으면 배아를 방출하기 어려울 것입니다. 너무 크면 누출된 흐름을 엄격하게 제어하고 배아를 정렬하기 어렵고, 페트리 접시에 M nine medium으로 슬라이드를 덮고 배율을 사용하여 배아가 여전히 한천에 부착되어 있는지 확인합니다. 이제 배아가 있는 준비된 슬라이드를 vete에 맞는 샘플 홀더에 고정합니다.

홀더는 수의사에게 맞도록 설계된 사내에서 만든 장치입니다. 다음으로, 수맥을 Pizo 전기 스테이지에 고정하고 명시야 조명 아래에서 배아를 찾습니다. 이제 조정 가능한 acoustic optic 를 제어하는 소프트웨어 패키지를 시작하십시오.

카메라와 스테이지를 필터링합니다. 여기에있는 이 소프트웨어는 사내에서 작성되었지만 마이크로 관리자 프리웨어도 사용할 수 있습니다. 먼저 레이저 라인을 선택합니다.

다음으로, 라이트 시트가 가장 밝아질 때까지 x축을 따라 스테이지를 조정합니다. 그런 다음 신호 대 잡음이 최상의 상태가 될 때까지 다른 두 차원 Y와 Z를 조정합니다. 각 배아에 대해 이 작업을 반복해야 할 수도 있습니다.

이 열쇠는 신호 대 비율을 최적화하여 양호한 기록을 얻기 위해 자유 스테이지를 번역하고, 배아와 최상의 대비를 얻기 위해 관계를 맺을 때 제거 목표를 지원합니다. 이제 타임랩스 이미지를 획득하고 배아의 형광 수준과 분석된 생물학적 과정의 속도에 따라 레이저 출력 노출, 시간 이득 및 이미징 간격을 설정합니다. 잭을 위해.

이미징은 히스톤 GFP 구조를 표현하는 c elgan에서 슬라이스와 시작 및 끝 위치 사이의 거리를 설정합니다. 2시간 타임랩스 이미징은 37초마다 20개의 슬라이스 스택을 촬영하여 이루어졌습니다. 세포 분열은 GFP에 융합된 튜불린과 m 체리에 융합된 그의 돌을 발현하는 균주에서 명확하게 볼 수 있었습니다. 105초마다 16분 동안 녹음을 수행했습니다.

3D 렌더링은 세 가지 시점에서 표시됩니다. 유사분열 방추체(mitotic spindles)와 응축된 염색체(condensed chromosome)는 명확하게 볼 수 있으며 세포 분열을 통해 쉽게 추적할 수 있습니다. 세 번째 균주에서 GFP에 융합된 2개의 APO 지단백질 vit는 세포막의 mCherry 라벨링으로 이미지화되었습니다.

13분 동안 27초마다 10개의 슬라이스 스택을 촬영했습니다. 빠르게 움직이는 지단백질 입자는 쉽게 따라갈 수 있었습니다. 여기서 우리는 더 복잡한 방법으로 형성된 라이트 시트를 사용하여 생산합니다.

공간 해상도를 더욱 향상시키기 위해 광 시트를 구현할 수 있습니다.