Name: 에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정 토토에서 이미징 C. 엘레 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 C. elegans 배아 발달을 위한 라이트 시트 현미경 설정 방법을. 형광 단백질 역학을 3D 및 타임랩스 영상으로 관찰하고 저광독성으로 빠른 이미징이 가능한 이 기법은 신경과학 및 생물물리학 연구에 활용됩니다.

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우리는 토론을위한 소프트웨어 개발 및 제레미 Capoulade 특히 올리비에 블랑, 모든 Lenne의 회원들과 버트 랜드 연구소 감사합니다. 우리는 또한 기술 지원 PICsL-IBDM 영상 시설, 특히 클로드 모레티와 브라이스 Detailleur 감사합니다. 이 작품은 (P.-FL 및 VB에) CNRS에서 ATIP의 교부금에 의해 지원되었다, Labex은 (VB에) 사노피 - 아벤티스에서와 부여 (P.-FL 및 VB에) 부여를 알려 드리겠습니다. 우리는 (ANR-10-된 InSb-04-01 &quot;INVESTISSEMENTS D&#39; Avenir에서&quot;를 호출) 직원은 국립 드 라 공들인에서 지원하는 프랑스 바이오 이미징 인프라를 인정합니다.

1. 빛 시트 및 검색 경로 설정 그림 1은 광 설치의 일반적인 방식을 제공합니다. <ol><li> 광학 테이블에 현미경과 레이저를 삽입하고 고정합니다. </li><li> 레이저에게 488 nm의, 561 nm의 해당 이색 거울이 405 nm의 결합. 다이크로 익 미러 후, 레이저 공동 정확하게 정렬되어야한다. 레이저 파장, 다이크로 익 미러, 광학 필터의 선택은 실험에 사용 된 특정 형광 라벨의 흡수 스펙트럼으로부터 결정되는 것에주의. </li><li> 음향 광학 파장 가변 필터 (AOTF)를 놓습니다. AOTF의 주파수 및 전력을 조정하는 공급자 테스트 용지를 사용한다. 잘 맞춰지면 내 PowerMeter 의해 측정, 레이저 파워의 약 90 %의 최대 조정에 전송된다. AOTF 불필요한 만들 수있는 몇 가지 레이저가 완전히 소프트웨어에 의해 제어 할 수 있습니다. </li><li> 배치 및 수정망원경. 망원경은 같거나 조명 대물 렌즈의 배면 개구의 직경보다 큰 폭으로 확장 된 빔을 2 개의 렌즈로 구성되어 있습니다. 최소 초점 거리를 가진 렌즈가 먼저 와야한다. </li><li> 장소, 정렬하고 가까운 원통형 렌즈의 뒷면 구멍에 위쪽으로 광학 경로를 데리고 잠망경을 고정합니다. 잠망경의 두 개의 거울은 장축이 완전히 확장 된 빔을 반영하기 위해 미러의 경사에 누워있다 방식으로 장착되어 있습니다. </li><li> 다음 잠망경 출구 원통형 렌즈를 놓습니다. 원통형 렌즈가 한 방향으로 상기 빔을 포커스하고 그에 광 시트를 형성하는 다른 방향으로 평행 나뭇잎 유의. </li><li> 조명 대물 렌즈를 사용하여 얻어진 광 시트를 집중할. 조명 대물의 이미지 초점이 검출 목적의 물체 초점 포인트와 일치한다는 것을주의한다. 빔 프로젝트긴 거리에서 화면 (예 : 벽)에 대한 것입니다. 빛 시트의 화면 날카로운 윤곽을 얻기 위해 조명 빔의 축을 따라 조명의 목적을 이동합니다. </li><li> 현미경 (큐브)에서 예약 된 장소에서 쿼드 라인 (405/488/561/638) 방출 필터를 놓습니다. </li><li> 현미경 출력 포트에 EMCCD 카메라를 놓습니다. </li><li> 현미경 단계에 드릴 구멍에 나사에 의해 현미경 무대에서 첫 번째 매뉴얼 번역의 단계를 수정. 이동 스테이지의 에지가 큐벳이 검출 대물 렌즈 아래를 중심으로되도록 멀리 현미경 스테이지의 중심으로부터 약 2 ㎝에 배치되어야합니다. </li><li> 첫 번째 두 번째 매뉴얼 번역 단계를 수정. 두 단계의 방향 (X 및 Y 번역) 수직해야합니다. </li><li> 앞의 두 단계의 상단에있는 Z 압전 단계를 수정. 동력 스테이지 대신 압전 스테이지 사용될 수 있음을주의한다. </li><li> 큐벳 holde 수정R 스테이지의 상부에 (도 2 참조). 큐벳 따라서 조명 경로의 교차점과 서로 직각이 검출 경로에 배치 될 것이다. </li></ol> 2. 라이트 시트 확인 <ol><li> 형광 용액을 유리 큐벳을 가득 채운 두 개의 광 경로의 교차점에 샘플 홀더에 놓습니다. 빛 시트는 이렇게 볼 수 있습니다. 이는 수평이어야하고, 대칭 / 검출 대물 렌즈 중심에 대하여. </li><li> 원통형 렌즈를 제거하고 광 시트의 두께를 측정하기 위해 화상을 취득. 광 시트의 두께는 조명 대물 렌즈 (NA에 대해 3-4 = 0.3 μM)의 개구 수 (NA)에 의존한다는 것을주의한다. 관련 렌즈 것을 유의 광 시트의 두께는, 슬릿 배면 개구들이 빔의 크기를 감소시킴으로써 증가 될 수있다. 형광 마이크로 스피어는 AX를 측정하는데 사용될 수 있음을 유의현미경의 원점이라 횡 해상도. </li><li> 실험을 시작하기 전에 원통형 렌즈를 다시 넣습니다. </li></ol> 3. C.의 실장 엘레 태아 다음 단계는 (그림 3)됩니다. <ol><li> 10 × 20 ​​× 1 ㎜의 유리 슬라이드의 조각을 잘라 다이아몬드 마킹 펜을 사용합니다. </li><li> 5 % 박토 - 한천을 준비 60 ℃에서 물에 데쳐 및 히터 블록에서 그것을 유지 </li><li> 슬라이드의 절단 된 부분의 한면에 폴리-L-라이신의 50 μl를 추가, 건조시켜야합니다. </li><li> 벤치에 현미경 슬라이드를 삽입하고 고정합니다. </li><li> 고정 슬라이드와 슬라이드의 절단 된 부분을 나란히하고 상단에 녹은 한천의 드롭을 추가합니다. 얇은 한천 패드를 얻기 위해 다른 깨끗한 현미경 슬라이드를 사용하여 한천을 꽉. </li><li> 한천 패드 상단 슬라이드를 제거하기 전에 건조하도록 허용합니다. </li><li> 약 3mm 오의 과잉을 남겨하기 위해 고정 된 슬라이드의 측면에있는 한천 패드를 잘라F 한천 부드럽게 고정 슬라이드를 제거합니다. </li><li> 한천에 폴리-L-라이신의 50 μL를 추가하고 완전히 건조 보자. </li><li> 시계 유리에 M9 매체에 임신하는 벌레를 넣습니다. </li><li> 배아를 해제하는 메스와 외음부의 수준에서 벌레를 잘라. </li><li> 양안에서 관심 단계에서 배아를 식별하고 미세 모세관 피펫을 사용하여 그들을 수집. </li><li> 슬라이드의 절단 된 부분에서 돌출 폴리-L-라이신 코팅 한천의 부분에 배아를 놓습니다. 바로 옆에 슬라이드의 경계에 배아를 놓습니다. 그들은 충분히 안정하지 않기 때문에 한천의 국경에서 배아를 배치하지 마십시오. 배아는 폴리-L-라이신 층에 붙어 있도록 조심스럽게 액체를 제거합니다. </li><li> 빠르게 건조를 방지하기 위해 배아를 맞 춥니 다. </li><li> 플라스틱 페트리 접시에 잘라 슬라이드를 삽입하고 부드럽게 슬라이드를 커버하는 M9 배지를 추가합니다. </li><li> 계란이 여전히 한천에 붙어있는 양안에서 확인하십시오. </리&gt; </ol> C. 4. 기록 엘레 개발 <ol><li> 샘플 홀더의 이전 준비 (컷 슬라이드, 한천 플러스 배아를) 수정하고 큐벳에 배치합니다. 그림 4는 수제 홀더를 설명하고 그림 5는 관측 맥락에서 큐벳의보기를 보여줍니다. </li><li> 압전 무대에 큐벳을 수정. </li><li> 시야 조명 태아의 위치를​​ 확인합니다. </li><li> AOTF, 카메라와 압전 단계를 제어하는​​ 집에서 만든 소프트웨어를 시작합니다. 이러한 마이크로 매니저와 같은 무료 소프트웨어는, 또한 사용할 수 있습니다. </li><li> 레이저 라인 및 전력 (AOTF)를 선택합니다. </li><li> 원통형 렌즈 및 조명용 렌즈를지지하는 세 방향으로 스테이지를 사용하여 광 시트의 위치를​​ 조정한다. 밝은 신호를 얻기 위해 가로 방향 (X)에 따라 단계를 이동합니다. 일을 구하는 다음 광 시트의 Z 위치 및 길이 방향의 위치 (Y)를 조정노이즈 비율 전자 최상의 신호. 빛 시트 초점의 위치가 빛의 경로 길이의 차이를 해결하기 위해 하나의 배아에서 다른 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 타임 랩스 영상을 획득하기 위해, 두 이미지뿐만 아니라, 취득되는 화상의 수와 레이저 파워 사이의 시간을 얻는, 노출 시간을 선택한다. 2 컬러 수집을 위해, 두 번째 레이저 라인을 선택합니다. 두 가지 색상 이​​미지를 연속적으로 획득된다. </li><li> AZ 스택을 획득하려면, 또한 두 조각 사이의 거리, 및 시작과 압전체의 위치를​​ 종료를 선택한다. </li></ol>

<ol><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li>
<li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet-based+fluorescence+microscopy%3A+more+dimensions%2C+more+photons%2C+and+less+photodamage%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li>
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<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+%28mSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 C의 생체 내 이미징을위한 빛 시트 현미경의 쉬운 설치를 설명 엘레 배아. 레이저, 빔 익스팬더, 시준 및 초점 렌즈를 포함한 광 시트를 생성하고 정렬하기 위해 필요한 광학 소자는 용이하게 광학 벤치에 장착 될 수있다. 검출 경로와 카메라의 직립 현미경과 조합하여,이 설정에 대한 간단한 솔루션 가벼운 시트 현미경을 제공합니다. 이 형상은 샘플 환경이 간단하게. 살아있는 표본이 개최 위치 및 기계 조각의 작은 집합으로 이동 유리 큐벳에 배치됩니다. 시트 조명 현미경 능력을 가진 절편 넓은 분야의 기술이기 때문에, 단지 하나의 축 동력 이동은 3D 이미징을 위해 요구된다. 이것은 단일 스캔 소자에 동기화 요건을 제한하고, 소프트웨어 개발을 용이하게한다. iSPIM 6 우리의 수직 지오에 비해RY는 검출 용 고 NA 대물 렌즈의 사용을 허용한다. 수평면에서 대물 렌즈와 SPIM 셋업에 비해 샘플의 장착 및 배아의 일련의 이미징은 쉽다. 전부,이 기술의 구현은 간단하고 광학에 약간의 전문 지식을 얻을 수 있습니다. 이것은 더 빠른 속도와 더 감소 광독성하지만 낮은 축 해상도의 단점의 장점과 공 초점 현미경에 싼 대안이다. 우리는 또한 C.를 탑재 할 수있는 쉽고 재현성있는 방법을 개발 이 시스템을 사용하여 생체 내 이미징을위한 엘레 간스의 배아. 설치 절차는 빠르게 (15 분) 일상 실험에 적합합니다. C.에 대한 엘레 영상, 간단한 설치의 장점은 적어도 두 겹이다 : 토토 이미징 (i)는 회전하지 않고 가능하기 때문에 3D 재건은 간단합니다; (II) 샘플 설치가 용이하고 여러 개의 배아는 순차적으로 이미지화 할 수있다같은 슬라이드에. 우리는 세포 분열과 세포 모양의 변화를 관찰 할 수있는 충분한 시간 분해능과 시간 경과 영화의 예를 보여 주었다. C.을 연구하는 빛 시트 현미경의 힘 elegans의 개발도 최근 다른 6, 7, 8에 의해 설명되었다. 따라서,이 기술은 C.의 형태 형성 및 패터닝을 연구하는 것은 매우 유용 할 것이다 elegans의 배아. 이 시스템은 또한 다른 모델 생물의 발달을 분석하는 데 사용할 수 있습니까? 그것은 인식하는 것이 중요하다되도록 C. 작은 투명 유기체 시트 조명 현미경의 구현 엘레은 Drosophila의 배아와 같은 큰 생물보다 덜 엄격하다. 초파리의 토토 영상에서 일반적으로 회전 및 멀티 뷰 복원 9, 10. 선상 여기 대물 렌즈와 두 가지 측면에서 흥분도 attenuat에 의한 그림자 효과를 감소 할 수 있습니다 필요합니다빛 (11)의 이온. 그러나, 여기에 제시된 설정은 여전히 낮은 표백과 낮은 photoxicity으로, 초파리 배아의 이미지를 한쪽으로 구성된다. 이 설정은 또한 멍게 또는 제브라 피쉬와 같은 이미지를 작은 투명 배아에 도움이 될 수 있습니다.

유기체의 형성과 형성 세포의 움직임, 세포 모양의 변화, 세포 분열과 세포 분화를 포함한다. 이러한 프로세스의 진행과 조정을 이해하는 세 가지 차원으로 기능과 세포 내 해상도와 빠른 이미징 도구가 필요합니다. 이러한 생체 내 이미징 기능과 기술 사이, 빛 시트 조명 현미경은 단일 / 선택적 비행기 조명 현미경이라고 저 광독성 효과 및 1,2 낮은 photobleaching에 생산의 고유 한 장점이있다. 시트 조명 현미경에서 시료를 광학 단면 처리를 행하는 광 시트에 의해 측으로부터 조명된다. 조명 경로와 검출 경로는 서로 수직 및 광 시트는 검출 대물 렌즈의 물체 초점면과 일치하도록 정렬된다. 샘플은 두 경로의 교차점에 배치된다ND 3D 이미징을 허용하도록 검출 축을 따라 이동 될 수있다. 또한 남은 평면은 조명되고,이 평면의 모든 포인트가 동시에 검출된다. 이것은 상당히 수집 속도를 증가시키고 공 초점 현미경 (3)에 비해 광표백뿐만 아니라 광독성을 감소시킨다. 이 차원 화상에 대해, 제공된 스캔 탐지 부분은 없으며, 조명 부분은 어느 것도 필요하지 않다; : 실용 시트 조명 현미경 설정 및 정렬하기 쉬운 기능 구획으로 광 시야 기술로서, 3 차원 화상은 샘플을 잡고 스테이지의 하나의 축 이동에 의해 얻어 질 수있다. 여기에서 우리는 C의 토토 영상에 대한 간단한 빛 시트 현미경과 그 구현의 설정까지 제시 elegans의 배아. C. 엘레 배아 잘 생체 IMA 살고 적합투명도로 인해 ging를, 불변의 혈통과 셀에 박힌 4,5를 배치합니다. 개발 된 광 시트 설치가 검출을위한 표준 직립 현미경을 기반으로합니다. 아래에 제시 프로토콜을 구축하고 정렬 여기 모듈 / 경로, 테스트 및 빛 시트의 특성과 3D 영상의 샘플을 장착하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 또한 형광 마커를 표현하는 다양한 균주의 설정과 획득 시간 경과 영화의 예를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>SPIM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">감지</td></tr><tr><td>직립 현미경</td><td>ZEISS</td><td>Axiophot 1</td><td></td></tr><tr><td>100x W 대물렌즈 (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&nbsp;</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 뒷면 조명</td><td>ANDOR</td><td>DU-885K-CS0-#VP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">조명</td></tr><tr><td>LASER 488 nm / 60 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam 스마트</td><td></td></tr><tr><td>레이저 405 nm / 120 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam 스마트</td><td></td></tr><tr><td>레이저 561 nm / 500 mW</td><td>COBOLT</td><td>JIVE 500</td><td>&nbsp; 타임 랩스 이미징의 경우 50 또는 100mW로 충분합니다</td></tr>. <tr><td>쿼드 라인 레이저 거부 밴드 ZET 405/488/561/638</td><td>AHF</td><td>F57-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 405</td><td>AHF</td><td>F38-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 488</td><td>SEMROCK</td><td>Di01-R488</td><td></td></tr><tr><td>AOTF</td><td>AA</td><td>AOTFnC-400.650-TN</td><td></td></tr><tr><td>미러</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>렌즈 50mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>망원경 5X</td></tr><tr><td>렌즈 200mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>망원경 5X</td></tr><tr><td>잠망경</td><td>THORLABS</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>원통형 렌즈 f=100mm</td><td>THORLABS</td><td>ACY254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xyz 스테이지</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sample</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Bectkton Dickinson</td><td>214010</td><td>5% 물</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine 용액&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>모세관 GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td><td>Havard Appartus</td><td>30-0019</td><td></td></tr><tr><td>흡인 튜브(구강 피펫)</td><td>Dutsher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>M9 매체:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (3g/L)</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (6g/L)</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCL (5g/L)</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr>의 <tr><td>MgSO4 (1 mM 최종)</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr>의 <tr><td>큐벳 홀더</td><td>Brice Detailleur가 만든</td> <td>집에서 만든</td><td></td></tr>;<tr><td>Claude Moretti가 만든</td> <td>샘플 홀더</td><td>HOME MADE</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>x 스테이지</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 50x20x1 mm</td><td>MARIENFELD</td><td></td><td>컷 다음 10x20x1mm</td></tr><tr><td>피에조 전기 무대 증폭기 / 컨트롤러</td><td>PI</td><td>P-622. ZCD / E-625.CR</td><td></td></tr><tr><td>큐벳 40mmx40mmx10mm</td><td>HELLMA</td><td>704.002-OG.40 mm- 10mm 높이</td><td></td></tr><tr><td>의 다이아몬드 포인트 글라스 마킹 연필</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Olivier</td></tr><tr>Blanc과 Claire Chard&egrave가 개발한<td>C++ (Qt) 홈메이드 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>; S, 요청 시 제공됩니다. 대체 솔루션: Micromanager 또는 LabVIEW&nbsp;</td></tr></tbody></table>

에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정<em&gt; 토토에서</em&gt; 이미징<em&gt; c. 엘레</em&gt; 개발

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

빠른 속도와 낮은 광독성 이미징 기술은 토토의 유기체의 발달을 연구하는 전제 조건이다. 세포 내 해상도로 3D 영상을 제공하면서 빛 시트 기반 현미경, 사진 표백 및 공 초점 현미경에 비해 광독성 효과를 감소시킨다. 여기에 우리가 직립 현미경과 빛 시트의 생성을위한 광 - 기계 요소의 작은 집합으로 구성되어 가벼운 시트 기반의 현미경의 설정을 제시한다. 이 프로토콜은, 빌드 현미경을 정렬하고 빛 시트의 특성을하는 방법에 대해 설명합니다. 또, C. TOTO의 이미징에 대한 방법을 구현하는 방법을 상세 elegans의 간단한 관찰 챔버를 이용하여 배아. 이 방법은 개발의 몇 시간 이상 3D 두 색상 시간 경과 영화를 캡처 할 수 있습니다. 이 기능은 장시간 세포의 모양, 세포 분열 및 태그 단백질의 추적을 용이하게한다.

세 가지 다른 C.로부터 3 3D 시간 경과 기록 실험 엘레 균주는 상술 광 시트 현미경 설정을 사용하여 획득 될 수있는 데이터의 종류를 나타낸다. 우리는 이러한 조건에서 배아 SPIM 이미징 C.에서만 광독성 낮은 수준의 원인을 나타내는 이전 보고서와 일치, 정상 속도로 개발하고 영상 살아남을 것을 확인 엘레 6,7 배아. 첫 번째 변형 GFP (; stIs10024 zuIs178)에 융합 히스톤을 표현한다. 기록마다 37 초 촬영 20 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리)의 더미를 가진 2 시간 동안 실시 하였다. 6가 서로 다른 시점에서 스택의 한면을 보여줍니다 그림. 두 interphasic 핵 (화살표)과 농축 유사 분열 염색질 (화살표 머리)를 명확하게 볼 수 있습니다. 두 번째 변형 GFP (ruIs57)에 융합 튜 불린과 히스톤을 표현mCherry (; stIs10226 itIs37)에 융합. 기록마다 105 초 촬영 20 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리)의 스택과 함께 16 분 동안 수행 하였다. 7 스택과 다른 시점의 서로 다른면을 보여줍니다 그림. 관련 영화 1 표시 3 연속 시점에서 복원을 3D로. 분열 동안, 유사 분열 스핀들 (그린) 및 응축 염색체 (레드) 깨끗이 발달 동안 세포 분열 방향의 추적을 허용하는 표시이다. 세 번째 변형 GFP (pwIs23)에 융합 아포 지단백 VIT-2를 표현하고 mCherry (ltIs44) 바인딩 막. 기록이 매 30 초 촬영 10 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리)의 스택과 함께 25 분 동안 수행 하였다. 8 스택과 다른 시점의 서로 다른면을 보여줍니다 그림. 세포 내에서 노른자 지방 단백질 입자 (녹색)의 빠른 이동을 쉽게 할 수 있습니다다음. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1 : 조명 및 검출 장치, 전면과 바닥 전체로 구성 SPIM 광 설치. 조명 유닛에서는, 다이크로 익 미러에 의해 결합 된 레이저는 각각 독립적으로, 레이저의 파워를 제어 AOTF를 입력한다. 이어서, 망원경은 4 배에 의해 빔의 크기를 증가시키고, 잠망경 현미경의 높이로 가져온다. 원통형 렌즈는 조명 목적으로 재 집중되는 광 시트를 형성한다. 검출부는 직립 현미경에 통합되어 있으며, 주로 검출 렌즈, 필터, 튜브 렌즈와 EMCCD 의해 구성된다. 샘플은 조명 및 검출 경로 사이의 교차점에 위치된다. 압전 단계 수있는 샘플의 수직 (Z) 변위3D 획득을위한. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 큐벳 홀더 홀더는 3 알루미늄 플레이트로 구성되어 있으며, 압전 무대에 나사 결합된다. 유리 베트는 (빨간색) 스프링에 의해 유지된다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3 : C. 실장 프로토콜 SPIM의 실험 elegans의 배아. 유리의 절단 된 부분은 폴리-L-라이신으로 코팅되어 있습니다. 한천의 패드는 코팅 표면 상에 위치된다. 폴리-L-라이신은 다음 한천 패드에 추가됩니다. 마지막으로, C. 엘레 배아는 폴리-L-라이신 코팅 한천 패드에 정렬됩니다. 그림 4 : 샘플 홀더. 홀더 유리 큐벳의 내부 크기에 적합하다. (빨간색) 두 개의 스프링 (그림 3 참조) 유리 슬라이드를 개최합니다. 이 홀더는 다음 유리 큐벳 안에 넣을 수 있습니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> 도 5 :... 샘플 홀더가 관찰 컨텍스트에서 배아 프로토콜이도 3에 요약에 따른 유리 슬라이드에 고정화 슬라이드가도 4에 설명 된 샘플 홀더에 의해 유지되는 샘플 홀더 유리 큐벳에 삽입되어, 그림 2에 설명 된 홀더에 의해 개최. 빛 시트는 내가 수평 및측면에서 배아를 lluminates. 피검 렌즈를 샘플 위에 수직이다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> 그림 6 : C.의 기록 히스톤 :: GFP 융합을 표현 elegans의 배아 유전자 변형 배아의 단일 평면 이미지 히스톤 :: GFP 융합 (zuIs178; stIs10024) 표현하는 서로 다른 시간 지점에서를 3D 시간 경과 기록에서 추출한 이미지 :.. 20 조각 (만든 스택 조각 1 μm의 사이의 거리); 조각 당 노출 시간 : 30 밀리 초; 스택 사이의 시간 간격 : 37 초; 총 수집 시간 : 2 시간. 화살표 : interphasic 핵, 화살표 머리 : 응축 유사 분열 염색질. t = 0 분에서 배아는 2 세포 단계에 있으며, 정상 발달의에서 예상대로 t에서 = 120 분 배아는 70 셀이(하나의 평면에 포함 된 유일한 세포가 배아의 모든 세포가 아닌 그림에서 볼 수 있으며주의) 오줌. 조명의 전력 (조명 목적의 출구에서 측정) 488 nm에서 30 μW했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> 그림 7 : C.의 기록 엘레의 튜 블린 :: GFP 융합을 표현 배아와 히스톤 :: mCherry 융합. C.의 3D 시간 경과 기록에서 추출한 이미지 튜 블린 :: GFP 융합 (ruIs57)와 히스톤 :: mCherry 융합 (; stIs10226 itIs37)을 표현 elegans의 배아. 촬영 조건 : 조각 1 ~ 20 조각 (거리의 스택의 인수μm의) 모든 105 초; 총 수집 시간 : 16 분; 노출 시간 : 각 채널에 대해 200 밀리 초. 패널은 동일한 스택의 10 조각을 보여줍니다. 패널 B는 동일한 슬라이스마다 210 초를 보여줍니다. 조명의 전력 (조명 목적의 출구에서 측정) 각각 488 및 561 nm의 레이저, 30 μW 300 μW했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> 그림 8 : C.의 기록 VIT-2 :: GFP 융합을 표현 elegans의 배아와 C의 3D 시간 경과 기록에서 추출한 막 대상 mCherry. 이미지 엘레 배아 VIT-2 :: GFP 융합을 표현 (PWIS23) 및 막 - 대상 mCherry (ltIs44). 촬영 조건 : 10 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리) 매 30 초 스택의 인수; 총 수집 시간 : 25 분; 채널 당 노출 시간 : 200 밀리 초. 패널은 동일한 스택의 제 5 슬라이스를 나타낸다. 패널 B는 동일한 슬라이스마다 30 초를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 가벼운 시트 현미경의 설치 및 C의 생체 내 이미징을위한 그것의 구현에 대해 설명합니다 엘레 배아.

에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정<em&gt; 토토에서</em&gt; 이미징<em&gt; C. 엘레</em&gt; 개발

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

이 절차의 전반적인 목표는 형광 라이트 시트 현미경을 사용하여 C Allergan의 발달 과정을 이미지화하는 것입니다. 이는 먼저 정립 현미경과 라이트 시트를 생성하기 위한 소수의 광학 기계 요소로 구성된 라이트 시트 기반 현미경을 설정함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 배아를 고정하는 것입니다.마지막 단계는 배아에 라이트 시트(light sheet)를 맞추고 발달 과정을 기록하는 것입니다. 3D 및 타임랩스 비디오 분석을 통해 C. elegans 발달 과정 중 형광 표지된 단백질의 동역학을 확인할 수 있습니다. 공초점 현미경과 같은 다른 기존 방법과 비교했을 때 라이트 시트 현미경의 주요 장점은 광독성이 적으며 더 빠른 이미징이 가능하다는 점입니다.셋째, 이 방법은 물개 발달에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 쥐나 제브라피시와 같은 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 본 절차의 시연을 통해 이를 명확히 보여줄 것입니다.제 실험실의 엔지니어인 Shales와 van 실험실의 엔지니어인 Pauline Linac이 참여하였습니다. 이 섹션에서는 셋업 조립 과정을 설명하며, 모든 실험 동안 조립된 상태로 유지할 수 있습니다. 레이저, 필터, 망원경 및 페리스코프를 광학 테이블 위에 모두 배치한 후, 라이트 시트를 생성하기 위해 원통형 렌즈를 고정하십시오.다른 렌즈의 초점을 조절합니다. 조명 대물렌즈의 초점이 검출 대물렌즈의 물체 초점과 일치해야 합니다. 이제 빔을 벽이나 스크린에 투사하고, 투사된 윤곽이 선명해질 때까지 조명 대물렌즈를 빔 축을 따라 이동시킵니다.현미경 설정에 quad line emission filter와 E-M-C-C-D 카메라를 포함하십시오. 두 번째 수동 이동 스테이지를 첫 번째 스테이지에 수직으로 고정하십시오. 해당 조립체를 기존 현미경 스테이지에 나사로 고정하십시오.설정된 원통형 렌즈 조명 대물렌즈를 제거한 후, 어셈블리를 현미경 위에 배치하고 조명 세트를 스테이지 위에 다시 놓습니다. 조명 경로와 검출 경로가 수직으로 교차하는 지점에 qve 홀더를 부착합니다. 이제 라이트 시트를 확인하십시오.유리 큐벳에 플루오레세인(fluorescein) 용액을 채우고 스테이지 위의 홀더에 놓습니다. 라이트 시트(light sheet)가 보여야 합니다. 라이트 시트는 수평이어야 하며 검출 대물렌즈를 기준으로 중앙에 위치해야 합니다.다음으로, 원통형 렌즈를 제거합니다. 조명 대물렌즈를 3D로 이동시켜 라이트 시트를 최적화하고, 이미지를 획득하여 라이트 시트의 두께를 측정합니다. 이는 대물렌즈의 개구수에 따라 달라집니다.그런 다음 원통형 렌즈를 반드시 교체하십시오. 우선, 다이아몬드 마킹 펜을 사용하여 두께 1 mm, 크기 10 mm × 20 mm의 유리 조각을 자릅니다.다음으로, 슬라이드 한쪽에 poly L lysine 20 µL를 첨가하고, 건조되면 다른 슬라이드와 나란히 배치합니다. 고정된 위치에서 5% agar 한 방울을 떨어뜨리고, 그 위에 세 번째 슬라이드를 올려 무게로 눌러 평평하게 폅니다. agar가 건조되면 세 번째 슬라이드를 제거하고, poly L lysine이 없는 슬라이드 위에서 남은 두 슬라이드 가장자리로부터 3 mm 떨어진 지점에서 agar 패드를 절단합니다.그런 다음 고정된 슬라이드를 제거하여 한천(agar)이 돌출되게 합니다. 한천 표면에 poly L lysine 20 µL를 도포하고 건조시킵니다. 이제 해부 현미경 하에서 M9 배지가 채워진 시계 접시에 GR 벌레들을 넣습니다.메스로 질(vulva) 높이에 맞춰 벌레를 절단하여 알을 배출시킵니다. 그런 다음 관심 단계의 배아를 식별하고 마이크로 모세관 피펫으로 수집합니다. 배아를 준비된 슬라이드의 가장자리 바로 옆, 즉 한천(agar)의 경계선 위가 아닌 돌출된 한천 부위로 옮깁니다.그 다음, 액체를 제거하면서 마이크로 모세관 피펫을 이용해 배아를 정렬합니다. 흡입을 통해 배아가 폴리리신(polyol lysine)에 부착됩니다. 좋은 영상을 기록하기 위해서는 배아의 위치를 잘 잡는 것이 매우 중요하며, 이를 위해 적절한 구경의 모세관이 필요합니다.크기가 너무 작으면 배아를 방출하기 어렵습니다. 반대로 너무 크면 유출되는 흐름을 엄격하게 제어하고 배아를 정렬하는 것이 어려워집니다. 페트리 접시에서 M nine medium으로 슬라이드를 덮고, 확대경을 사용하여 배아가 여전히 아가로에 부착되어 있는지 확인하십시오. 이제 배아가 준비된 슬라이드를 vete에 맞는 샘플 홀더에 고정하십시오.홀더는 vete에 맞도록 자체 제작된 장치입니다. 다음으로, vete를 Pizo 전기 스테이지에 고정하고 명시야 조명 하에서 배아를 찾습니다. 이제 acoustic optic tuneable을 제어하는 소프트웨어 패키지를 실행하십시오.카메라와 스테이지의 필터를 설정하십시오. 여기 사용된 소프트웨어는 자체 제작되었으나, 프리웨어인 micromanager를 사용할 수도 있습니다. 먼저, 레이저 라인을 선택하십시오.다음으로, 라이트 시트의 밝기가 최대가 될 때까지 x축을 따라 스테이지를 조정합니다. 그런 다음 신호 대 잡음비가 최적이 될 때까지 나머지 두 차원인 Y와 Z를 조정합니다. 이 과정은 각 배아마다 반복해서 수행해야 할 수도 있습니다.배아의 정밀한 시뮬레이션과 최적의 대비를 얻기 위해, 신호 대 잡음비를 최적화하여 우수한 기록을 확보하는 것이 핵심이며, 이는 자유 단계의 변환, 지지 및 제거 목적을 달성하는 것과 관련이 있습니다. 이제 배아의 형광 수준과 분석 대상인 생물학적 과정의 속도에 따라 레이저 출력, 노출 시간, 게인 및 이미징 간격을 설정하여 타임랩스 이미지를 획득하십시오. Zack을 위해.histone GFP 구조체를 발현하는 c elgan에서 슬라이스 간 거리와 시작 및 종료 위치를 설정하여 이미징을 수행했습니다. 37초마다 20개의 슬라이스 스택을 촬영하여 2시간 동안 타임랩스 이미징을 진행했습니다. GFP가 융합된 tubulin과 m cherry가 융합된 histone을 발현하는 균주에서 세포 분열이 뚜렷하게 관찰되었습니다. 녹화는 105초마다 16분 동안 수행되었습니다.세 가지 시점의 3D 렌더링 이미지가 표시되어 있습니다. 방추사와 응축된 염색체가 명확하게 보이며, 세포 분열 과정을 통해 쉽게 추적할 수 있습니다. 세 번째 균주에서는 세포막을 mCherry로 라벨링하고 GFP와 융합된 APO lipoprotein vit two를 이미징하였습니다.13분 동안 27초 간격으로 10개의 슬라이스 스택을 촬영했습니다. 빠르게 이동하는 지질단백질 입자들을 쉽게 추적할 수 있었습니다. 여기서는 더 복잡한 방법으로 생성된 라이트 시트를 사용합니다.공간 분해능을 더욱 향상시키기 위해 라이트 시트를 구현할 수 있습니다.

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