تقييد أنزيم الاستنساخ القائم على أسلوب لتقييم

الهدف العام من هذا الإجراء هو دمج جينات gag المشتقة من أفراد مصابين بفيروس HIV1 من النمط الفرعي C في بلازميد HIV1 قادر على التضاعف، وذلك لتقييم تأثير تعدد الأشكال في تسلسل gag على قدرة HIV1 على التضاعف في المختبر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تضخيم جين gag من بلازما المريض. وتتمثل الخطوة الثانية في استنساخ تسلسل gag المشتق من المريض في المستنسخ الجزيئي المعدي القادر على التضاعف MJ-four. بعد ذلك، يتم ترصيف بلازميد gag-MJ-four الهجين من أجل توليد مخزونات فيروسية معدية وتقدير عيارها لتقييم القدرة الإعدائية على خط خلايا مؤشر. والخطوة النهائية هي قياس قدرة التضاعف في المختبر في خط خلايا T من نوع GXR-25. وفي النهاية، يُستخدم مقايسة إنزيم النسخ العكسي المسمى إشعاعياً لقياس كمية إنتاج الفيريونات بمرور الوقت من أجل تصور حركية التضاعف الفيروسي.

يمكن للطريقة التي سنقوم بوصفها اليوم أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال فيروس نقص المناعة البشرية (HIV). وتشمل هذه الأسئلة تحديد محددات الكفاءة التكاثرية لفيروس HIV وفهم كيفية تأثير هذه الكفاءة على الإمراضية طويلة المدى. ستقوم جيسيكا برينس ودان كليبورن، وهما اثنان من طلابي في مرحلة الدراسات العليا، بوصف الطرق اليوم.

لبدء هذا الإجراء، قم بنسخ cDNA عكسياً من RNA وتضخيم نواتج DNA للدورة الأولى باستخدام إنزيم النسخ العكسي وبوليميراز DNA مستقر حرارياً في تفاعل RT-PCR من خطوة واحدة. ثم، وباستخدام ميكروليتر واحد من تضخيم PCR للدورة الأولى كقالب DNA، قم بإجراء تضخيم PCR متداخل للدورة الثانية. بعد ذلك، أضف ثلاثة ميكرولتر من صبغة تحميل بتركيز 5X إلى خمسة ميكرولتر من حجم تفاعل الدورة الثانية.

شغِّل العملية عند 120 فولت على هلام أغاروز TAE بتركيز 1% يحتوي على صبغة DNA فلورية للأشعة فوق البنفسجية حتى تنفصل الحزم. ثم قم بتصوير الحزم ذات الحجم 1.6 KB باستخدام جهاز إضاءة بالضوء الأزرق. بعد ذلك، شغّل حجم التفاعل المتبقي البالغ 45 µL على هلام أغاروز TAE بتركيز 1% يحتوي على صبغة DNA. استأصل الحزم المناسبة باستخدام شفرة حلاقة نظيفة واجمع ثلاثة تفاعلات إيجابية لكل فرد. لاحقاً، استخلص DNA من شريحة الهلام باستخدام طقم تنقية الهلام وقم بإذابته في ماء خالٍ من النوكلياز. جمّد المنتج عند -20 °C لاستخدامه لاحقاً. 0:15:56 في هذا الإجراء، بعد تضخيم منطقة 5' UTR للتكرار الطرفي الطويل (LTR) في بلازميد MJ-four، قم بتصوير نواتج PCR ذات الحجم 1.3 KB على جهاز الإضاءة. استأصل المضخمات الإيجابية، ثم قم بتنقيتها وتجميدها كما وصف سابقاً. بعد ذلك، أنشئ مضخمات MJ-four LTR gag المدمجة عبر تقنية PCR التمديدية بتداخل الوصلات (splice overlap extension PCR). قم بتصوير واستئصال وتنقية وتجميد المضخم الطويل ذو الحجم 3.2 kb. الآن، قم بهضم 1.5 µg من بلازميد MJ-four و1.5 µg من ناتج PCR المُنقى LTR-gag باستخدام إنزيم القطع BCL-one لمدة 1.5 ساعة عند 50 °C. لاحقاً، أضف 1 µL من NGOM-four إلى تفاعل الهضم واحضنه عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أضف صبغة تحميل 5x إلى تفاعلات الهضم التقييدي. قم بإجراء الرحلان الكهربائي ببطء للحجم الكلي على هلام أغاروز TAE بتركيز 1% يحتوي على صبغة DNA لمدة ساعة إلى ساعتين عند 100 فولت. قم بتصوير واستئصال وتنقية الحزم المحددة لغرض الاستنساخ كما وصف سابقاً.

بعد ذلك، قم بتحضير تفاعلات الربط باستخدام قطعة LTR-gag المدرجة المنقاة وناقل DNA من نوع MJ-four بنسبة قطعة مدرجة إلى ناقل تبلغ 3:1. قم بتحضين تفاعلات الربط طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، يتم تحويل بكتيريا JM-109 ذات الكفاءة الكيميائية باستخدام نواتج الربط عن طريق نشرها على أطباق آغار LB تحتوي على 100 micrograms per milliliter من Ampicillin. تُحضن البكتيريا المحولة عند 30 degrees Celsius لمدة لا تقل عن 22 hours. وللتأكد من دقة الاستنساخ، يتم قطع DNA المستخلص بتقنية mini prep باستخدام إنزيمات القطع NGOM-four وHPA-one في عملية هضم مزدوج عند 37 degrees Celsius لمدة two hours.

بعد ذلك، قم بتحليله على هلام أجاروز بتركيز 1% في محلول TAE. احسب حجم الفيروس المطلوب من كل مخزون بناءً على عيار الـ IU لكل ميكرولتر المستمد من مقايسة خلايا TZM-BL، وذلك لإصابة 5×10⁵ من خلايا GXR-25 بمضاعف عدوى قدره 0.05. تأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة للعمل مع فيروس HIV القادر على التكاثر، والتي تشمل مئزرًا كاملاً وقناع وجه وقفازات مزدوجة. في يوم الإصابة، أخرج مخزونات الفيروس من المجمد عند درجة حرارة -80 °C وقم بإذابتها. بعد ذلك، خفف الفيروس في وسط C-R-P-M-I ليصل الحجم إلى 100 µL، وذلك لتحقيق MOI قدره 0.05. أضف المزيج إلى طبق زراعة أنسجة بـ 96 بئرًا ذات قاع على شكل V، مع تضمين ضابط موجب وضابط سالب في كل مجموعة من تجارب التكاثر، وقم بتنظيم الطبق بحيث يكون كل عمود متبادل فارغاً للحد من التلوث الخلطي بين الآبار. بعد ذلك، قم بعدّ خلايا GXR-25 باستخدام عداد خلايا آلي واحسب إجمالي عدد الخلايا المطلوبة لجميع عمليات الإصابة. انقل الحجم المطلوب إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL وقم بالطرد المركزي لترسيب الخلايا. ثم اسحب الوسط بعناية وأعد تعليق الخلايا في وسط C-R-P-M-I بتركيز 5×10⁵ خلية لكل 100 µL. انقل الخلايا بواسطة الماصة إلى حوض معقم وامزجها جيداً. لاحقاً، وباستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 µL من الخلايا إلى كل بئر من طبق الـ 96 بئرًا الذي يحتوي على الفيروس المخفف وامزجها جيداً. بعد ذلك، أضف 2 µL من محلول polybrene بتركيز 5 mg/mL إلى كل بئر وامزج الخلايا جيداً. ثم قم بالتحضين عند درجة حرارة 37 °C في حضانة زراعة أنسجة مع 5% CO2 لمدة ثلاث ساعات.

من أجل غسل الخلايا المصابة، قم بطرد مركزي لصفيحة 96 بئراً ذات قاع على شكل V لترسيب الخلايا. ثم قم بإزالة 150 µL من الوسط بعناية واستبدلها بـ 150 µL من C-R-P-M-I الجديد دون تحريك كتلة الخلايا المترسبة. كرر الإجراء مرتين إضافيتين لغسل الخلايا بشكل كافٍ؛ وبعد عملية الطرد المركزي الأخيرة وإضافة 150 µL من C-R-P-M-I، قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا المترسبة باستخدام ماصة متعددة القنوات. أضف الخليط من كل بئر إلى 800 µL من C-R-P-M-I في بئر من صفيحة زراعة أنسجة ذات 24 بئراً. ثم ضع الصفيحة في حاضنة زراعة أنسجة تحتوي على 5%CO2 عند درجة حرارة 37 °C. كل يومين، انقل 100 µL من السائل الطافي من سطح بئر المزرعة إلى بئر في صفيحة 96 بئراً ذات قاع على شكل U وقم بتجميدها للتحليل اللاحق باستخدام مقايسة RT. ثم أعد تعليق الخلايا جيداً وأزل نصف الحجم المتبقي لمنع الإفراط في نمو الخلايا. بعد ذلك، استعد الحجم الأصلي بإضافة 550 µL من C-R-P-M-I الجديد إلى كل بئر.

في هذا الإجراء، أضف من 1 إلى 2 µL من DTTP بتركيز 10 mCi/mL و 4 µL من DTT بتركيز 1 M إلى كل جزء حجمه 1 mL من المزيج الرئيسي لـ RT. اخلط بعناية كل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL يحتوي على المزيج الرئيسي لـ RT و DTT و DTTP باستخدام ماصة سعة 1000 µL، ثم انقل المزيج إلى حوض معقم.

بعد ذلك، قم بتوزيع 25 µL من مزيج RT المسمى في كل بئر من ألواح PCR ذات الجدران الرقيقة المكونة من 96 بئراً. أضف 5 µL من كل سائل طافٍ إلى لوح PCR الذي يحتوي على المزيج الرئيسي لـ RT. ثم أحكم إغلاق لوح PCR بغطاء من الرقائق اللاصقة واتركه في الحاضنة لمدة ساعتين عند 37 °C في جهاز الدورات الحرارية. بعد الحضن، اصنع ثقوباً صغيرة في غطاء الرقائق باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 200 µL. اخلط العينات خمس مرات. انقل 5 µL من كل عينة إلى ورق DE-81 واترك جميع العينات لتجف في الهواء لمدة 10 دقائق. ضع لطخات الورق في حاويات غسيل منفصلة. بعد ذلك، اغسل اللطخات خمس مرات باستخدام 1X SSC. ثم اغسلها مرتين باستخدام 90% ethanol لمدة خمس دقائق لكل غسلة قبل تركها لتجف في الهواء. بمجرد الجفاف، لف اللطخة بعناية بغشاء Saran الواقٍ وعرضها لشاشة الفوسفور في كاسيت محكم الإغلاق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد أن تصبح جاهزة، قم بتحليل الشاشات الفسفورية باستخدام جهاز تصوير فسفوري وقم بقياس كمية النسخ المشعة.

موضّح. فيما يلي صور تمثيلية للهلام توضح الفصل الكهربائي لمقاطع تضخيم PCR المختلفة اللازمة لإنتاج مقطع تضخيم لجين gag مشتق من مريض وقابل للاستنساخ في العمود الفقري لبلازميد MJ-four. تُظهر هذه الصورة التمثيلية للهلام الفصل الكهربائي لمنتجات الهضم الإنزيمي باستخدام إنزيمات التقييد لاستنساخ جينات gag الخاصة بالمريض في MJ four.

وتوضح صورة الجل التمثيلية هذه الفصل الكهربائي لنواتج هضم إنزيمات التقييد للحمض النووي البلازميدي المنقى من كيميرا gag MJ-four. ويظهر هذا الرسم البياني مدى تكرارية مقايسة التضاعف بمرور الوقت في الخط الخلوي GXR-25. وقد استخدمت الفيروسات الكيميرية gag MJ four ذاتها لإصابة خلايا GXR-25 في تجربتين مستقلتين أجريتا بفاصل زمني يقارب العام الواحد.

تم استخراج درجات التضاعف عن طريق حساب ميل قيم DLU المحولة لوغاريتمياً ومعايرة هذا الميل وفقاً للنمط البري MJ-four. ويرتبط القياسان المستقلان ارتباطاً وثيقاً، مما يؤكد قابلية تكرار المقاييس التي أُجريت في أوقات مختلفة وباستخدام خلايا في ممرات مختلفة. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال HIV AIDS لاستكشاف المحددات الفيروسية للإمراض في حالات العدوى الحادة من النمط الفرعي C، وهو النمط الفرعي الأكثر انتشاراً على مستوى العالم. إن العمل مع HIV القادر على التضاعف قد يكون خطيراً للغاية؛ لذا يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن فيروسات حية في مرافق BSL two plus. كما يجب تطهير جميع الأسطح بانتظام وارتداء قفازات مزدوجة في جميع الأوقات.