폴리 (ε 카프로 락톤) 전기 방사 원사에 인간 중간 엽 줄기 세포의 첨부 파일을 최적화

이 절차에서는 최적의 세포 파스딩 설정을 결정하기 위해 전기 방적 PCL 스캐폴드를 다양한 방식으로 설정합니다. 먼저, 멸균 스캐폴드는 세포 배양 삽입물, 트로프 및 생물반응기 회전 용기를 포함하여 조사 중인 다양한 설정에 배치됩니다. 일단 제자리에 놓이면 알려진 수의 세포가 골격에 파종된 다음 20분 동안 방해받지 않고 그대로 둡니다.

그런 다음 모든 샘플을 조심스럽게 인큐베이터로 옮기고 이산화탄소 5%와 섭씨 37도를 설정하고 몇 시간 전에 정적 또는 동적 조건에 노출시킵니다. 이 배양 시간 이후, 골격에 부착된 세포의 수는 골격 배지 및 웰 분획에 있는 세포의 양을 정량화하기 위해 DNA 분석에 의해 결정됩니다. 궁극적으로, 이는 골격, 웰 및 주변 매체에 존재하는 DNA를 정량화하여 주사 전자 현미경 또는 SEM이 사용되는 골격에 세포가 부착되는 것을 확인함으로써 달성됩니다.

이 조사에 대한 아이디어는 스캐폴드가 웰 플레이트의 전체 바닥을 덮지 않는다는 것을 알았을 때 처음 떠올랐는데, 이는 모든 세포가 스캐폴드와 접촉하지 않아 부착할 수 없을 가능성이 있다는 것을 의미했습니다. 시작하려면 멸균 6웰 세포 배양 삽입물을 열고 이빨이 있는 짧은 고리를 넓은 고리체에서 분리하여 얇은 층 흐름 아래에 세포 배양 삽입물을 설정합니다. 그런 다음 이빨이 위를 향하도록 반지를 잡고 4cm 골격 중 하나를 고리 중앙에 걸고 양쪽이 겹치도록 합니다.

고리가 있는 몸체를 잡고 치아 고리와 골판 위에 놓습니다. 그런 다음 아래쪽으로 밀어 골격이 제자리에 유지되고 세포 배양의 중심을 통과하는지 확인합니다. 삽입하다. 스캐폴드가 있는 세포 배양 인서트를 6웰 저결합 플레이트의 웰에 놓고 스캐폴드에 10ml의 배양 배지를 추가합니다.

그런 다음 폴리테트라플루오로에틸렌 여유를 개별 페트리 접시에 넣고 여물통에 10ml의 배양 배지를 추가합니다. 집게를 사용하여 3cm 골격 중 하나를 골에 드레이프하고 길이가 골의 긴 가장자리와 평행이 되도록 합니다. 라미나 흐름(lamina flow)으로 바이오리액터 용기를 설정하려면 바이오리액터 용기의 메인 포트를 통해 10ml의 멸균 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 분배합니다.

10분 후 PBS를 제거하고 겸자를 사용하여 8ml의 배양 배지로 교체합니다. 3cm 비계 중 하나를 주 포트를 통해 선박에 삽입합니다. 그런 다음 메인 포트에서 포즈를 취하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 인간 중간엽 줄기세포 계수를 수행한 후, 세포 펠릿을 떠나는 원심분리 튜브의 배지를 흡인하고 계산된 배지 부피로 교체합니다. Resus는 균일한 혼합을 위해 세포와 배지를 현탁합니다. P 200 Gilson 피펫을 사용하여 피펫 끝을 골격 길이를 따라 매체 액체 표면 아래로 이동하여 각 골판에 200마이크로리터의 세포 현탁액을 천천히 분배합니다.

20분 동안 방해받지 않고 그대로 두거나 생물반응기 용기가 주 포트를 통해 200마이크로리터의 세포 현탁액을 분배했습니다. 나머지 2ml의 배양 배지를 주사기 포트로 채워 총 10ml의 부피를 제공합니다. 다음으로, 생물반응기 용기를 회전 용기 생물반응기로 옮기고 회전하도록 설정합니다.

9RPM에서 세포 배양 인서트 및 트로프가 있는 웰 플레이트를 셰이커 플레이트로 옮기고 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터 또는 정적 배양에서 30RPM으로 회전하도록 설정합니다. 세포 배양 인서트 및 트로프가 있는 웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터의 선반으로 옮깁니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정합니다.

4시간 후, 인큐베이터에서 샘플을 꺼내 층류 아래에 놓습니다. 다음으로, 모든 샘플에서 매체 분획을 제거하고 별도로 라벨링된 원심분리기 튜브에 넣습니다. 241 번 G에서 5 분 동안 원심 분리 한 후, 3 밀리리터의 용해 완충액 와류를 첨가하기 전에 supinate를 제거하고, 세포 배양 삽입물 내에 보유 된 골격을 분해하는 용액 먼저 골격을 사용하여 골격을 삽입 가장자리에 가깝게 절단하여 골격을 해제합니다.

그런 다음 집게를 사용하여 골격을 제거하고 3ml의 용해 완충액이 들어 있는 원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 각 스캐폴드 용기에 3ml의 용해 완충액을 추가하고 표면을 긁어냅니다. 용해 완충액을 제거하고 별도로 라벨이 부착된 원심분리기 튜브에 넣습니다.

각 원심분리기 튜브를 약 1분 동안 소용돌이치게 하여 충분한 교반을 보장하고 세포막의 용해를 촉진합니다. 검은색 96 웰 플레이트에 각 샘플 분획 스캐폴드 배지에 대해 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가한 다음 암흑 속에서 용해 완충액을 포함하는 모든 웰에 100마이크로리터의 세포 DNA 용액을 추가하고 혼합합니다. 웰 플레이트에 대한 음성 및 양성 대조군을 제공하기 위해 DNA와 세포 DNA 용액이 포함되지 않은 용해 완충액이 있는 웰을 부드럽게 포함합니다.

형광 플레이트 리더를 사용하여 485나노미터 여기 및 520나노미터 방출에서 웰의 흡광도를 측정합니다. SEM 고정을 수행하기 위한 제조업체의 지침에 따라 DNA 표준물에서 생성된 표준 곡선과 데이터를 비교합니다. 4시간 동안 배양한 후 용기에서 모든 골격을 제거하고 새로운 6개의 웰 플레이트와 층류의 별도 웰 내에 놓습니다.

그런 다음 PBS로 골격을 각각 두 번 세척합니다. PBS에 1.5%글루타르알데히드 2밀리리터를 첨가하여 골격에서 완전한 적용 범위를 보장합니다. 셀 고정을 위해 플레이트를 섭씨 4도에서 최소 30분 동안 그대로 두십시오.

정착액을 제거하고 PBS로 골격을 두 번 세척합니다. 그런 다음 골격을 새 웰 플레이트로 옮겨 증류수에서 50% 에탄올로 시작하여 70%, 각 농도에 대해 90%로 에탄올 농도를 증가시켜 탈수합니다. 골격을 용액에 완전히 담그고 용액을 버리고 반복하기 전에 3 분 동안 그대로 두십시오.

골격을 용액에 완전히 담그고 5분 동안 그대로 두어 골격을 100% 에탄올로 탈수한 다음 용액을 버리고 골격을 화학적으로 건조하는 것을 반복합니다. 흄 찬장 내에서 HMDS를 사용합니다. 스캐폴드를 HMDS에 담그고 5분 동안 그대로 두었다가 한 번 반복한 후 HMDS를 제거합니다.

HMDS를 제거하고 스캐폴드를 건조시킵니다. 그런 다음 시중에서 판매되는 SEM 스텁에 스캐폴드를 장착하여 SEM 코트 내에서 쉽게 볼 수 있도록 하고, 샘플은 얇고 균일한 적용 범위를 보장하기 위해 2분 동안 골드 스포터 코트로 코팅됩니다. 마지막으로, 샘플을 SEM 내에 배치하고 5kg 전자 금고 전자빔을 사용하여 세포에 앉은 골격을 시각화합니다.

결과는 조사된 각 실험 설정에 대해 파종 후 4시간 후 세포의 위치를 강조합니다. 이 그림은 모든 시딩 설정이 조사된 이 시간 동안 스캐폴드 표면에 부착된 세포의 비율을 보여줍니다. 세포 부착 비율은 상대적으로 낮지만 세포 배양 삽입물 내에 유지되고 30RPM으로 진탕된 골격에 대한 세포 부착력이 가장 큽니다.

가장 낮은 순응도는 세포 배양 삽입물 내에 유지되고 정적 조건에서 유지되는 골격에 대한 것이었습니다. 많은 수의 세포가 배지 분획 내에 존재했으며, 특히 세포 배양을 위해 존재했습니다. 낮은 결합 플레이트 내에 50%로 유지되는 인서트와 51%의 회전 용기 내에 유지된 골격은 홀더 자체 내에 존재하는 세포의 수가 증가했음을 보여주었습니다.

48%for 쓰루 셰이커와 50%for 쓰루 정적 스캐닝. 전기 현미경을 통해 세포 파종 골격을 육안으로 평가할 수 있었습니다. 대표적인 이미지는 파종 설정과 관계없이 섬유질 표면에 세포의 존재가 제한되어 있음을 강조했습니다.

그러나, 세포 배양 삽입물 내에 유지된 골격에 더 많은 수의 세포와 세포 응집체가 존재하고 30 RP M에서 흔들렸습니다.이 비디오를 시청한 후, 알려진 수의 세포를 시딩하는 것이 특히 야생 플레이트의 전체 기저를 덮지 않는 골격의 경우 실제로 골격에 부착되는 많은 세포와 반드시 동일하지는 않다는 것을 잘 이해해야 합니다. 이와 같은 골격의 경우, 골격에 대한 초기 세포 부착을 최대화하기 위해 먼저 다른 세포 시딩 설정을 최적화하는 것이 좋습니다.