Name: 원격 사지 허혈 양상 : 설치류에 신경 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 배우세요 쥐 후지 허혈을 이용한 원격 허혈 전처리법으로 망막을 광 손상으로부터 보호하는 방법을. 이 기술은 내인성 신경보호 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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저자는 Sharon Spana 여사(시드니 대학)가 설치류 모니터링, 취급 및 실험에 도움을 준 것에 감사드립니다. 저자는 이 원고를 준비하는 데 도움을 주신 Jonathan Stone 교수와 Dan Johnstone 박사에게 감사의 뜻을 전합니다. 박사 학위 자금 지원은 시드니 대학교(University of Sydney)와 호주 시력 우수성 센터(Australian Center for Excellence in Vision)에서 제공했습니다.

윤리 문 : 프로토콜은 5657 # AEC 시드니 대학의 동물 관리 가이드 라인을 따른다. 마취 동물 윤리위원회 (시드니 대학, AEC # 5657)에 의해 승인되었다. 1. 장비 준비 <ol><li> 실시간 피부 온도 추적을 사용합니다. 컴퓨터에 스위치, 데이터 수집 하드웨어. </li><li> 열기 온도 레코딩 소프트웨어 및 온도 ° 30 ~ 35 사이의 C로 설정하고 매 100 밀리 초에 샘플링 주파수를 조정합니다. </li><li> 옵션 : 코어 온도를 보장하기 위해 삽입 직장 온도계가 37.5 ° C에서 안정적으로 유지. </li></ol> 수동 혈압계 2. 교정 <ol><li> 250~550그램 쥐에 대한 크기 2 커프를 sphygmomanometer.Use하는 신생아 팔 커프를 연결합니다. 어댑터는 혈압계 커프에 튜브를 연결하는 것이 필요할 수있다. </li><li> 하나의 공기 방출 밸브를 느슨하게하거나 적응로부터 커프 튜브를 분리하여 커프를 수축나. 더 압력을 확인하지하면 튜브에 남아 및 압력계의 바늘은 타원형 / 사각형 안에 제로에 달려있다. </li><li> 배관, 압력계와 팔목 사이의 압력을 확인합니다. 이 압력계 100 mmHg로 표시 될 때까지 인플레이션 전구의 부드러운 펌프 커프를 부풀려. 압력이 일정하게 유지 확인. 천천히 공기 방출 값을 개방함으로써 커프를 수축. </li></ol> 3. 동물 준비 참고 : 어두운 적응을 필요로 빛 부상을 받아야하는 원격 허혈 전날 밤입니다 동물. 가벼운 손상을받은 동물은 어두운 양육 (12 시간 빛을 : 어두운주기 (5 룩스)) 필요 <ol><li> 깨어 또는 anesthetised 설치류 중 하나에서 원격 허혈을 수행합니다. 동물이 건강한 근육이 있는지 확인합니다. 적절한 근육의 존재가 확인하기 위해 위 뒷다리를 곤란하여이를 확인합니다. 가벼운 부상에 대한 RIP에 의한 보호는 생후 6 개월까지 앉아있는 쥐에서 테스트되었습니다. </li><li> R에 대한 Anesthetised 준비IP <ol><li> 60 ㎎ / ㎏ 케타민 5 ㎎ / ㎏ 자일 라진의 복강 내 주사로 쥐를 주입한다. 다리 연장하고 다리의 하부에 피부를 집어 마취 깊이를 확인한다. 이 깊이 anesthetised 경우 동물은 더 반사가 없습니다. 마취 동안 각막 건조를 방지하기 위해 인공 눈물을 적용합니다. </li><li> 열 패드 또는 37.5 ° C의 일정 체온을 유지하기 위해 온수 배관을 순환하는 하나의 래트를 놓는다. 낮은 사지 &#39;발 패드면이 위를 향하도록하여 발생하기 쉬운 위치에 쥐를 놓습니다. 어느 쪽의 오른쪽 또는 왼쪽 사지 원격 허혈을 거칠 수있다. </li></ol></li><li> RIP 깨어 준비 참고 : 동물 실험 두 사람이 필요합니다 잠에서 깨어. 한 사람이 동물을 억제하고, 두 번째 사람은 수동 혈압계를 운영하고 있습니다. 실험자는 구속 핸들러에 부상의 위험을 증가함에 따라 절차를 수행 할 자신감이 있어야합니다. 원격 허혈을받은 쥐들은 T를 조절해야합니다O 설명서를 구속. 직관적 인 가이드 라인에 따라 수동 구속은 주에 걸쳐 5 분에서 최대 30 초에서 진행을해야합니다. 수동 구속에 순응하지 못하는 겁 많은 동물이 깨어 실험에서 제외되어야한다. 마지막으로, 수동 구속 정확하게 RIP 연구 결과를 해석하는 데 사용해야합니다 동물에게 스트레스 (잠재적으로 연구에 교란을 소개)와 가짜 코호트 (염증없이 커프의 배치)을 일으킬 가능성이있다. <ol><li> 15cm X 30-50cm의 조각으로 수건을 잘라 뒷다리의 상단에 머리를 커버, 쥐의 척추에 수직 짧은 가장자리를 놓습니다. </li><li> 쥐의 몸통 아래의 짧은 쪽을 단단히 감싸과 수건의 나머지 긴 가장자리 쥐를 포장하기 시작합니다. 앙와위에서 팔 아래 포장 동물을 고정합니다. 쥐가 왼쪽 팔에서 개최되는 경우, 수건에서 쥐의 오른쪽 다리를 무료로 제공됩니다. </li></ol></li></ol> 4. 응용 프로그램 OF 피부 온도 프로브 <ol><li> 허혈를 받아야하고, 발바닥의 피부 프로브를 배치하는 것입니다 쥐의 다리를 확장 할 수 있습니다. 온도 프로브와 피부 사이의 접촉을 극대화하기 위해 피부 프로브를 배치합니다. 단단히 발바닥에 프로브를 밀어 종이 테이프와 프로브를 부착합니다. </li><li> 온도 레코딩 소프트웨어에 온도를 추적하여 피부 프로브 위치를 확인하십시오. 피부 온도는 30-34 ° C의 사이이며 안정적으로 유지 있는지 확인하십시오. 1-2 분 동안 피부 온도를 추적. 온도가 불안정하거나 30 ° C 이하이면 피부 프로브를 조정한다. </li></ol> 5. 원격 허혈 <ol><li> 커프를 수축 및 공기압 밸브가 폐쇄되어 있는지. 다리를 확장하고 느슨하게 상단 뒷다리에 커프를 둘러싸. 위치에 느슨하게 커프를 유지하기 위해 다리와 낮은 숫자를 확장하는 집게 손가락과 엄지 손가락을 사용합니다. </li><li> 깨어 동물 incre 160 mmHg로, 그리고에 anesthetised 동물의 커프 압력을 올립니다180 mmHg로에 커프 압력 ASE. 주 : 래트 anesthetised 혈압 120-140 mmHg의 범위 때 의식 160 mmHg로 상승한다. 정확한 압력에 도달하면 타이머와 발 온도 녹음을 시작. 참고 : 발 온도가 일정한 압력의 5 분 후 2 ° C에 의해 드롭해야한다. </li><li> 허혈에 걸쳐 동물의 &quot;무릎&quot;위의 커프의 위치를​​ 유지합니다. 커프 압력은 몇 분 후 드롭을 시작합니다, 또는 쥐의 사지는 이동합니다. </li><li> 반복적으로 펌핑의 원하는 커프 압력 반복적 인 짧은 버스트를 유지하기 위해 짧은 버스트로 인플레이션 전구 펌프 </li><li> 원격 허혈 5 분 내지 15 일 동안 연속적으로 전달 될 수있다. 허혈 재관류 프로토콜은 중간에 5 분 재관류 5 분 허혈이 기간을 포함한다. </li><li> 공기압 밸브를 풀어 커프 압을 수축. 허혈 프로 걸쳐 온도 변화를 확인로토콜. 커프를 놓습니다. </li><li> 부상 실험을 계속합니다. 마취의 영향 하에서 동물을 열 패드 상에 배치 될 필요가있다. 외래까지 동물을 모니터링하기 위해 계속합니다. 동물 산책 할 때까지 하우징에 반환 할 수 없습니다. </li></ol> 6. 가벼운 부상 - 망막 변성 모델 <ol><li> 다크 동물 하룻밤 (12 ~ 15 시간)을 적용. 즉시 원격 허혈 조절 또는 가짜 원격 허혈 (동물의 구속) 음식과 물과 방풍 하우징 장소 동물을 다음과 같습니다. </li><li> 24 시간 동안 오전 9시에 방풍 하우징 위에있는 형광등 (1,000 LUX)에 전환합니다. 빛 노출 후 7 일 동안 순환 조명을 어둡게하는 동물을 반환합니다. </li></ol> 7. 후 원격 허혈 절차 <ol><li> 전위도 (ERG)와 비전의 평가 : 참고 : ERG 설정 및 플래시 프로토콜은 Brandli 스톤 (26)을 따랐다. <ol><li> 다크 하룻밤 동물을 적용 (12 ~ 15 시간). 아래의붉은 조명이 케타민과 자일 라진의 복강 내 주사 (60 ㎎ / ㎏, 5 ㎎ / ㎏, 각각)에 의해 동물을 마취 차단하여주십시오. 동형 (아트로핀 황산염 1.0 %), 각막 마취 (proxymetacaine 0.5 %). </li><li> 각막 수화를 적용 (카보 머 폴리머) 눈은 각막 즉시 삭제합니다. 각막 수화를 유지하기 위해 20 분 간격으로 눈 겔을 적용한다. </li><li> 안정적인 에르그 녹음을 돕기 위해 안구 주위에 느슨하게 묶여 스레드를 그립니다. 직장 프로브를 사용하여 온도를 모니터링 및 37-37.5 ℃에서 동물의 체온을 유지한다. </li><li> Ganzfeld 적분 구 내부의 머리를 놓습니다. 참고 : Ganzfeld가 눈에 LED가에서 균일 한 오순절 깜박을 제공하는 완전히 프로그램 빛 자극이다. </li><li> 가볍게 각막 감동 주문품 4mm 백금 양극과 입에 삽입 2mm 직경 AG / AgCl을 펠릿 전극을 사용하여 전위도를 기록한다. 스테인리스 바늘에 양전극을 참조엉덩이에 피하 삽입. </li><li> 2 kHz의 수집 속도 0.3-1,000 Hz에서 (-3 dB)의 대역 통과 설정으로 녹음 신호 (AD 악기). 안정적인 에르그 녹음 녹음을 시작하기 전에 대상에게 10 분 어두운 적응에 동물을 설립 한 후. </li><li> 앞서 Brandli 스톤 (26)에 의해 설명 된 플래시 프로토콜을 따르십시오. <ol><li> 플래시 지속 시간을 프로그램 (우리는 깜박 기간이 1 ~ 2 밀리 초를 사용), 그리고 -4.4 로그 스코틀랜드 cd.sm -2 2.0에 자사의 강도를 설정합니다. 망막 기능을 측정하기 위해 밝은 플래시 (2.0 로그 스코틀랜드의 cd.sm -2, 1 MS)를 사용합니다. 본 연구에서는 제어, 빛 부상 RIP 빛 부상 사이의 비교입니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. TUNEL 분석 <ol><li> 페노바르비탈 과다 복용 (100 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사하여 동물을 안락사. 명백히하다 눈을 4 % 파라 포름 알데히드에 고정한다. </li><li> cyroprotecting 전에 PBS에 눈을 씻으십시오눈 하룻밤 자당 30 %에서 (W / V). 10월 화합물의 눈을 포함하고 저온 ​​유지 장치를 사용하여 20 μm의 시상 부분으로 잘라. </li><li> Maslim 등의 프로토콜 다음 DAPI 염색과 망막 섹션에 TUNEL 분석을 수행합니다. (27) </li><li> 망막의 TUNEL 카운트에 대한 형광 현미경을 사용합니다. TUNEL 세포는 외부 핵 층 (ONL)에서 기록되었다; 감광체 핵을 포함하는 망막의 최 외층. 본 연구에서는 TUNEL 수는 각 치료 그룹 (5) 눈으로, 각각의 눈에 대한 중으로 하였다. </li><li> 비교 통계 그룹에 일원 분산 분석을 사용하여 제어, 가벼운 부상, 가벼운 부상 + RIP 쥐의 의미합니다. </li></ol>

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설치류 뒷다리 허혈 성공적 수동 혈압계로 유도하고 망막 광 수용체에 신경 전달 커프 하였다. 가벼운 부상 9,28에서 광 수용체의 허혈성 조절에 의한 보호와 일치 발견. 기본적으로 원격 허혈 조직에 대한 간단한 산소 부족이 발생합니다. 따라서, 원격 허혈 양상은 허혈성 조절 또는 대안이라고 허혈 내성, 저산소 전처리, 어느 정도, 무산소 운동에 많은 유사점이있다. 세포 하나가 직접 신경을 제공 또는 후속 대사 스트레스 (13)의 허용이 될 세포에 영향을 미치는 단백질, 뉴 클레오 사이드 및 전사 인자의 큰 다양성을 해제하여 허혈성 도전에 응답합니다. 문헌에서, 원격 프로토콜 허혈 기간 및 주파수 범위를 포함했다. 우리 연구실은, 10, 5 테스트했습니다정상 망막 기능 (26)에 2 × 5 분 허혈 프로토콜. 이러한 프로토콜 중 2 ×...

대부분의 생존, 아마도 모든 대사 스트레스에 직면 조직 치사 허혈 1,2- 주기로 사전 조절함으로써 개선 될 수있다. 실용적인 측면에서 허혈 (IP)은 조직의 경험 등 후속 허혈성 모욕으로 더 심한 스트레스, 전 치사 허혈 조직의 노출이다. 동물 모델에서 IP는 뇌, 망막, 심장과 폐 3-6에 눈에 띄는 보호 기능을 제공합니다. 대응하여, 뇌졸중 환자에서 관찰은 이전 일과성 허혈 발작과 임상 결과 더 -7,8- 사이의 링크를 보였다. IP는 또한 비 허혈성 손상 (9)에서 망막 광 수용체를 보호합니다. 다양한 조직 및 부상의 IP의 효과는 모든 조직에 존재하는 세포 생존의 타고난 메커니즘을 활성화하는 것을 의미한다. 심근 허혈은 상향 조절을 통해 보호 효과가 제안되었다아데노신의 방출을 통해 또는 미토콘드리아 ATP 10,11 칼륨 채널의 개구를 통해 다수의 대사 경로를 조절하는 것으로 알려져 저산소증 유도 성 인자 (HIF)의. 아데노신 릴리스와 ATP의 칼륨 채널은 현재까지 허혈성 조절의 신경 메커니즘에 대한 연구가 안티 흥분 독성 (excitotoxicity), 항 세포 사멸 및 항 염증 경로 (12, 13)에 대한 수정에 초점을 맞추고있다, 뇌허혈에 연루되어 있지만. 전반적으로, 신경 세포를 보호하는 허혈성 컨디셔닝 분자 프로세스 이해가 제한된다. 원격 허혈 양상 시도는 덜 중요한 조직에 허혈을 생성하여 먼 매우 중요한 장기 (심장, 뇌, 폐)를 상태로. 뒷다리를 사용하여 원격 허혈 (RIP)은 뇌졸중 14-17의 설치류 모델에서 신경 것으로 입증되었다. 우리에 의해 기술 된 방법은 간단하고 신뢰할 수있는 비 침습적 PROT를 제공RIP를 유도 ocol. RIP 프로토콜의 대부분은 상부 뒷다리에 위치한 대퇴 동맥을 용이하게 식별 및 수술 클램핑 지혈대 애플리케이션에 액세스 할 수있는 것으로 추정하기 때문에, 뒷다리를 포함한다. 뇌 및 피부 보호의 연구 침습 사지 허혈 연구에서 허혈 사타구니 인대에서 대퇴 동맥을 분리하고 대퇴 동맥 2,15,18 클램핑에 의해 유도된다. 사지 중있는 절삭이나 대퇴 동맥 클램핑으로 인한 허혈은 펄스의 감소, 감소 산소화 및 피부 온도의 저하를 포함 사지에서의 변화에​​ 의해 확인되었다. 원격 허혈은 레이저 도플러 또는 도플러 초음파 17-19을 사용하여 펄스의 손실에 의해 확인 될 수있다. 피부 온도는 관계 20,21 비선형이지만 도플러 대안으로 사용될 수있다. 정확한 온도 기록은 실험실과 캔의 흔한쉽게 원격 허혈성 연구에 혼입 될 수있다. 수술을 클램핑하는 대퇴 대안 지혈대를 사용하여 허혈의 유도이다. 지혈대 응용 프로그램은 선박 클램핑 달성에 필적 허혈을 생산; Kutchner 등. 비 침습적 지혈대에 클램핑 침습 대퇴 동맥을 비교하고 두 방법 피변 허혈 (18)의 성형 모델 사지 혈류 감소 피부 손상을 중지하였습니다. 다리 또는 팔 하나를있는 절삭 및 수축기 혈압 위의 커프 압력을 제기하는 돼지와 인간 17,19,22 허혈성 손상에 대한 보호 것으로 밝혀졌다. 다른 지혈대는 허혈성 혈압 커프 또는 탄성 밴드 17,22,23의 사용을 포함 원격 유도에 접근한다. 그러나, 허혈을 유도하는 탄성 밴드를 사용하는 방법은 안전하지 않은, 압력의 비 조절 양에 잠재적으로 상승시켜주는500 mmHg의 이상 압력 상승과 사지는 인간 (24)에 기록된다. 또한, 탄성 밴드를 사용하지 허혈은 에반스 블루 염료, 근섬유 투과성 (25)의 생체 마커에 의해 평가로, 밴드 (23)의 제거 다음 쥐의 근육 손상으로 이어집니다. 대조적으로, 지혈대에 제어 압력의 전달은 혈압계 17,19,22,26 접속 혈압계를 사용하여 달성 될 수있다. 본 연구에서는, 감광체 변성 광 손상 모델은 원격 허혈의 신경 보호 효능을 입증하기 위해 사용되었다. 원격 허혈 가벼운 부상 직전 유도, 망막 기능 검사에 의해 확인으로 후속 광 수용체의 변성을 방지했다. 첨부 된 동영상은 비 침습 원격 허혈의 적용을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>골드 시리즈 DuraShock 핸드 아네로이드 혈압계</td><td>Welch Allyn</td><td>DS56</td><td>수동 혈압계</td></tr><tr><td>신생아 [사이즈 2] 튜브 1개, 10</td>팩 <td>Welch Allyn</td><td>5082-102-1</td><td>사지 혈압 커프</td></tr><tr><td>Luer 잠금 어댑터</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-178</td><td>신생아 커프</td></tr><tr><td>서미스터 포드</td><td>AD 기기</td><td>ML 309</td><td>피부 온도 단위</td></tr><tr><td>피부 온도 프로브</td><td>AD Instruments</td><td>MLT 422/A</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab, 4채널 수집 하드웨어</td><td>AD Instruments</td><td>PL 35044</td><td></td></tr><tr><td>유연한 프로브가 있는 동종 담요 시스템</td><td>Harvard Appartus</td><td>507222F</td><td></td></tr><tr><td>수건</td><td></td><td></td><td>옵션: 깨어 있는 원격 허혈</td></tr><tr><td>Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml)</td><td>Abbot Animal Health</td><td>05260-05</td><td>옵션: 흡입 마취 원격 허혈</td></tr><tr><td>케타밀 - 케타민 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>옵션: 주사 가능한 마취 원격 허혈</td></tr><tr><td>자일륨 - 자일라진 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>옵션: 주사 가능한 마취 원격 허혈</td></tr></tbody></table>

원격 사지 허혈 양상 : 설치류에 신경 기술

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

치사 허혈는 영향을받는 조직의 내생 적 메커니즘의 상향 조절을 통해 이후, 더 심한 허혈에 대한 조직을 보호합니다. 치사 허혈은 원격 조직에서 보호 메커니즘을 상향 조절하는 것으로 나타났다. 포유 동물의 뒷다리에 허혈 (5 ~ 10 분)의 짧은 기간은 뇌, 폐, 심장, 망막의 자기 보호 반응을 유도한다. 효과는 원격 허혈 (RIP)로 알려져있다. 이는 생명 유지 기관을 보호 유망한 치료 방법이며, 심장 및 뇌 손상에 대한 임상 실험하에 이미. 쥐의 특히 뒷다리 - - 허혈이 책은 사지를 만드는 제어, 최소 침습적 방법을 보여줍니다. 인간 신생아에서 사용하기 위해 개발 혈압계는 혈압 설명서에 접속 뒷다리의 상부 주위에 160 mmHg의 압력을 적용하기 위해 사용된다. 피부 온도를 검출하기위한 프로브는 ischemi을 확인하는 데 사용되는레그 동맥 압력 유도 폐색에 의한 피부 온도의 저하와 커프스의 방출을 따르는 온도 상승을 기록하여. RIP의이 방법은 밝은 빛에 의한 손상과 변성에 대한 쥐의 망막에 대한 보호를 제공한다.

160 mmHg의 위까지 상승 혈압 커프는도 1b에 명확히 본 뒷다리 혈액의 흐름을 정지. 조직의 산소의 부족은 허혈 재관류 프로토콜 (도 2)에 대한 동물의 발 온도를 감소시키는 결과. 발 온도 (33 ° C)는 커프 (32 ° C) 수축 할 때 상승 커프 압력 상승 (31 ℃)시 코어 온도보다 낮은 안정적으로 감소했다. 단일 1,000 룩스 빛 부상은 또는 원격 허혈없이 흰둥이 쥐를 제기 어두워 전달했다. 망막 함수는 기록 전위도 (ERG)를 사용하여 평가 하였다. Light 미사용 후도 3에 도시 된 바와 같이 ERG 광 자극에 대한 망막의 내부 및 외부로부터 발생하는 신경 세포의 전기 응답의 합이다. ERG 파형 phototransduction 인한 초기 네거티브 피크를 갖는 (최소 약 10 밀리T 플래시) 약 빛 플래시 후 80 밀리 초)이 B 파를 라 파 및 내부 망막 (최대...

원격 허혈 (RIP)의 손상 스트레스에 대한 조절 조직의 방법이다. 우리는 5-10 분간 혈압계 커프를 팽창하여, 뒷다리에서 원격 허혈 방법을 확립했다. RIP의 신경 보호 기능은 설치류에서 망막 변성의 모델에서 입증되고있다.

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

이 절차의 전반적인 목표는 뒷다리에 허혈을 전달하여 후속 스트레스에 대항하여 원격 조직을 조절하는 것입니다. 예를 들어, 가벼운 부상에 대한 망막. 이것은 먼저 수동 Ingle mom 압력계를 교정하여 수행됩니다.다음으로, 동물을 마취하고 가열 패드에 놓습니다. 그런 다음 동물의 뒷다리를 펴고 커프를 제자리에 놓습니다. 마지막으로, 원격 허혈은 펌프로 커프를 팽창시키고 커프를 수축시킨 다음 이 과정을 두 번째로 반복하여 수행됩니다.궁극적으로, 가벼운 손상 전에 적용하면 원격 허혈을 사용하여 망막 기능의 개선과 세포사멸을 겪는 광수용체의 수를 보여줍니다. 이 방법은 실시간 피부 온도 추적을 수행하기 위해 원격 허혈 전처리를 통해 자기 보호가 유도되는 방법과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 온도 기록 소프트웨어를 열고 온도 설정을 섭씨 30도에서 35도 사이로 조정하고 샘플링 빈도를 100-250-550g 쥐용 2 사이즈 신생아 팔 커프를 사용하여 100밀리초마다로 조정하고 필요한 경우 어댑터를 사용하여 커프를 FOME 압력계에 연결합니다.그런 다음 공기 방출 밸브를 느슨하게 하거나 어댑터에서 커프 튜브를 분리하여 커프의 공기를 빼냅니다. 튜브에 압력이 남아 있지 않고 압력계 바늘이 타원형 직사각형 내부에서 0에 놓여 있는지 확인합니다. 그런 다음 튜브, 압력계 및 기침 사이의 압력을 확인합니다.팽창 전구를 부드럽게 펌프하여 압력계가 100mg의 수은을 읽을 때까지 커프를 팽창시킵니다. 압력이 일정하게 유지되도록 한 후 어두워진 후 공기 배출 밸브를 천천히 열어 커프의 공기를 빼고 텍스트 프로토콜에 따라 동물을 적응시킵니다. 뒷다리 위쪽을 꼬집어 근육이 충분한지 확인하여 근육 긴장도가 좋은지 확인합니다.텍스트 프로토콜에 따라 동물을 진정시킨 후 다리를 뻗고 발 아래쪽의 피부를 꼬집어 마취 깊이를 확인합니다. 그런 다음 인공 눈물을 바르십시오. 쥐를 가열 패드 또는 순환 온수기 튜브에 엎드린 자세로 하지의 발 패드가 위를 향하도록 놓습니다.피부 온도 프로브를 적용하려면 허혈을 겪을 쥐의 다리를 뻗고 피부 프로브를 발 패드에 단단히 놓고 온도 프로브와 피부 사이의 접촉을 최대화하도록 배치합니다. 그런 다음 종이 테이프를 사용하여 프로브를 고정합니다. 1-2분 동안 온도 기록 소프트웨어에서 온도를 추적하여 피부 프로브 위치를 확인합니다.피부 온도가 섭씨 30도에서 34도 사이이고 안정적으로 유지되는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 프로브를 조정하여 원격 허혈을 수행하십시오. 수축된 커프부터 시작하여 공기 압력 밸브가 닫혀 있는지 확인하십시오.다리를 쭉 뻗고 뒷다리 위쪽의 커프를 느슨하게 감쌉니다. 집게손가락과 엄지손가락을 사용하여 다리를 펴고 아래쪽 손가락을 사용하여 느슨한 커프를 제자리에 유지합니다. 이제 커프 압력을 수은 160mm로 높입니다.올바른 압력에 도달하면 타이머와 발 온도 기록을 시작합니다. 발의 온도는 5분 동안 일정한 압력을 가한 후 섭씨 2도 떨어지고, 원하는 커프 압력을 유지하기 위해 팽창 전구를 짧은 시간 동안 반복적으로 펌핑하고 허혈 기간 동안 동물의 무릎 위에 커프의 위치를 유지해야 합니다. 5분 동안 원격 허혈을 지속적으로 전달합니다.그런 다음 원격 허혈을 반복하기 전에 5분 동안 재관류를 위해 공기 압력 밸브를 해제합니다. 절차가 완료되면 공기 압력 밸브를 풀어 커프 압력을 수축시킵니다. 허혈 프로토콜 과정 전반에 걸친 온도 변화를 확인합니다.그런 다음 커프를 풉니다. 동물을 발열 패드에 놓고 보행할 수 있을 때까지 계속 모니터링합니다. 동물이 걸을 때 집으로 돌려 주십시오.마지막으로 가벼운 부상을 수행하고 터널 분석을 수행합니다. 여기에서 명확하게 볼 수 있는 텍스트 프로토콜에 따르면 수은 수치가 160mm 이상으로 높아진 무릎 위에 배치된 혈압 커프는 뒷다리로 가는 혈류를 멈춥니다. 혈류의 부족으로 인해 발 온도가 동물의 중심 온도보다 낮게 떨어졌고, 이는 커프가 수축된 후 RIP에 필요한 상태와 일치하게 상승했습니다.이 그림에서, 정상적인 어둡게 자란 쥐의 어둡게 적응된 전기 망막 그래프 또는 ERG는 광 손상 1주일 후 밝은 섬광에 대해 큰 광수용체와 내부 망막 반응을 보였습니다. ERG 기록은 대조군에 비해 진폭이 심각하게 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 광수용체의 손실을 반영하지만, 허혈이 광수용체를 광 손상으로부터 보호하기 직전에 2 x 5분의 재관류 프로토콜을 사용하여 허혈로 뒷다리를 사전 조절했습니다. 이 패널은 R-I-P-E-R-G 진폭이 A파가 약간 감소하여 광 손상만 있는 것보다 더 크다는 것을 보여줍니다.마지막으로, 무릎 아래에 위치한 커프는 여기에서 볼 수 있는 감소된 ERG 진폭에 반영된 것처럼 광 손상으로부터 광수용체를 보호하지 않습니다. 내인성 신경 보호의 메커니즘이 무엇인지, 중추신경계 손상 및 퇴행으로 인한 기능을 개선하기 위해 원격 허혈을 어떻게 적용할 수 있는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 원격 허혈 전조절과 같은 방법을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

일방적 hindlimb의 국소 빈혈의 유도에 대한 수술은 레이저 도플러 재관류 이미징에 의해 국소 빈혈의 확인과 증명합니다.

Hindlimb 국소 빈혈의 Murine 모델

증거가 축적되고, 그 허혈 (PC) - 뇌에 대한 비 손상 허혈성 도전 - 후속 손상 허혈성 모욕을 과도 전압 보호 기능을 부여. 우리는 C57BL6 / J 생쥐의 일시적인 국소 대뇌 허혈 (중간 대뇌 동맥 폐색, MCAO에 의한)에 초기 허혈 내성 (IT) 유도 컨디셔닝 자극으로 양측 경동맥 폐색 (BCCAO)를 설립했다.

초점 대뇌 국소 빈혈에 조기 허혈성 공차를 유도하기 위해 적절한 전처리 자극으로 양측 경동맥 동맥 폐색

출처: Zheng, Y., et al. 뇌허혈에 대한 산성 사후 조절의 신경 보호를 연구하기 위한 실험 모델. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 중대뇌동맥폐색(MCAO)의 마우스 모델에서 허혈성 손상에 대한 신경 보호 효과를 평가하기 위해 산성 사후 컨디셔닝(APC)의 적용을 보여줍니다. MCAO 모델에서 재관류와 관련된 단계와 흥분 독성, 산화 스트레스 및 신경 사멸을 완화하기 위한 재관류 중 APC의 적용을 간략하게 설명합니다.

 뇌허혈의 마우스 모델에서 산성 사후 컨디셔닝의 신경 보호 효과 평가

출처: Poinsatte, K., et al., 마우스의 반복적인 저산소 전처리 및 일시적인 중대뇌 동맥 폐색에 따른 신경혈관 보호의 정량화. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 허혈성 뇌졸중을 유발하기 전에 제어된 저산소증 주기에 마우스를 노출시켜 반복적인 저산소 전처리(RHP) 방법을 보여줍니다. 이 실험은 혈액-뇌 장벽 안정성, 신경 적응 및 염증에 미치는 영향을 평가합니다.

마우스의 반복적 저산소 전처리에 대한 신경 적응

출처: Brandli, A. 원격 사지 허혈 전처리: 설치류의 신경 보호 기술. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 전신 신경 보호를 유도하기 위한 쥐의 비침습적 사지 허혈 전처리 프로토콜을 보여줍니다. 이 절차에는 제어된 동맥 폐색 및 재관류가 포함되며, 보호 인자를 방출하는 세포 스트레스 경로를 유발합니다. 이러한 요인은 뇌 및 망막과 같은 원격 기관의 허혈성 및 대사 손상에 대한 저항력을 향상시킵니다.

신경 보호를 위한 쥐 모델의 비침습적 사지 허혈 전처리

망막전위도(ERG)는 빛에 반응하여 망막에서 생성되는 전위입니다. 이 논문은 어둡게 적응한 쥐에서 ERG를 사용하여 망막 기능을 평가하는 방법과 신경 보호 중재(현재의 경우 원격 허혈 전조건)를 평가하는 데 ERG를 사용할 수 있는 방법을 설명합니다.

쥐 망막 및 원격 사지 허혈 양상의 보호 효과에 기능을 평가하기 위해 전위도를 사용하여

이 프로토콜은 마우스의 일시적인 중대뇌동맥 폐색 후 경색 부피와 혈액-뇌 장벽 파괴를 감소시키는 반복적인 저산소증 전조건화 또는 전신 저산소증에 대한 짧은 노출을 설명합니다. 또한 신경혈관 보호의 효능을 평가하기 위해 뇌졸중 후 경색 용적과 혈액-뇌 장벽 파괴의 이중 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

고립된 쥐 심장은 허혈 재관류 손상에 대한 지속적인 모델입니다. 여기에서는 허혈성 모욕의 정도를 확인하기 위해 제자리 대동맥 삽  관술, 심장의 Langendorff 관류, 시뮬레이션된 허혈-재관류 손상 및 경색 염색을 통해 쥐에서 박동하는 심장을 채취하는 과정을 설명합니다.

랑겐 돌프 - 관류 쥐 마음에 유도 및 허혈 - 재관류 손상의 평가

마우스에서 뒷다리 허혈의 외과적 유도는 혈관 신생을 검사하는 데 유용하지만, 현저한 허혈 유발 조직 괴사를 나타내는 특정 근친 마우스 균주에서는 손상됩니다. 점진적인 동맥 폐색의 유도를 통해 이 문제를 회피하기 위해 아메로이드 수축기를 사용하여 아급성 사지 허혈을 유도하는 방법이 설명되어 있습니다.

급성 및 아 급성 쥐 뒷다리 국소 빈혈하는 방법

산성 후 조절은 뇌 허혈을 예방합니다. 여기서는 APC를 실행하는 두 가지 모델을 제시합니다. 이들은 시험 관내에서 산소 - 글루코스 부족 후에 산성 버퍼 corticostriatal 슬라이스를 전달함으로써 생체 내에서 중간 대뇌 동맥 폐색 후 20 % CO 2 흡입에 의해 각각 달성된다.

대뇌 허혈에 대한 산성 후행 조절의 신경 보호를 연구하기위한 실험 모델

이 프로토콜은 쥐에서 무릎 아래 절단을 수행하는 방법과 즉시 표적 근육 재신경 운동(iTMR)을 수행하여 절단 관련 통증 치료 및 예방 전략을 조사하고 절단과 관련된 통증 메커니즘을 더 잘 이해하기 위한 방법을 시연합니다.

쥐 무릎 아래 절단 모델 및 즉각적인 표적 근육 재신경

배우세요 쥐 후지 허혈을 이용한 원격 허혈 전처리법으로 망막을 광 손상으로부터 보호하는 방법을. 이 기술은 내인성 신경보호 메커니즘 연구에 활용됩니다.

원격 사지 허혈 양상 : 설치류에 신경 기술

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