대뇌 허혈에 대한 산성 후행 조절의 신경 보호를 연구하기위한 실험 모델

중대뇌동맥 폐색 모델에서 코르티코 선조체 절편 모델에서 산증 치료의 전반적인 목표는 뇌허혈에 대한 산성 후조절의 신경 보호 효과를 연구하는 것입니다. 이 방법은 산증 후조절이 허혈성 뇌 손상을 어떻게 보호할 수 있는지에 대한 주요 질문에 답하고 뇌졸중 치료를 위한 새로운 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 널리 사용 가능한 실험 모델을 사용하여 산증 후조건화의 신경 보호를 연구할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Yarong Zheng입니다. 먼저 얇은 주걱으로 목이 잘린 쥐의 두개골에서 뇌를 꺼내 5%의 이산화탄소와 95%의 산소로 평형을 이루는 얼음처럼 차가운 일반 ACSF가 들어 있는 비커에 조심스럽게 떨어뜨립니다. cryoprecipitate 접착제를 두 개의 스트립으로 vibratone 플레이트에 도포합니다.

뇌를 지지하기 위해 칼날에서 가장 먼 접착제 스트립에 3% 아가로스 조각을 놓습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 뇌를 여과지로 옮깁니다. 칼날로 전두엽과 소뇌를 잘라냅니다.

뇌가 아가로스에 기대어 있는 상태에서 자유로운 접착제 스트립에 뇌 조직을 수직으로 놓습니다. 절단 저장소에 얼음처럼 차가운 ACSF를 추가하여 뇌를 담그고 얼음 홀더 영역에 얼음을 추가합니다. ACSF를 5%의 이산화탄소와 95%의 산소로 거품을 일으킨 저장고에 보관하십시오.

400미크론 단면을 절단하도록 비브라톤을 설정하고 절단 날을 기준으로 뇌를 올바르게 배치한 후 시작-정지 버튼을 눌러 자동 절단을 시작합니다. 끝이 잘린 파스퇴르 피펫을 사용하여 5개의 뇌 조각을 하나씩 옮기고 5%의 이산화탄소와 95%의 산소로 거품이 일고 얼음처럼 차가운 일반 ACSF의 조직 홀더에 넣습니다. 실온에서 30분 후 뇌 조각을 섭씨 37도의 수조에 10분 동안 넣어 시냅스 기능을 회복합니다.

포도당이 없는 ACSF와 산성 ACSF를 섭씨 37도의 수조에 넣고 각각 5%의 이산화탄소와 95%의 질소, 20%의 이산화탄소와 80%의 산소로 용액을 30분 동안 거품을 냅니다. 5개의 뇌 절편 중 4개를 예열된 섭씨 37도의 포도당이 없는 ACSF에 조심스럽게 옮기고 15분 동안 배양합니다. 산성 전조절의 시간 창을 연구하려면 한 슬라이스를 포도당 프리 ACSF에서 산성 ACSF로 직접 옮기고 다른 세 슬라이스를 재관류를 위해 일반 ACSF로 옮깁니다.

3분 후 산성 ACSF에 넣은 슬라이스를 일반 ACSF로 옮깁니다. 그런 다음 일반 ACSF에서 5분 후 일반 ACSF의 슬라이스 중 하나를 산성 ACSF의 조직 홀더로 3분 동안 옮깁니다. 재관류 15분 후 동일한 방식으로 다른 슬라이스를 옮깁니다.

무포도당 ACSF에 넣었지만 산성 ACSF에 넣지 않은 나머지 슬라이스는 산소 포도당 결핍 그룹으로 설정되었습니다. ACSF의 슬라이스를 TTC 용액이 포함된 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 용액의 슬라이스를 늘립니다.

그런 다음 섭씨 37도의 얕은 수조에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 호일로 덮인 깨끗하고 무게가 가벼워진 1.5ml 원심분리기 튜브에 조각을 옮기고 조각의 건조 중량을 측정합니다. 칭량 후, 에탄올과 디메틸 설폭 사이드의 1 대 1 용액을 10 : 1의 부피 대 중량 비율로 튜브에 첨가하여 Formazan을 추출합니다.

24시간 동안 빛을 피해 부화합니다. 다음날 에탄올 디메틸 설폭사이드 용액을 튜브에서 96 웰 플레이트로 옮기고 플레이트 리더를 사용하여 490나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 먼저 발가락 핀치 반사가 없는지 적절한 마취를 확인합니다.

그런 다음 두개골에 LDF 프로브가 부착된 마취된 마우스를 누운 자세로 놓고 멸균 면사를 사용하여 고정합니다. 면도한 목 피부를 75% 에틸 알코올로 소독합니다. 그런 다음 목의 정중 피부 주위 절개 후 뭉툭하게 집게로 연조직을 절개하여 혈관을 노출시킵니다.

노출된 조직에 식염수 한 방울을 떨어뜨려 수분을 유지한다. 다음으로, 안과 겸자를 사용하여 주변 조직과 미주 신경에서 총경동맥을 절개합니다. 미주신경이 손상되지 않도록 주의한다.

총경동맥의 원위부 끝에 마이크로 혈관 클램프를 놓습니다. 그리고 근위 끝에 6-0 실크 봉합사로 죽은 매듭을 묶습니다. 그런 다음 임시 봉합사로 클램프 근위부에 느슨한 매듭을 묶습니다.

다음으로, 마이크로 안과 가위를 사용하여 두 매듭 사이를 가능한 한 죽은 매듭에 가깝게 작은 세로 절개를 만듭니다. 이제 절개 부위를 통해 12mm의 무딘 모노필라멘트를 동맥 내강에 삽입하고 몇 밀리미터 전진시킵니다. 모노필라멘트 끝 부분의 느슨한 매듭을 조인 다음 클램프를 제거합니다.

그런 다음 안과 겸자를 사용하여 LDF 소프트웨어가 혈류의 급격한 감소를 보일 때까지 필라멘트를 내부 경동맥으로 전진시킵니다. 오클루젼 시작 시간을 기록합니다. 그런 다음 LDF 프로브를 절단하고 마우스를 섭씨 30도의 인큐베이터에 1시간 동안 폐색합니다.

폐색이 시작된 후 55분 후에 동물을 이소플루란으로 재마취하고 이전과 같이 동물을 위치시킵니다. 그런 다음 목 절개 부위를 열고 총경동맥을 다시 노출시킵니다. 폐색 기간이 지나면 안과 겸자를 사용하여 필라멘트를 부드럽게 당겨 재관류를 달성합니다.

그런 다음 매듭을 조여 임시 봉합사를 영구적인 봉합사로 바꿉니다. 산증 치료를 위해 콧방울로 흡입한 가스를 5분 동안 이산화탄소 20%, 산소 20%, 질소 60%로 변경합니다. 중단된 외과적 봉합사로 절개 부위를 봉합한 후 마우스가 의식을 회복할 때까지 섭씨 30도의 가열된 케이지에 마우스를 넣습니다.

이 히스토그램은 이 비디오에서 입증된 바와 같이 산소, 포도당 결핍 및 산성 사후 조건화 후 피질 절편에 대해 수행된 TTC 분석의 결과를 보여줍니다. 산증 치료 3분은 즉시 치료를 시작하거나 산소 포도당 결핍 후 5분 후에 치료를 시작한 경우 신경 보호 효과가 있었지만, 절편을 15분 동안 재관류한 경우에는 그렇지 않았다. 생쥐를 60분 동안 중대뇌동맥 폐색하고 재관류 후 5분, 50분 또는 100분에 5분 동안 20%의 이산화탄소를 흡입하여 치료했습니다.

경색 부피는 검은색 점선으로 표시된 대로 재관류 후 24시간 후에 2, 3, 5개의 트리페닐테트라졸륨 염산염 염색으로 정량화했습니다. 이 히스토그램은 각 질환에 대한 경색 용적의 백분율을 보여줍니다. 산성 후조절(postconditioning)로부터 신경 보호는 재관류 후 시작 시간이 50분으로 지연된 경우에도 강력했습니다.

그러나 100분에 시작된 산증 치료는 허혈성 손상을 차단하지 못했습니다. 비디오를 시청한 후에는 뇌 절편의 OGD 모델과 마우스의 MSO 모델에서 산증 후조절의 신경 보호를 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시술을 시도하는 동안 산증의 연장과 지속 기간이 보호 효과를 재현하는 데 매우 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.