깨어 쥐의 구강 내 Tastant 관리하는 동안 빠른 스캔 순환 전압 전류 법으로 빠른 도파민 역학 시험

이 절차의 전반적인 목표는 구강 맛이 밀집된 것에 대한 초 미만의 도파민 반응을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 수술 절차에 필요한 구강 카테터, 참조 전극 및 탄소 섬유 전극을 만들고 이후 고속 스캔 순환 V 원격 측정을 통해 기록함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 구강 카테터, 두개내 전극 및 탄소 섬유 전극용 가이드 캐뉼러를 외과적으로 이식하는 것입니다.

일주일 후, 탄소 섬유 마이크로 전극을 측좌핵 내로 내려 맛의 구강 내 전달에 대한 반응으로 세포 외 도파민 방출의 변화를 기록할 수 있습니다. 기록 후 마지막 단계는 전극을 보정하고 주성분 분석을 사용하여 도파민에 대한 정보가 포함된 데이터를 분리하는 것입니다. 궁극적으로, 구강 내 맛 및 전달과 빠른 스캔 순환 볼륨 원격 측정의 결합된 사용은 테이튼에 대한 1초 미만의 도파민 반응의 변화를 보여주는 데 사용됩니다.

이 결합된 기술에는 기존 방법에 비해 두 가지 주요 이점이 있습니다. 첫째, 고속 IC 측광법은 높은 시간 분해능을 가지며 두 번째로 타텐의 구강 내 전달은 쥐가 타틴을 얻기 위해 수행해야 하는 움직임을 최소화하고 타틴에 대한 도파민 반응을 더 잘 분리할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 구강 카테터 제작에 어려움을 겪을 것입니다.

그러나 우수한 유급 구강 카테터를 제작하면 카테터가 뺨과 위쪽 어금니 사이에 꼭 맞도록 보장하고 성공적인 실험의 가능성을 높일 수 있습니다. 기록 전극을 준비하기 위해 먼저 7미크론 직경의 T 6 50 탄소 섬유를 내경이 0.4mm인 붕규산염 유리 모세관에 흡인합니다. 다음으로, 모세관을 수직 전극 극성에 배치하고 히터를 55.0으로 설정하고 자석을 끈 상태에서 먼저 당긴 다음 필요에 따라 조정합니다.

피펫을 현미경으로 당긴 후 노출된 탄소 섬유를 잘라 유리 너머로 75-100미크론 확장되도록 합니다. 유리의 섬유는 단단히 밀봉되어야 하며, 그렇지 않으면 제제를 폐기하십시오. 다음으로, 3인치 30게이지 와이어의 절반에서 절연체를 벗겨내고 열 수축을 적용하여 전극을 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다.

그런 다음 페인트가 아직 젖어 있는 동안 와이어에 은색 페인트를 얇게 바르십시오. 전극의 열린 쪽 끝에 와이어를 삽입하고 그 안의 탄소 섬유에 부착합니다. 현미경으로 이 접촉을 확인하십시오.

마이크로 매니퓰레이터의 전극을 잡고 열수축으로 고정합니다. 준비된 탄소 섬유 전극을 IPA에 최소 10분 동안 놓아 전극 표면을 청소하고 도파민에 대한 후속 민감도를 높입니다. IPA에서 전극을 제거한 후 탄소 섬유를 수돗물로 헹구어 IPA를 제거합니다.

다음으로, 0.4mm 직경의 6mm 은, 염화은 메쉬가 있는 13mm 은선에서 기준 전극을 준비하고 와이어의 맞물림이 없는 부분을 잘라내고 금핀에 납땜합니다. 그런 다음 땜납에 에폭시를 바르십시오. 그런 다음 메쉬 부분을 공중 합체산에 5 번 담그십시오.

마지막 담금 후 담글 사이에 공기 중에서 30분 동안 건조시킵니다. 밤새 자연 건조시키십시오. 다음 날.

와이어의 메쉬 부분을 섭씨 120도에서 한 시간 동안 굽습니다. 구강 카테터를 먼저 절단합니다. 폴리에틸렌 100 튜브를 6cm 세그먼트로 나눕니다.

그런 다음 끝을 녹이고 디스크 중앙의 평평하고 시원한 표면에 눌러 튜브 세그먼트 중 하나에 작은 평평한 디스크를 만듭니다. 18 게이지 바늘을 사용하여 구멍을 만듭니다. 튜브 세그먼트의 다른 쪽 끝을 18 게이지 바늘의 뭉툭한 끝에 부착합니다.

그런 다음 구멍 펀처를 사용하여 직경 6mm, 두께 3.18mm의 폴리테트라플루오로에틸렌 조각을 여러 개 만듭니다. 그런 다음 이 디스크의 중앙에 구멍을 만들어 디스크를 와셔로 만듭니다. 어금니 이식 중에 와셔를 고정하는 데 도움이 되도록 와셔를 사다리꼴 모양으로 자릅니다.

카테터를 완성하려면 PE 튜브에 부착된 바늘을 와셔를 통해 완전히 밀어 넣고 와셔를 튜브와 같은 높이로 밀어 넣습니다. 다음 프로토콜은 완료하는 데 약 75분이 걸립니다. 수술 준비를 한 쥐부터 시작하여 면봉을 사용하여 입을 벌립니다.

그런 다음 캐뉼라의 바늘을 뺨과 첫 번째 위쪽 어금니 사이의 조직으로 밀어 넣어 바늘이 귀 바로 뒤와 내측으로 나오도록 합니다. 그런 다음 캐뉼라 위로 이동하고 와셔를 어금니에 고정하여 노출된 바늘에 카테터를 고정합니다. 와셔를 밀어 절개 부위에 단단히 고정합니다.

이 와셔를 제자리에 고정하십시오. 튜브를 다듬어 쥐의 머리 위로 2-4cm 높이의 노출이 유지되도록 합니다. 그런 다음 같은 기술을 사용하여 입 반대쪽에 카테터를 삽입한다.

그런 다음 쥐를 입체 액자에 넣고 캐뉼라와 전극을 위한 세 개의 구멍을 뚫어 측좌핵 코어 위치에서 녹음을 만듭니다. 가이드 캐뉼라는 전방 1.2mm, 1.4mm입니다. 외측 토레마.

플라스틱 바닥이 두개골과 같은 높이가 될 때까지 캐뉼라 장치를 내립니다. 기준 전극을 가이드 캐뉼라와 반대쪽 반구에 놓습니다. 기준선을 경막보다 약 2mm 아래로 내립니다.

그런 다음 자극 전극을 5.2mm 후방, 1.0mm 외측 토레마를 배치합니다. 복부 피개 영역을 표적으로 합니다. 자극 전극을 경막 아래로 8.0mm 내립니다.

그런 다음 나사와 시멘트로 구성 요소를 고정하고 수술 후 관리를 제공합니다. 실험을 수행하기 전에 항상 200 마이크로 리터의 물을 주입하여 구강 캐뉼라의 개통성을 확인하고 쥐가 물을 맛보고 더미 캐뉼라를 제거하고 50 % 헤파린 두 방울을 첨가 한 다음 부드럽게 위치를 변경하여 기록 부위를 지우십시오. 더미는 기록 위치에서 2mm 이내에 있지 않아야 합니다.

이제 VTA에 이식된 자극기에 헤드 스테이지를 부착하고 안정화한 다음 기록 전극을 측좌핵 코어로 내립니다. 이제 텍스트 프로토콜에 따라 학습 데이터 세트를 생성합니다. 항상 최소 2분을 기다리지만 자극 사이에 최대 4-5분을 기다려 수포 재장전을 허용하고 해야 합니다.

실험에서 가장 중요한 단계는 고품질 전극을 얻는 것입니다. 배경이 특징적인 경우 상승 상에 둥근 모양이 좋은 전극입니다. 둥근 모양이 작거나 적용된 파형과 밀접하게 일치하면 다른 전극을 사용해 보십시오.

배경이 이동된 위치가 바로 있는 경우 적용된 파형에 0.1V 단위로 양의 방향으로 오프셋 이동을 적용합니다. 기록 현장에서 교육 세트가 생성되면 1-3분마다 200마이크로리터의 테이텐 볼루스를 주입하여 25회 주입하면서 데이터를 수집합니다. 그런 다음 30분 이상 기다렸다가 같은 방식으로 다음 맛을 주입합니다.

구강 내 카테터 이식과 결합된 FSCV는 타텐의 최대 AIT가 타텐 주입 전에 핵 아컴벤스 코어에서 위상 도파민 방출을 조절하는 방법을 조사하는 데 사용되었으며, VTA의 빨간색 막대로 표시된 전기 자극은 훈련 세트를 획득한 후 핵 측좌 코어에서 위상 도파민 방출의 강력한 증가를 생성했습니다. 흰색 화살표로 표시되는 전류입니다. 이것은 도파민의 산화 전위에서 발생했으며, 이는 흰색 대시선으로 표시되어 데이터를 농도 대 시간 플롯으로 변환합니다. PCA가 맛에 반응하여 증가 된 전류가 도파민 농도 증가의 결과임을 확인한 후.

또 다른 타틴 멘톨은 측좌핵 코어에서 FSCV 기록 중에 주입되었으며, 멘톨 주입 후 도파민 농도 증가도 관찰되었으며, 일단 마스터되면 구강 내 및 캐뉼레이션 복합 수술을 75분 안에 수행할 수 있습니다. 이 기술은 경쟁적이고 혐오스러운 파블로프식 및 오페라 조건화와 같은 다른 형태의 행동과 결합하여 이러한 과정에서 도파민 미만 신호에 대한 질문에 답할 수 있습니다.