Name: 흰쥐의 나이브 설탕과 지방 섭취에 따라 변연계와 Mesocortical 도파민 보상 사이트에서 C-에 Fos 활성화의 동시 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 학습하세요 흰쥐에서 지방과 설탕 섭취 후 변연계 및 중피질 도파민 경로에서 c-Fos 활성화를 면역조직화학적으로 동시 검출하는 방법입니다. 이 기법은 보상 신경생물학 및 동기 부여 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트에 자신의 노력에 대한 다이애나 이카 - Culaki, 크리스탈 샘슨과 신학 Theologia Karagiorgis 감사합니다.

이 실험 프로토콜은 모든 주제 및 절차는 국가 관리를위한 건강 가이드의 연구소 및 실험 동물의 사용을 준수하고 있음을 인증 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 주제 <ol><li> 구매 및 / 또는 번식 수컷 흰쥐 (260~300g). </li><li> 개별적으로 와이어 메쉬 케이지 하우스 쥐. 쥐 차우와 물 사용 가능한 광고 무제한와 12시 12분 시간 빛 / 어둠주기를 유지한다. </li><li> 적절한 샘플 크기를 지정 (예를 들어, N ≈ 6-8) 무작위로 그룹으로. </li></ol> 2. 시험 장치 및 접수 절차 <ol><li> 고무 마개 보정 원심 관을 사용하여 45 ° 각도 금속 sipper 튜브 제시된 용액 (0.1 ml를 ±) 정확한 측정을 제공한다. 교정의 가시성을 허용하는 팽팽 금속 스프링에 의해 홈 케이지에 고정합니다. </li><li> ~ (식량 배급을 제한쥐의 15 / g / 일)는 해결책을 소비하는 의욕을 높일 원래 체중의 85 %의 무게를 감소시킨다. 참고 : 체중 감소는 3 사이에해야 - 오일. </li><li> 쥐가 짧은 (1 미만인 분) 대기 시간 후의 시험 용액을 샘플링 할 가능성을 최대화하기 위해 1 시간 세션 위에 4 일 동안 0.2 % 사카린 사전 훈련 용액 (10 ㎖)을 제공한다. </li><li> 몇 방울을 흘리고하여 원심 분리 관을 통해 흐름을 확인합니다. </li><li> 섭취량 측정을 획득하기 전에 각 세션 후 튜브의 무게를. </li><li> A) 물, b)는 새로운 맛 (0.05 % 체리 맛) 0.2 % 사카린, C) 8 % 과당, D) 8 : 흡기 여섯 솔루션 중 하나를 수신 하위 그룹의 다섯 번째 날에 시험 (10 ㎖, 1 시간)을 수행 % 글루코스, 예) 0.3 % 잔탄 검에 현탁하고 3.5 % 옥수수 오일, 및 F) 0.3 % 잔탄 검. </li><li> 영양 솔루션 isocaloric 있는지 확인; 따라서, 3.5 % 옥수수 오일 농도가 8 % 설탕 솔루션 isocaloric이다. </li><li> 일 확인짧은 대기 시간 (이하 1 분)와 쥐 샘플 솔루션에서. 이 요건이 충족되지 않으면, 연구 주제를 버린다. </li></ol> 3. 조직 준비 <ol><li> 각 시험 용액 초기 노출 후 90 분 펜토 바르 비탈의 복강 내 주사에 의해 각 동물을 마취. 동물이 제대로 동물이 더 이상 깊은 날개 자극에 떨고 직접 각막 압력 또는 머리를 다음 깜박 발 핀치에 철수 등의 반사에 응답임을 입증되지 의해 마취되어 있는지 확인합니다. </li><li> 이전 69 설명 된대로로 transcardially 각 동물을 관류. <ol><li> 나트륨 펜 토바 비탈 (65 ㎎ / ㎏)의 과다 복용으로 쥐를 마취, 흉곽을 제거하고 심장 (69)에 무료로 액세스를 위해 가슴을 노출. </li><li> 왼쪽 심장 판막의 정점에 바늘을 배치하고, 대정맥을 잘라. 인산염 완충 정착액 CO 다음 인산염 완충액 (PBS, ~ 180 ml)에 관리4 % 파라 포름 알데히드 (~ 180 ml)에 ntaining. </li><li> 동물이 실제로 액체는 코, 입, 생식기 영역과 같은 다른 공동을 떠나는 여부를 검사하여 올바르게 관류되고 있는지 확인합니다. 참고 : 파라 포름 알데히드와 적절한 고정은 큰 근육 운동을 동반한다. 이 발생하지 않으면, 반응이 일어날 때까지 바늘을 다시 조정한다. </li></ol></li><li> 빨리 떨어져 두개골에서 모피와 피부를 절단하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 균열 및 후면에서 전면으로 이동 뇌에서 뼈를 제거하는 rongeurs을 사용합니다. rongeur은 뼈와 수막 피아 교인 사이에 보장 아래와 소뇌 뒤에 지역에서 처음 작업. 두개골 상부 및 측면이 제거되고 나면,베이스의 뇌 리프트 작은 주걱을 사용하고, 작은 가위 뇌신경을 자르지. 뼈를 제거하는 동안 뇌 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 밤새 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액에 머리를 고정합니다.이들이 용기의 바닥에 침전 될 때까지 실온에서 30 % 수크로오스 / 70 % PBS 용액에 뇌를 놓는다. </li><li> 뇌 차단 <ol><li> 후각 망울에 횡 방향으로 꼬리를 절단 뇌의 주동이의 부분을 제거합니다. </li><li> 소뇌와 뇌교의 수준에서 횡 방향으로 절단 뇌의 꼬리 부분을 제거합니다. </li></ol></li><li> mPFC을 통해 슬라이딩 마이크로톰의 무대에 고정 된 꼬리 부분 coronally 뇌를 탑재, 절단 관상 섹션 (40 μm의) (2.86 - 브레 그마에 2.20 mm의 주동이)는 NAC 코어와 쉘과 등쪽 선조체 (+ 1.76-1.60 mm의 브레 그마에 주동이)는 AMY (-2.12 - 브레 그마에 -2.92 mm의 꼬리) 및 VTA (-5.20 - -5.60 mm의 꼬리 정수리하기). 지침은 쥐의 뇌지도 책 (70)를 사용합니다. </li><li> 최종 면역 조직 화학 분석 (71)에 대한 PBS로 가득 찬 24 웰 플레이트의 각 웰에 무료 부동 섹션을 수집합니다. 24 우리를 밀봉 파라 필름을 사용하여LL 플레이트는 PBS가 컨테이너에 증발 뇌를 건조하지 않도록합니다. 4 ° C가 뇌 조직을 저장합니다. </li></ol> 4. C-FOS 프로 시저 (71에서 적응) <ol><li> 5 % 정상 염소 혈청 5 ml의 0.2 % 트리톤 X-100을 PBS에 1 시간 동안 각 섹션을 처리합니다. </li><li> PBS 1 ㎖를 함유하는 웰에서 36 시간 동안 39 ° C에서 : 일차 항체로 처리 섹션 (5000 토끼 항 - C-FOS 1) 부화. </li><li> 린스 섹션을 10 분마다 PBS (5 ㎖)로 3 배. </li><li> 이차 항체와 인큐베이션 (오티 닐화 염소 항 - 토끼, 1 : 200)을 RT에서 2 시간 동안 PBS 1 ㎖를 함유하는 웰. </li><li> 10 분 각각 PBS의 각 섹션의 3 배 (5 ㎖)을 씻어. </li><li> PBS 5ml에 Avadin DH (100 μL) 및 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 바이오틴 H (100 μL)로 이루어진 세트에 제공 시판의 아비딘 - 고추 냉이 퍼 옥시 다제의 혼합물을 2 시간 세정 섹션을 인큐베이션. </li><li> 다시 씻어 ​​섹션은 PB에 3 배S 10 분마다 (5 mL)을 첨가 하였다. </li><li> DAB 용액 5 ㎖를 함유하는 웰에서의 조직의 반응성에 따라, 10 분 - 5 0.0015 %의 H 2 O (2)의 존재하에 0.05 %의 디아 미노 벤지딘 (DAB)가있는 부분을 반응한다. </li><li> 두 번에 라벨 VTA 섹션. 밤새 4 ° C에서 PBS (5 ㎖) : 티로신 수산화 (TH) 항체 (2,000 토끼 항 - 쥐 TH, 1)으로 그들을 품어. </li><li> 헹구고 섹션을 10 분마다 PBS (5 ㎖)로 3 배. </li><li> 이차 항체와 인큐베이션 (오티 닐화 염소 항 - 토끼, 1 : 200) PBS (5 ㎖)을 실온에서 2 시간 동안. </li><li> 헹구고 섹션을 10 분마다 PBS (5 ㎖)로 3 배. </li><li> 이차 항체 - 퍼 옥시 다제 복합체를 사용하여 항체를 시각화합니다. DAB / NiCl 용액 5 ㎖를 함유하는 웰에서의 조직의 반응에 따라, 10 분 - 5 0.05 % DAB의 조합 및 0.3 %의 황산 니켈 수용액으로 반응한다. </li><li> DAB 솔루션은 그것에서 컬러 우유 빛 녹색인지 확인0.3 %의 니켈과 황산의 반응. 용액이 너무 녹색 인 경우, 반응이 너무 어두운 것. </li><li> 젤라틴 코팅 슬라이드 상에 모든 섹션을 탑재합니다. 톨루엔 기반 솔루션 (TBS)의 몇 방울과 미끄럼 방지를 커버 한 다음 그들에게 건조 하룻밤을 보자,하고. </li><li> 실험 조건은 관찰자에 알 수 있도록 코드 슬라이드. </li></ol> C-FOS 5. 결​​정은 면역이 카운트 <ol><li> prelimbic mPFC, infralimbic mPFC, NAC 코어, NAC 쉘, 기저 AMY 핵, 중앙 cortico-중간 AMY, 등쪽 선조체 및 VTA : 관심이 영역 (ROI)에에 Fos 양성 신경 세포를 계산하는 공정한 관찰자의 쌍을 지정합니다. . C-에 Fos 면역이 TH +와 VTA에서 TH-세포의 존재 여부를 묘사 한 현미경에서 NAC의 화면 캡처 사진을 제공 그림. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53897/53897fig1.jpg" /> <stroNG&gt; C-FOS 카운트가 제작되어있는 그리드에 의해 윤곽이 관심 그림 1. 핵 중격 의지의 대표 제 (NAC) 표시 지역은. NAC 쉘은 NAC 코어에 내측 및 복부 발견된다. NAC 코어는 전방 접합면 둘러싼 (전방 통신을.). 측면 뇌실 (측면 통풍구.)의 복부 정도 볼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53897/53897fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="2"><li> 시험의 모든 조건에서 모든 동물에 공통적으로 사이트 당 적어도 세 개의 대표 조각을 분석합니다. </li><li> 개요 (도 1)를 추적하여 각 ROI 영역에 대한 전체를 분석하는 소프트웨어, 광학 현미경을 사용한다. <ol><li> 특정 사이트의 경우, 응용 프로그램을 열고 인수 드롭 다운 메뉴를 클릭하고 &quot;라이브 이미지&quot;를 클릭합니다. 포커스로 ROI를 가져와 기준점을 설정하는 화면을 클릭. 그런 다음 TR가이드로 격자를 사용하여 선택된 뇌 영역 에이스. 추적이 완료되면, 세포를 (- 5.3.1.3 5.3.1.1 단계) 계산합니다. <ol><li> 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭합니다. &quot;취득&quot;다음 &quot;라이브 이미지&quot;를 클릭, 메뉴 표시 줄로 이동합니다. 포커스로 ROI를 가져와 기준점을 설정하는 화면을 클릭. </li><li> 그리드 도구 모음에 가서는 &quot;그리드&quot;과 &quot;사용 그리드 라벨&quot;을 클릭합니다. 소정의 추적과 ROI를 설명합니다. </li><li> C-FOS 세포의 수를 유지하기 위해 왼쪽 사이드 바에서 &quot;+&quot;를 선택, 각각의 투자 수익 (ROI) 지역에 세포를 계산합니다. 카운트를 등록 단독으로 각 셀을 클릭합니다. 정의 된 어두운 빨간색 원은 (그림 1) 관찰 될 때 C-FOS에 대한 긍정적 인 셀을 고려하십시오. </li></ol></li><li> 각 사이트에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 레코드는 실험실 노트북 및 향후 분석을 위해 컴퓨터에서 계산합니다. 추적 및 수를 저장하기 위해 &quot;저장 데이터 파일&quot; &quot;파일&quot;을 클릭, 메뉴 표시 줄로 이동합니다. </li></올&gt; </li><li> 각 ROI의 각 섹션에 대해 두받지 평가자의 (계수의 상관 관계를 이용하여) 그 간 평가자의 신뢰성을 확인 항상 0.8를 초과합니다. </li></ol> 6. 통계 <ol><li> 일 1, 2, 3, 4 (69)의 당질 섭취를 비교 한 회 반복 측정을 변동 (ANOVA)의 1 방향 분석을 사용하여 처음 네 일 기준 사카린 섭취를 평가한다. </li><li> 무작위 블록 2 웨이 ANOVA 69를 사용하여 여섯 그룹의 테스트 섭취 (5 일)과 사카린 섭취량 (4 일)를 비교합니다. </li><li> 개별 심각한 영향 69을 결정하기 위해 Tukey에 비교 하였다 (p &lt;0.05)를 사용합니다. </li><li> 간 평가자의 신뢰성을 결정하고 공통 관찰자의 카운트를 사용한다. </li><li> 각 사이트 69 세 대표 조각의 평균 C-FOS 계산됩니다. <ol><li> 여섯 용액 (3.5 % 옥수수 오일, 8 % 글루코스, 과당 8 %, 0.2 %, 맛 사카린, XA의 섭취에 의해 유도 된 C-FOS 활성화의 1 웨이 ANOVA를 수행윤부 주위의 mPFC 69 nthan 껌 제어 및 물). </li><li> infralimbic mPFC, NAC 코어, NAC 쉘, 기저 AMY, 중앙 cortico-중간 AMY, VTA와 등쪽 선조체의 여섯 그룹의 반복 병렬 분석. 개별 심각한 영향 69을 나타 내기 위해 Tukey에 비교 하였다 (p &lt;0.05)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 그 현탁 제의 물 섭취량 및 섭취, 산탄 검 모두 옥수수 기름 섭취를 비교합니다. 물 섭취와 비 영양 감미료, 사카린의 섭취 모두 과당과 포도당 섭취를 비교합니다. </li><li> 사이트의 각 솔루션 섭취와 C-FOS 활성화 사이에 상당한 관계가 페로 니 r에 상관 관계 (P &lt;0.05)을 사용하여 관찰되었다 여부를 설정합니다. <ol><li> 체계적으로 3.5 % 옥수수 기름 그룹의 각 동물에 대한 윤부 주위와 infralimbic 사전 전두엽 피질에서 C-FOS 수를 비교합니다. </li><li> 여섯 사이트의 각 쌍의 체계적 병렬 분석을 반복 (VTA, 등쪽 선조체, infralimBIC mPFC, 윤부 주위의 mPFC 3.5 % 옥수수 기름, NAC 코어, NAC 쉘, 기저 AMY, 중앙 cortico-중간 AMY). </li><li> 다른 다섯 실험 흡입 조건 (8 % 포도당, 8 % 과당, 0.2 % 맛 사카린, 산탄 검 제어 및 물)에 대한이 여섯 사이트 체계적으로 병렬 분석을 반복합니다. </li></ol></li><li> 용액 상태 내에 동일 동물 솔루션간에 및 페로 니를 사용하여 각 용액에서 C-FOS 활성화 사이에 상당한 관계를 결정하여 전체 사이트를 평가 하였다는 사실을 활용은 상관 관계 (p &lt;0.05) r에. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

이 연구의 목적은 소스 (VTA)과 전뇌 투사 대상 DA 보상 관련 뉴런의 (NAC, AMY, mPFC)을 동시에 쥐의 지방과 설탕의 소설 섭취 후 활성화 된 경우 휴대 C-FOS 기술을 사용하여 결정하는 것이 었습니다 . 본 연구는 이전에 발표 된 연구 (69)의 프로토콜에 대한 상세한 설명이다. 그것은 VTA에서, prelimbic 및 infralimbic mPFC의 NAC의 핵심과 쉘과 기저 및 중앙 cortico-중간 AMY뿐만 아니라 등쪽 선조체에 주요 투사 영역이 분산 뇌 네트워크 (24)의 역할을 것이라고 가정했다 -27 및 디스플레이 코디 동시 FLI 글루코스 (8 %), 과당 (8 %), 또는 옥수수 기름 (3.5 %), 사카린 (0.2 %), 물 및 기타 제어 솔루션에 대한 해결책에 대하여 신규 흡기 다음. 옥수수 기름, 포도당과 과당,하지만 VTA의 prelimbic 및 infralimbic MP의 섭취 생산 상당한 및 차등 FLI 활성화를 사카린하...

뇌의 도파민 (DA)를 통해 맛이 설탕의 섭취 중앙 응답에 관련 된 제안 쾌락 1, 2, 3, 노력과 관련된 3과 행동의 4,5 메커니즘을 습관 기반. 이러한 효과에 연루 차 DA 경로는 복부 피개 영역 (VTA)에서 유래하고, 핵 중격 의지 (NAC) 코어와 쉘의 기저 및 중앙 cortico-내측 편도 (AMY) 및 prelimbic 및 infralimbic 중간에 프로젝트 전두엽 피질 (mPFC) (리뷰 6,7 참조). VTA는 자당 섭취 8,9에 연루되었으며, DA 릴리스는 NAC 10-15, AMY 16, 17 및 mPFC 18 ~ 20에 다음과 설탕 섭취를 관찰된다. 지방 섭취는 또한 DA NAC (21)를 해제 자극하고, 등쪽 선조체 (미상 - 피질)에 또 다른 DA-풍부한 투사 영역은 DA-매개 22, 23 먹이와 연결되었습니다. 켈리 24-27이 여러 프로젝트 제안이 DA-중재 시스템의 이온 영역은 광범위하고 친밀한 상호 28-34을 통해 통합과 상호 작용하는 분산 두뇌 네트워크를 형성했다. 당 35-37과 지방 38-40의 섭취를 줄일 DA D1 및 D2 수용체 길항 물질의 능력에 더하여, DA 시그널링은 당 및 조건부 맛 선호도를 생성하기 위해 지방 (CFP)의 기능을 매개에 관여 한 41- 46. NAC, AMY 또는 mPFC 47-49로 DA D1 수용체 길항제의 Microinjections는 위장 내 포도당에 의해 유도 CFP 취득을 제거한다. mPFC에 DA D1이나 D2 중 하나 수용체 길항제의 microinjections은 과당 CFP (50)의 획득을 제거하는 반면, 인수 및 과당 CFP의 발현은 차등 NAC 및 AMY (51, 52)의 DA 길항제에 의해 차단된다. 는 C-FOS 기술 (53, 54)는 신경 activatio을 조사하기 위해 사용되어왔다n은 맛 섭취와 신경 활성화에 의해 유도. 용어 &quot;C-FOS 활성화&quot;원고 전반에 걸쳐 사용되며, 운영 체제는 신경 세포의 탈분극 동안 C-FOS를 증가 전사에 의해 정의된다. 자당 섭취는 NAC 55-57 중, VTA뿐만 아니라 쉘 아니라 코어 중앙 AMY 핵에 FOS 같은 면역 (FLI)를 증가. 가짜 먹이 쥐에서 자당 섭취하는 반면 크게 AMY와 NAC에 FLI 증가가 아닌 VTA (58), 위장 자당이나 포도당 주입 크게 NAC 및 AMY 59, 60의 중앙 및 기저 핵에 FLI 증가했다. 예약 차우 액세스 자당의 반복 첨가는 NAC 쉘 및 코어 (61)뿐만 아니라 mPFC에 FLI 증가했다. 수크로오스 농도 시프트 패러다임 가장 FLI 증가는 기저 AMY과 NAC 발생 밝혀 아닌 VTA 62. 다음은 에어컨, 설탕 관련 자연 rewa의 소멸번째 행동은 기저 AMY와 NAC (63)에 FLI 증가했다. 또한, 톤 페어링 설탕 여부는 이후 기저 AMY 64 FLI 수준을 증가 톤의 결과. 높은 지방 섭취는 NAC 및 mPFC 사이트 65-67에서 FLI 증가했다. 이전에 인용 된 연구의 대부분은 보상 관련 분산 뇌 네트워크 24-27의 식별에 대한 정보를 제공하지 않는 하나의 사이트에서 C-FOS 활성화에 설탕과 지방이 효과를 조사 하였다. 또한, 연구의 대부분은 또한 상대 (기저 및 중앙 cortico-중간) NAC (코어와 쉘), 에이미와 mPFC의 하위 영역의 기여를 서술하지 않았다 (prelimbic 및 infralimbic) 잠재적으로 검사 할 수있는 C-68에 Fos 매핑 우수한 공간적 단일 세포 분석을 이용. 우리의 실험실 (69)는 최근 VTA DA 경로와 그 프로에서 C-FOS 활성화와 동시에 측정 변경을 사용이 켜졌 영역 (NAC, AMY 및 mPFC) 쥐의 지방과 당분의 소설 섭취 후. 본 연구는 동시에 차등 NAC, AMY의 하위 영역에 FLI을 활성화할지 여부 급성 여섯 가지 솔루션에 노출 (옥수수 기름, 포도당, 과당, 사카린, 물, 지방 유제 제어) 분석 절차 및 방법 론적 단계에 대해 설명합니다, mPFC뿐만 아니라 등쪽 선조체. 차이점이 동시 검출에 각 사이트 및 결정에 FLI에 심각한 영향의 확인을 허용할지 여부함으로써 분산 뇌 네트워크 24-27에 대한 지원을 제공하는 관련 사이트의 변화와 상관 하나의 특정 사이트의 변화. 시험이 절차는 VTA의 prelimbic 및 infralimbic mPFC의 NAC의 핵심과 쉘, 그리고 기저 및 중앙 cortico-중간 AMY)뿐만 아니라 등쪽 선조체 여부를 조정 디스플레이 것이고, 구강, 무조건 섭취 후 동시 FLI 활성화 글루코스 (8 %), 과당 (8 %), 옥수수 기름 (3.5 %) 및 ​​사카린 (0.2 %) 용액.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley rats</td><td>Charles River Laboratories</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>Wire Mesh Cages</td><td>Lab Products, Seaford, DE</td><td>30-Cage rack</td><td></td></tr><tr><td>Rat Chow</td><td>PMI Nutrition International</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>Taut Metal Spring</td><td>Lab Products, Seaford, DE</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>쥐 체중</td>계 <td>Fisher Scientific Company</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 원심분리기 튜브</td><td>실험실 제품, Seaford, DE</td><td>10-0501</td><td></td></tr><tr><td>고무 마개</td><td>실험실 제품, Seaford, DE</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>금속 사이퍼</td><td>실험실 제품, Seaford, DE</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>사카린</td><td>시그마 화학 Co</td><td>82385-42-0</td><td></td></tr><tr><td>쿨에이드, 체리</td><td>Kool-Aid</td><td>상업용</td><td></td></tr><tr><td>Kool-Aid, Grape</td><td>Kool-Aid</td><td>상업용</td><td></td></tr><tr><td>과당</td><td>시그마 화학 Co</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마 화학 Co</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>Mazzola</td><td>상업용</td><td></td></tr><tr><td>Xanthan Gum</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>11138-66-2</td><td></td></tr><tr><td>슬라이딩 마이크로톰</td><td>Microm International</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Camera</td><td>MBF Bioscience</td><td>소프트웨어 애플리케이션</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 코팅 슬라이드</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>커버 글라스</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>골든 나일론 브러시</td><td>Loew-Cornell&nbsp;</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>내추럴 헤어 세이블&nbsp;</td><td>로우-코넬&nbsp;</td><td>2022</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>Fisher</td><td>Scientific 3527</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Fisher</td><td>Scientific 3506</td><td></td></tr><tr><td>1 L Pyrex 병</td><td>Fisher Scientific</td><td>1395-1L</td><td></td></tr><tr><td>티슈 인서트 (티슈 스트레이너)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7200214</td><td></td></tr><tr><td>Eagle pipettes&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>E10 for 1-10&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>독수리 피펫&nbsp;</td><td></td><td>20-100용 World Precision Instruments E100&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>독수리 피펫&nbsp;</td><td></td><td>50-200용 World Precision Instruments E200&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>독수리 피펫&nbsp;</td><td></td><td>100-1000을 위한 World Precision Instruments E1000&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>독수리 피펫&nbsp;</td><td></td><td>1000-5000을 위한 World Precision Instruments E5000&#956; 엘&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>유니버설 팁 .1-10 &#956; l</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500192</td><td></td></tr><tr><td>범용 팁 5-200 &# 956; l</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500194</td><td></td></tr><tr><td>범용 팁 500-5,000 &# 956; l</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500198</td><td></td></tr><tr><td>블레이드 Vibroslice 100</td><td>세계 정밀 기기</td><td>BLADE</td><td></td></tr><tr><td>DPX 마운팅 매체&nbsp;</td><td>전자 현미경&nbsp;</td><td>13510</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원심분리기 튜브</td><td>Biologix Research Co.</td><td>10-0501</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 박스</td><td>Biologix Research Co.</td><td>41-6100</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커&nbsp;</td><td>마델 코퍼레이션&nbsp; &nbsp;</td><td>ZD-9556</td><td></td></tr><tr><td>무게 보트&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>5ml 일회용 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-5AM</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 조사자 소프트웨어</td><td>마이크로 명시야</td><td>소프트웨어 응용 프로그램</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td><강>시약</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 과립</td><td>Fisher Scientific</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td><td>성 Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 디파식</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>수소 과산화물&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear II&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-044-192</td><td></td></tr><tr><td>메탄올&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>벡터</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 항토끼 IgG (H+L)</td><td>Vector</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>ABC 키트 과산화효소 표준</td><td>벡터</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-cFos (Ab-5) 토끼</td><td>EMD chem/Cal Biochem</td><td>PC38</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X 100</td><td>시그마알드리치</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>3,3' 디아미노벤지딘 테트라 하이드로클로라이드&nbsp;</td><td>SigmaAldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>SigmaAldrich</td><td>5881</td><td></td></tr><tr><td>1차 TH 항체</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Euthosol</td><td>Virbac AH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

흰쥐의 나이브 설탕과 지방 섭취에 따라 변연계와 mesocortical 도파민 보상 사이트에서 c-에 fos 활성화의 동시 검출

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

이 연구는 쥐의 뇌의 도파민 (DA) 경로에 지방과 설탕의 소설 섭취의 효과를 평가하기 위해 휴대 C-FOS 활성화를 사용합니다. 당분과 지방의 섭취는 타고난 매력뿐만 아니라 학습 환경에 의해 매개된다. 뇌의 도파민, 특히 메조 - 변연계와 복부 피개 영역 (VTA)에서 메조 - 대뇌 피질 돌기,이 무식하고 배운 응답 모두에 관여하고있다. 여러 사이트와 송신기 / 펩티드 시스템 상호 뇌 상기 분산 네트워크의 개념은 기호성 식사량을 매개하는 것이 제안되었지만, 그러한 실험적 작업을 보여주는 제한된 증거가있다. 따라서, 설탕 섭취는 DA 출시 및 증가 C-FOS와 같은 핵 중격 의지 (NAC), 편도체 (AMY)를 포함하여 개인 VTA DA 투영 영역에서 면역 (FLI)과 전두엽 피질 (mPFC)뿐만 아니라 등쪽 선조체을 내측을 이끌어. 이 사이트에 선택적 DA 수용체 길항제 또한, 중앙 관리설탕이나 지방에 의해 유도 조절 맛을 환경 설정의 수집 및 발현을 감소 차등이야. 에 의해 하나의 방법이 사이트는 평가를 동시에하는 것입니다 설탕이나 지방 섭취에 대한 응답으로 분산 두뇌 네트워크로 상호 작용 여부를 결정하는 여부 VTA 및 주요 mesotelencephalic의 DA 투사 영역 (prelimbic와 NAC의 infralimbic mPFC, 코어와 쉘, 기저 및 중앙 cortico-중간 AMY)뿐만 아니라 등쪽 선조체는 조정 디스플레이 것이며, 옥수수 기름 (3.5 %), 포도당 (8 %), 과당 (8 %)과 사카린의 경구, 무조건 섭취 후 동시 FLI 활성화 (0.2 %) 솔루션을 제공합니다. 이 방법은 설치류의 맛이 음식의 섭취에 보상 관련 학습을 연구하기 위해 관련 뇌 사이트에서 동시에 휴대 C-FOS 활성화를 사용하는 가능성을 식별 성공적으로 첫 번째 단계입니다.

아래에 설명 된 모든 대표적인 결과는 이전에 69를 발표되었으며,이 기술의 효과를 나타내는에서 &quot;개념의 증거&quot;를 지원하기 위해 여기에 다시 표시됩니다. 솔루션 섭취 기준 사카린 섭취에 유의 한 차이는 모든 동물 (F (3,108) = 57.27, P &lt;0.001) 섭취와 (주 1 처음 네 일 동안 관찰되었다 : 1.3 (0.2 ±) ml의 날 2 : 3.9 (0.4 ±) ml의 ; 주 3 : 5.9 ㎖ (0.6 ±), 주 4 : 7.1 (0.6 ±) ml)로 유의하게 (P &lt;0.05, Tukey에 HSD 시험) 및 점진적으로 증가. 크게 5 일에 과당과 포도당 섭취,하지만 옥수수 기름 또는 사카린 섭취량 (p &lt;0.05, Tukey에 HSD 검사)는 4 일 사카린 ...

이 연구의 목적은 쥐의 지방과 설탕의 소설 섭취 후 도파민 경로 및 터미널 사이트에서 동시에 변화를 측정하기 위해 휴대 C-FOS 활성화를 사용하여 신뢰할 수있는 면역 조직 기술을 서술하여 보상 관련 분산 뇌 네트워크를 식별하는 것입니다.

흰쥐의 나이브 설탕과 지방 섭취에 따라 변연계와 Mesocortical 도파민 보상 사이트에서 C-에 Fos 활성화의 동시 검출

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

본 실험 프로토콜의 전반적인 목적은 옥수수유, 포도당, 과당 또는 사카린 용액의 새로운 섭취 후, VTA 및 주요 중뇌-종말망 DA 투사 영역에서 c-Fos 활성화가 좌표적으로 그리고 동시에 나타나는지 확인하는 것입니다. 이 방법은 동기 부여와 같은 신경생물학 분야의 핵심 질문에 답하고, 미각 자극에 반응하여 여러 뇌 부위가 조정된 방식으로 활성화되는지 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 확립된 행동 분석법, 세포 활성화 기술 및 통계 분석을 결합했다는 점입니다.장치를 설치하려면, 고무 마개가 달린 보정된 원심분리 튜브와 45도 각도의 금속 시퍼 튜브(sipper tube)를 사용하여 쥐에게 제공되는 용액의 양을 정확하게 측정하십시오. 팽팽한 금속 스프링을 사용하여 이를 홈 케이지에 고정하고, 보정 상태를 확인할 수 있도록 하십시오. 훈련 3~5일 전부터 쥐의 사료 공급량을 제한하여 체중을 원래 체중의 85%까지 감량시킴으로써, 용액 섭취에 대한 동기를 높이십시오.그동안 쥐가 이후의 테스트 용액을 짧은 잠복기로 섭취할 확률을 최대화하기 위해, 0.2% saccharine이 포함된 사전 훈련 용액 10 milliliters를 4일 동안 매일 1시간의 세션 동안 동물에게 제공합니다. 각 세션 전후에 튜브의 무게를 측정하여 섭취량을 구합니다. 그 다음, 다섯 번째 날에 6가지 용액 중 하나를 투여받은 하위 그룹들을 대상으로 섭취 테스트를 수행합니다.쥐의 샘플 용액이 짧은 잠복기를 갖는지 확인하고, 이 요구 사항을 충족하지 않는 개체는 연구에서 제외하십시오. 조직을 준비하려면, 동물을 희생시킨 후 두개골에서 뇌를 빠르게 제거합니다. 론저(rongeurs)를 사용하여 뒤쪽에서 앞쪽 방향으로 뼈를 조심스럽게 부수어 뇌에서 제거하십시오.소뇌 아래 영역에서 작업하며, 론저(rongeurs)가 뼈와 연질막(pia mater) 사이에 위치하도록 합니다. 두개골의 상단과 측면을 제거한 후, 작은 스패튤라를 사용하여 뇌를 바닥면에서 들어 올리고 작은 가위로 뇌신경을 절단합니다. 그 다음, 뇌를 4% paraformaldehyde 용액에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 고정합니다.다음 날, 뇌를 상온의 sucrose 용액에 넣고 용기 바닥에 가라앉을 때까지 둡니다. 그 후, 후구(olfactory bulb)를 제거합니다. 이어서 소뇌와 교(pons)를 제거합니다.그 다음, 뇌의 꼬리쪽 부분이 마이크로톰 스테이지에 고정되도록 관상면 방향으로 장착하고, 40 µm 두께의 관상 단면을 절단합니다. 이 과정에서, 절단된 단면을 5% 정상 염소 혈청과 0.2% Triton x-100이 포함된 PBS 5 mL로 1시간 동안 처리합니다. 이어서, 1 mL의 PBS가 담긴 웰에서 1차 항체와 함께 4 °C에서 36시간 동안 처리된 단면을 배양합니다.36시간 후, 5 mL의 PBS로 절편을 10분씩 3회 헹굽니다. 그런 다음, 1 mL의 PBS가 담긴 웰에서 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 절편을 배양합니다. 이후, 5 mL의 PBS로 절편을 10분씩 3회 헹굽니다.다음으로, 세척한 절편을 시판되는 Avidin horseradish peroxidase 혼합액에서 2시간 동안 인큐베이션합니다. 2시간 후, 5 mL의 PBS로 절편을 3회 세척하며, 각 세척 시간은 10분으로 합니다. 그 후, 과산화수소가 존재하는 조건에서 DAB와 절편을 5~10분 동안 반응시킵니다.그 후, 4°C에서 하룻밤 동안 5mL의 PBS에 담가 tyrosine hydroxylase 항체로 VTA 절편을 이중 표지합니다. 다음 날, 5mL의 PBS로 절편을 10분씩 세 번 헹굽니다. 이어서, 상온에서 2시간 동안 5mL의 PBS에 담가 절편을 2차 항체와 함께 배양합니다.2시간 후, 절편을 5 mL의 PBS로 10분씩 3회 세척합니다. 2차 항체 페르옥시다제 복합체를 사용하여 항체를 시각화하려면, DAB와 0.3% 황산니켈 용액 혼합물과 5~10분 동안 반응시킵니다. 소프트웨어 아이콘을 더블 클릭하여 세포 수를 측정합니다.메뉴 바에서 Acquisition을 클릭한 다음 Live Image를 선택하십시오. 그 후, 관심 영역(region of interest)의 초점을 맞추고 화면을 클릭하여 기준점을 설정하십시오. 다음으로 그리드 도구 모음에서 Display Grid와 Use Grid Labels를 클릭하십시오.미리 결정된 트레이스로 관심 영역(region of interest)의 외곽선을 그립니다. 그 다음, 각 관심 영역 내의 모든 세포 수를 측정하고, 왼쪽 사이드바에서 Plus를 선택하여 c-Fos 세포 수를 기록합니다. 정의된 진한 빨간색 원이 관찰되는 경우를 c-Fos 양성 세포로 간주합니다.각 부위에 대해 이 과정을 반복하고, 각 관심 영역의 각 섹션에 대해 두 명의 정보 비제공 평가자 간 신뢰도가 항상 0.8을 초과하는지 확인하십시오. 그 후, 관심 영역 내의 c-Fos 양성 뉴런의 수를 측정하십시오. VTA의 TH 양성 세포와 TH 음성 세포에서 c-Fos 면역반응성이 나타나는지 구분하십시오.이 이미지는 지방 또는 당분 섭취가 편도체 전체뿐만 아니라 기저외측, 중앙-피질-내측 편도체 하위 영역에서 c-Fos 활성화를 서로 다르게 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 이 이미지에서 옥수수유, 포도당 및 과당을 섭취한 동물들에게서 실제 편도체 c-Fos 활성화가 관찰되었습니다. 옥수수유와 물에 노출된 동물들에게서는 VTA의 c-Fos 활성화 또한 관찰되었습니다.검은색 화살표는 대표적인 이중 표지 TH c-Fos 양성 세포를 나타내며, 회색 화살표는 대표적인 c-Fos 단독 양성 세포를 나타냅니다. 숙련된 후 적절하게 수행한다면, 이 기술은 3~4주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 정확한 방법론, 보관 및 계수법을 준수하는 것이 중요합니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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