흰쥐의 나이브 설탕과 지방 섭취에 따라 변연계와 Mesocortical 도파민 보상 사이트에서 C-에 Fos 활성화의 동시 검출

이 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 VTA와 주요 중뇌파 DA 투영 영역이 옥수수 기름, 포도당, 과당 또는 사카린 용액의 새로운 섭취 후 좌표 및 동시 c-Fos 활성화를 표시하는지 여부를 결정하는 것입니다. 이 방법은 동기 부여와 같은 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하고 구미에 맞는 자극에 반응하여 여러 뇌 부위가 조정된 방식으로 활성화되는지 여부를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 확립된 행동 분석, 세포 활성화 기술 및 통계 분석을 결합한다는 것입니다.

장치를 설정하려면 강도 스토퍼가 있는 보정된 원심분리기 튜브와 45도 각도의 금속 시퍼 튜브를 사용하여 쥐에게 제공된 용액을 정확하게 측정하십시오. 팽팽한 금속 스프링으로 가정용 케이지에 고정하고 보정을 볼 수 있도록 합니다. 훈련 3-5일 전에 쥐에게 음식 배급을 제한하여 체중을 원래 체중의 85%로 줄여 용액을 소비하도록 동기를 부여합니다.

그 동안, 0.2% 사카린이 함유된 10ml의 사전 훈련 용액을 1시간 세션에 걸쳐 4일 동안 동물에게 제공하여 쥐가 짧은 대기 시간으로 후속 테스트 용액을 샘플링할 확률을 최대화합니다. 흡기 측정을 얻기 위해 각 세션 전후에 튜브의 무게를 잰다. 그런 다음 5일째에 6개의 솔루션 중 하나를 받은 하위 그룹에 대해 흡기 테스트를 수행합니다.

쥐가 짧은 대기 시간으로 용액을 샘플링하는지 확인하고 이 요구 사항이 충족되지 않으면 연구에서 피험자를 제외합니다. 조직을 준비하려면 동물을 희생 한 후 두개골에서 뇌를 빨리 제거하십시오. 롱거를 사용하여 뇌의 뼈를 뒤에서 앞으로 조심스럽게 부수고 제거합니다.

소뇌 아래 부위에서 작업하고 뱃머리가 뼈와 수막근 사이에 있는지 확인합니다. 두개골의 윗면과 옆면을 제거한 후 작은 주걱을 사용하여 뇌의 기저부를 들어 올리고 작은 가위로 뇌신경을 잘라냅니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 4%파라포름알데히드 용액에 뇌를 고정합니다.

다음날, 실온의 자당 용액에 뇌를 넣고 용기 바닥에 가라앉을 때까지 넣는다. 그런 다음 후각구를 제거하십시오. 그런 다음 소뇌와 폰을 제거합니다.

그런 다음 꼬리 부분을 마이크로톰의 단계에 고정하고 40개의 미로미터의 관상 부분을 자른 상태에서 뇌를 관상에 장착합니다. 이 절차에서는 5%의 일반 염소 혈청 5ml와 PBS에 0.2%의 Triton x-100을 1시간 동안 투여합니다. 다음으로, 1ml의 PBS가 함유된 웰에서 섭씨 4도에서 36시간 동안 1차 항체가 포함된 처리된 절편을 배양합니다.

36시간 후 PBS 5ml로 매번 10분씩 절편을 세 번 헹굽니다. 그런 다음 1ml의 PBS가 포함된 웰에서 2시간 동안 실온에서 2차 항체가 포함된 절편을 배양합니다. 그런 다음 5ml의 PBS에 10분 동안 절편을 세 번 헹굽니다.

다음으로, 헹굼된 절편을 시판되는 Avidin 양고추냉이 과산화효소 혼합물에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, PBS 5ml에 절편을 10분씩 3회 헹굽니다. 그 후, 과산화수소가 있는 상태에서 5-10분 동안 DAB로 섹션을 반응시킵니다.

그 후, 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 5밀리리터의 PBS에 함유된 티로신 하이드록실라제 항체로 VTA 절편을 배양하여 VTA 단면을 이중 라벨링합니다. 다음 날, 5ml의 PBS에 매번 10분씩 세 번 헹굽니다. 그런 다음 실온에서 2시간 동안 PBS 5ml에 2차 항체가 포함된 절편을 배양합니다.

2시간 후, PBS 5ml에 절편을 10분씩 3회 헹굽니다. 2차 항체 과산화효소 복합체를 사용하여 항체를 시각화하려면 DAB와 0.3% 황산니켈 용액의 조합으로 5-10분 동안 반응시킵니다. 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 셀을 계산합니다.

메뉴 표시줄로 이동하여 Acquisition을 클릭한 다음 Live Image를 클릭합니다. 그런 다음 관심 영역에 초점을 맞추고 화면을 클릭하여 기준점을 설정합니다. 그런 다음 그리드 도구 모음으로 이동하여 그리드 표시 및 그리드 레이블 사용을 클릭합니다.

미리 결정된 추적으로 관심 영역을 간략하게 표시합니다. 그런 다음 관심 영역의 모든 셀을 계산하고 왼쪽 사이드바에서 Plus를 선택하여 c-Fos 셀의 수를 등록합니다. 정의된 짙은 적색 원이 관찰될 때 c-Fos에 대해 양성인 세포를 고려하십시오.

각 사이트에 대해 이 프로세스를 반복하고 각 관심 영역의 각 섹션에 대해 정보가 없는 두 평가자의 평가자 간 신뢰도가 항상 0.8을 초과하는지 확인합니다. 그런 다음, 관심 영역에서 c-Fos 양성 뉴런을 계산합니다. VTA의 TH 양성 및 TH 음성 세포에 c-Fos 면역 반응이 존재하는지 여부를 설명합니다.

이 이미지는 지방 또는 설탕 섭취가 편도체 전체와 기저외측 및 중심-피질-내측 편도체 하위 영역에서 c-Fos 활성화를 차별적으로 증가시키는 것을 보여줍니다. 이 이미지에서는 옥수수 기름, 포도당 및 과당 섭취에 노출된 동물에서 실제 편도체 c-Fos 활성화가 관찰되었습니다. VTA의 C-Fos 활성화는 옥수수 기름과 물에 노출된 동물에서도 관찰되었습니다.

검은색 화살표는 대표적인 이중 표지된 TH c-Fos 양성 세포를 나타내고, 회색 화살표는 대표적인 c-Fos 전용 세포를 나타냅니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행된다면 3-4주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 정확한 방법론, 저장 및 계수를 따르는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.