렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 장 오가노이드의 다운스트림 분석을 위해 일차 마우스 장 상피에서 안정적으로 transduction된 오가노이드를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 HEC 2 93 T 세포를 렌티바이러스 패키징 벡터와 렌티바이러스 플라스미드로 transection하여 관심 유전자를 암호화하여 높은 역가 렌티바이러스 입자를 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 배양된 마우스 장 오가노이드를 여러 성장 인자로 전처리하여 낭포성 고증식성 소굴을 얻는 것입니다.

다음으로, 고역가 렌티바이러스로 오가노이드를 형질도입하고 마트리겔에서 형질도입된 오가노이드를 배양합니다. 마지막 단계는 다운스트림 면역조직화학 분석을 위해 완전히 성장한 형질주입 오가노이드를 파라핀에 삽입하는 것입니다. 궁극적으로, 렌티바이러스 오가노이드 형질도입은 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 빠른 장 상피의 체외 모델에서 유전적 변형을 생성하는 데 사용됩니다.

암 세포주와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 오가노이드가 돌연변이가 없고 변위된 줄기 세포 계층이라는 것입니다. 텍스트 세포 분극(text cellular polarization)에서는 소장 상피(small intestinal epithelium)의 모든 다른 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 또한 형질도입된 오가노이드는 특정 유전 요소를 연구하는 데 사용할 수 있으므로 형질전환 마우스의 사용과 비용 및 속도 측면의 사용을 능가합니다.

렌티바이러스 입자의 생산은 세포 배양 배지의 162제곱센티미터 플라스크에서 HEC 2 93 T 세포를 60-80% co로 분할하는 것으로 시작하는 5일 프로토콜입니다. 다음 날 섭씨 37도의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. DNA transfection 용액 및 폴리에틸렌 아민 또는 PEI transfection 용액을 프로토콜 텍스트에 기술된 대로 준비합니다.

DNA transfection solution을 PEI 용액 와류에 첨가하거나 여러 번 반전시키고 5분 동안 배양합니다. 실온에서. 2ml의 DNA TRANSFECTION plus PEI 용액을 HEC 2 93 T 세포에 떨어뜨리고 4시간 후 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다.

배양 매체를 새로 고칩니다. PEI를 제거하려면 4일째에 섭씨 37도에서 2일 동안 세포를 배양하고 50ml 튜브에 상층액을 수집합니다. 세포에 새로운 배양 배지를 추가하고 플라스크를 인큐베이터로 되돌려 놓고 수집된 상등액을 500Gs에서 5분 동안 원심분리합니다.

죽은 세포를 제거하려면 60ml의 대형 주사기를 사용하여 0.45마이크로미터 필터를 통해 SUPERNAT를 밀어 넣습니다. 여과된 상초를 다음 날 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 원심분리기를 수집하고 첫 번째 배치에 대해 표시된 대로 두 번째 상층액 배치를 여과합니다.

두 배치의 상등액을 울트라 원심분리기 튜브에 모읍니다. 50, 90 분 동안 000 GS에 분리기. 원심분리가 완료되면 매우 조심스럽게 울트라 원심분리기 튜브가 들어 있는 캡슐을 제거하고 층류 후드에 넣습니다.

울트라 원심분리기 튜브가 들어 있는 캡슐을 열고 튜브 위쪽에 있는 펠릿으로 매체를 조심스럽게 디캔팅합니다. 바이러스 펠릿은 시각화하기 어려울 수 있으므로 튜브 항소의 어느 쪽이 형성되었는지 기억하는 것이 중요합니다. 다음으로, 마이크로 피펫을 사용하여 매체의 마지막 비트를 제거하면서 초원심분리기 튜브 바닥 측면에 보이는 불투명한 갈색 펠릿을 휘젓지 않도록 주의합니다.

이 펠릿을 니코틴아미드 키나아제 억제제와 폴리 브레인 소련제가 보충된 500마이크로리터의 오가노이드 배양 배지에 다시 현탁시킵니다. 이 배지에서의 현탁액은 고역가 바이러스가 형질도입 2일 전에 오가노이드의 형질도입에 직접 사용되기 때문에 중요합니다. 0.95제곱센티미터 웰의 오가노이드를 48웰 플레이트의 새로운 웰로 분할합니다.

이전에 발표된 프로토콜을 따릅니다. 오가노이드 배양에서 약 50개의 작은 오가노이드를 얻는 것을 목표로 합니다. 글리코겐 합성효소 키나아제 억제제 및 니코틴아미드가 보충된 배지.

낭포성 하이퍼 증식 소낭선을 얻기 위해. 형질도입 당일 P 1000 마이크로 피펫으로 오가노이드를 채취하여 이틀 동안 오가노이드를 배양합니다. 매트라 젤과 배지를 위아래로 피펫팅하여 혼합물을 파괴합니다.

혼합물을 15ml 튜브에 넣습니다. PEs를 사용하여 원위 개구부를 감소시킨 피펫을 사용하여 100Gs에서 5분 동안 원심분리하여 오가노이드를 펠렛으로 만듭니다. 그런 다음 500마이크로리터의 예열 1x 트립신에서 상등액을 제거하고 오가노이드를 3분 동안 다시 부유시킵니다.

섭씨 37도의 수조에서 3.5ml의 세포주 배양 배지 원심분리기를 5분 동안 첨가하여 트립신을 비활성화합니다. 500 Gs.Remove에 매체의 대략 20 마이크로리터에 있는 펠릿을 남겨두기 위하여 최고 natan를 제거하십시오. 이 마지막 소량의 배지에 있는 오가노이드를 웰로 옮깁니다.

48웰 플레이트에. 이전에 제조된 transduction medium에 있는 high titer lentivirus를 오가노이드에 첨가하고 재현탁합니다. 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 오가노이드 바이러스 혼합물을 배양하여 1시간 후에 형질도입을 허용하고, 오가노이드 배양액 1ml를 오가노이드 바이러스 혼합물에 배지 배지로 첨가하고, 재현탁액, 혼합물을 850GS의 마이크로 원심분리기 튜브 원심분리기로 5분 동안 옮깁니다.

오가노이드를 펠렛화하려면 상층액을 제거하고 펠릿을 재현탁합니다. 20마이크로리터의 얼음처럼 차가운 마트라 젤에 물방울을 우물 중앙에 넣습니다. 48웰 플레이트에 넣고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

15분 후에 물방울이 굳어지기 위해. 250마이크로리터의 오가노이드 배양을 조심스럽게 첨가합니다. 니코틴아미드 및 키나아제 억제제가 보충된 배지.

인큐베이터의 알루미늄 블록을 섭씨 70도로 예열하여 파라핀 액체를 유지합니다. 완전히 자란 오가노이드가 있는 단일 웰에서 배지를 제거하고 내장된 오가노이드는 그대로 두고 PBS의 4% 파라폼 알데히드 1ml를 웰에 직접 추가합니다. 파라폼 알데히드를 1밀리리터의 PBS로 교체합니다.

PBS에 고정된 오가노이드를 재현탁하고 유리 바이알로 옮깁니다. 오가노이드를 1분 동안 바닥으로 가라앉힙니다. 다음으로, PBS를 피펫으로 제거하고 두 방울의 eoin 용액이 용해 된 70 % 에탄올로 교체하십시오.

임베딩 프로세스 전반에 걸쳐 오가노이드를 시각화할 수 있도록 오가노이드를 70% 에탄올에 노출시켜 실온에서 30분 동안 방치합니다. 조심스럽게 피펫팅하여 70% 에탄올을 제거합니다. 오가노이드는 분홍빛이 도는 이언 색상 때문에 눈으로 시각화할 수 있습니다.

임베딩 용액을 96% 에탄올로 교체하고 이런 식으로 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오. 그 후, 70% 에탄올, 90% 에탄올, 96% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 에탄올, 자일렌 및 크실렌을 통해 오가노이드를 통과시킵니다. 마지막 자일렌 세척을 디캔팅하고 파라핀을 유리 바이알에 붓습니다.

바이알을 섭씨 70도의 예열 알루미늄 블록에 즉시 30분 동안 넣습니다. 30분 후 파라핀을 예열, PE 또는 피펫으로 깨끗한 새 파라핀으로 교체하십시오. 파라핀을 붓고 예열 해충 또는 큰 구멍이 있는 피펫을 사용하여 오가노이드를 파라핀 블록 몰드에 피펫으로 넣고 액체 파라핀 층으로 만듭니다.

분젠 버너로 해부 바늘을 데우고 모든 오가노이드를 파라핀 블록 몰드의 중심을 향해 최대한 조작합니다. 금형 내 오가노이드의 국소화가 만족스러우면 금형을 약간 냉각시켜 파라핀 층을 응고시킵니다. 위에 파라핀을 더 붓고 표준 조직학적 임베딩 카세트를 추가하여 블록을 마무리합니다.

이 프로토콜에서는 장 상피의 오가노이드를 렌티바이러스로 형질전환했습니다. 정상적인 오가노이드는 K 크립트 융모 구조로 성장하며, 공유 융모 도메인에서 나오는 여러 크립트가 있습니다. 이러한 오가노이드를 GSK three B 억제제인 CHIR 9 9 0 21로 처리하면 증식이 증가하고 오가노이드 형질도입 후 crypt가 낭성화됩니다.

오가노이드는 렌티바이러스 EGFP 과발현을 사용하여 형광 EGFP 형질도입 향상 단계를 발현하며, 이러한 단계는 이미 높은 효능을 증가시키지 않기 때문에 접종 또는 장기간의 바이러스 배양과 같이 형도입 효능이 낮을 때 수행할 수 있습니다. 그 후, 이러한 오가노이드는 RNA 기술 및 면역조직화학을 위해 처리됩니다. 이 대표 이미지는 쥐 장 오가노이드의 한 부분으로, 고정하기 1시간 전에 BRDU로 배양한 후 BRDU로 염색되었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 입자를 사용하여 1차 장 상피에서 오가노이드를 transduction하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.