조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

이 절차의 전반적인 목표는 골수에 있는 특정 세포 부분 집합 간의 연관성을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 대퇴골 종양에서 조직학적 극저온 절편을 수집하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 면역형광 분석을 위해 절편을 염색하고 컨포칼 이미지를 획득합니다.

그런 다음 이미지를 디지털 방식으로 분석합니다. 궁극적으로, 서로 다른 세포 유형의 위치를 시뮬레이션하여 관심 있는 특정 면역학적 세포와 미세환경 간의 접촉 속도와 빈도를 계산할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 골수에서 수명이 긴 형질 세포에 대한 미세환경 틈새를 분석할 때 처음 떠올랐으며, 골수 조직 내의 세포 연관성을 명확하게 정량화할 수 있는 방법이 필요했습니다.

RA Maya는 성인 마우스의 대퇴골을 냉동 흡입하는 절차를 시연합니다. 먼저 경조직 블레이드가 장착된 표준 마이크로톰의 샘플과 블레이드 온도를 섭씨 영하 24도로 설정합니다. 15분 동안 적응한 후.

샘플 블록을 cryo embedding medium이 있는 금속 샘플 홀더에 고정하고 필요에 따라 블록의 방향을 조정합니다. 뼈가 완전히 열리고 골수가 보일 때까지 샘플을 다듬습니다. 그런 다음 단면 두께를 7미크론으로 조정합니다.

다음으로, 가죽으로 덮인 나무 주걱을 사용하여 샘플을 절단하고 집게를 사용하여 샘플 블록 상단의 끈적끈적한 면이 있는 카와모토 접착 테이프 조각을 고정합니다. 섹션이 위쪽에 오도록 테이프를 돌립니다. 그런 다음 테이프를 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다.

마지막 섹션이 수집되었을 때 스카치 테이프로 유리 슬라이드에 테이프를 고정합니다. 샘플을 최소 30분 동안 구동하고 슬라이드를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 두 명의 여성이 일반적인 면역 형광 프로토콜에 따라 해동된 냉동 절편을 염색하는 샘플을 이미지

조직 무결성을 시각화하기 위해 핵 염색을 포함해야 합니다. 단면을 염색한 후 각 샘플에 바닥 마운트를 한 방울 떨어뜨린 다음 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에 1번 유리 커버 슬립을 추가합니다. 20 x 대물 렌즈를 선택하고 필드 뷰를 708 포인트 15 x 708 포인트 15 미크론으로 설정합니다.

그런 다음 이미지당 2048 x 2048 픽셀로 샘플을 한 번에 하나씩 이미지화하여 결과를 비교할 수 있도록 합니다. 기질 구조를 시각화하기 위해 한 채널, 핵을 위한 한 채널, 필요에 따라 관심 있는 조혈 세포를 위한 추가 채널에 이미지를 기록합니다. 라인 평균화를 사용하여 이미지를 기록합니다.

이상적으로는 전체 대퇴골 단면을 커버하기 위해 인접한 단일 이미지를 캡처하는 것이 좋습니다. 그런 다음 이미지를 현미경 이미지 파일 형식으로 저장합니다. 그런 다음 이미징된 각 영역에 대해 채널당 하나의 JPEG 파일을 내보내고, 이미지 분석 도구를 사용하여 무작위 셀의 시뮬레이션을 실행하기 전에 공동 국소화 및 이웃 분석의 이미지 분할 정량화를 수행합니다.

시뮬레이션할 각 이미지에 대해 분석된 골수 이미지에 포지셔닝하는 단계. 다음 파일을 셀 연락처 도구에서 제공하는 단일 CSV 파일인 단일 폴더에 배치합니다. 원본 DPI 채널 JPEG 파일 및 원본 기질 채널 JPEG 파일은 단일 대퇴골 샘플의 일련의 이미지에 대한 배치 시뮬레이션을 수행하여 모든 원본 JPEG 파일과 해당 단일 CSV 파일을 이때 다른 폴더로 전송합니다.

모든 파일이 어셈블되면 시뮬레이션 도구를 시작합니다. 그런 다음 이미지 데이터 자동 로드 상자를 선택합니다. 이 옵션을 선택하면 분석된 이미지에 해당하는 CSV 파일이 자동으로 열립니다.

다음으로, CSV 파일에 대한 공통 태그와 배치 모드 시뮬레이션에 사용해야 하는 이미지 세트 수를 입력합니다. 그런 다음 S 스트로마 채널에서 생성된 J peg 파일을 파일 이름이 3으로 끝나는 상태로 로드하여 DPI 채널에 대한 마스크를 생성합니다. 마스크 적용 상자를 선택하고 DPI 이미지를 이진 마스크로 변환하기 위한 임계값을 10으로 설정합니다.

8비트 및 팽창 상자를 선택하고 팽창 등급을 5픽셀로 설정합니다. 그런 다음 너비 침식 상자를 확인합니다. 그런 다음 시뮬레이션된 이미지의 분석에 사용되는 주변 반경에 대해 원하는 값을 입력하고 조혈 세포의 기질 구조를 자동으로 감지하기 위해 OSU 알고리즘을 사용하려면 OSU 사용 상자를 선택합니다.

원형 모양으로 시뮬레이션됩니다. 적절한 객체 분할 기능이 포함된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된 세포 유형의 세포 크기 분포를 측정하고 이러한 측정에서 모든 조혈 유형에 대한 시그마를 결정합니다. 셀 크기 컷오프(cell size cutoff)는 이미지 분석 도구에 의해 여전히 완전한 셀로 인식되는 가장 작은 물체를 설명하는 픽셀 단위의 직경을 결정할 수 있습니다.

그런 다음 빨간색, 녹색 및 파란색 셀에 대한 셀 크기 분포를 시뮬레이션하기 위해 셀 크기 컷오프와 시그마를 픽셀 단위로 입력합니다. 다음으로 셀 및 마스크 탭에서 삭제 상자를 선택하여 마스크의 이동 금지 영역 내에서 하나 이상의 픽셀과 겹치는 경우 프로그램이 셀의 새 위치를 선택할 수 있도록 합니다. cell exclusion 탭에서 avoid cell overlap 상자도 선택합니다.

그런 다음 두 셀의 중심 사이에 허용되는 최소 거리를 픽셀 단위로 입력합니다. 한 셀의 중심에서 다른 셀의 중심까지의 최소 거리로 겹침이 정의되는 경우 최대 겹침 영역을 100%로 설정한 다음 시뮬레이션 도구를 1000회 반복으로 설정합니다. 그런 다음 자동 저장 판매 상자를 선택하여 배치의 각 이미지의 모든 반복에 대한 시뮬레이션된 개체의 좌표를 텍스트 형식의 난파선 파일로 저장합니다.

저장된 파일에 대한 공통 태그도 입력합니다. 마지막으로, run simulation을 클릭하고 기록된 각 이미지에 해당하는 1000개의 시뮬레이션된 이미지 세트의 평균 접촉 및 주변 주파수를 결정합니다. 이 분할을 위해 평균 접촉 및 주변 수를 이미지당 기록된 세포 수로 계산하고 주파수를 기록된 이미지의 자동화된 공동 국소화 분석 결과와 비교합니다.

이 그림에서는 호산구, 형질 세포 및 B 세포와 형광 키메라 골수를 가진 기질 세포 미세환경의 국소화 분석이 제시되어 있습니다. 셀 접촉 및 주변 도구에 의해 생성된 CSV 파일에는 각 세포 집단에 대한 셀 수와 총 면적(픽셀)과 접촉 또는 주변 수가 포함되어 있습니다. 무작위 세포 포지셔닝의 시뮬레이션을 수행하기 전에 이 시뮬레이션에서 세포 크기 분포를 가우스 분포로 설명하는 매개변수를 결정해야 하며, 세 세포 집단에 대해 측정된 시그마의 상대 값이 유지되었습니다.

픽셀로 정의된 시그마 값은 셀을 배치할 수 있는 영역을 정의하기 위해 기록된 셀의 시각적 모양과 일치하도록 설정되었지만 DAPI 채널에서 마스크가 생성되었습니다. 그런 다음 10의 값이 이진 이미지를 생성하기 위한 최적의 밀도 임계값으로 결정되었습니다. 그런 다음 형질세포, 호산구 또는 B세포와 기질세포의 접촉과의 관련성을 예상대로 테스트했습니다.

이러한 분석은 형질 세포와 B 세포에 대한 시뮬레이션에 비해 기록된 이미지에서 훨씬 더 높은 접촉률을 보여주었습니다. 대조적으로, 호산구 기질 세포 접촉에 대해서는 명확한 차이가 관찰되지 않았습니다. 이 방법은 면역학, 혈액학, 병리학 또는 줄기세포 생물학과 같이 골수의 복잡한 조직 구조를 분석해야 하는 모든 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.