조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

이 절차의 전반적인 목적은 골수 내 특정 세포 하위 집단 간의 연관성을 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생쥐 대퇴골 종양에서 조직학적 동결 절편을 수집합니다. 두 번째 단계에서는 면역형광 분석을 위해 절편을 염색하고 공초점 이미지를 획득합니다.

그 후 이미지들을 디지털 방식으로 분석합니다. 최종적으로, 서로 다른 세포 유형의 위치를 시뮬레이션하여 관심 있는 특정 면역 세포와 그 미세환경 사이의 접촉률 및 빈도를 계산할 수 있습니다. 우리는 골수 내 장기 생존 형질세포의 미세환경 니치(niche)를 분석하던 중 이 방법의 아이디어를 처음 얻었으며, 골수 조직 내의 세포 간 연관성을 명확하게 정량화할 수 있는 방법이 필요했습니다.

RA Maya가 성체 마우스의 대퇴골을 저온 절편 제작(cryo suction)하는 절차를 시연하겠습니다. 먼저, 경조직용 칼날이 장착된 표준 마이크로톰의 시료 및 칼날 온도를 -24 °C로 설정하십시오. 이후 15분 동안 적응 시간을 갖습니다.

동결 매립제를 사용하여 샘플 블록을 금속 샘플 홀더에 고정하고, 필요에 따라 블록의 방향을 조정합니다. 뼈가 완전히 열리고 골수가 보일 때까지 샘플을 트리밍합니다. 그런 다음 절편 두께를 7 µm로 조정합니다.

다음으로, 가죽으로 덮인 나무 스패튤라를 사용하여 샘플 블록 상단에 카와모토 접착 테이프의 접착면이 위로 오도록 고정합니다. 핀셋을 사용하여 샘플을 절편화합니다. 절편이 위쪽으로 오도록 테이프를 돌립니다. 그런 다음 테이프를 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다.

마지막 섹션 수집이 완료되면 스카치테이프를 사용하여 테이프를 유리 슬라이드에 고정합니다. 샘플을 최소 30분 동안 건조시킨 후 슬라이드를 -80 °C에서 보관하십시오. 해동된 동결 절편을 일반적인 면역형광 염색 프로토콜에 따라 염색하고 샘플 이미지를 획득합니다.

조직의 무결성을 시각화하기 위해 핵 염색을 반드시 포함하십시오. 절편 염색이 완료되면 각 시료에 마운팅 용액 한 방울을 떨어뜨린 후, 1번 유리 커버스립을 덮어 레이저 주사 공초점 현미경에 올립니다. 20x 대물렌즈를 선택하고 시야 범위를 708.15 by 708.15 microns로 설정하십시오.

그 다음, 결과의 비교 가능성을 유지하기 위해 샘플을 하나씩 이미지당 2048 by 2048 픽셀로 촬영합니다. 기질 구조 시각화를 위한 채널 하나, 핵을 위한 채널 하나, 그리고 필요에 따라 관심 대상인 조혈 세포를 위한 추가 채널들로 이미지를 기록합니다. 라인 평균화(line averaging)를 사용하여 이미지를 기록하십시오.

이상적으로는 대퇴부 단면 전체를 커버할 수 있도록 인접한 단일 이미지들을 캡처합니다. 그 다음 이미지들을 현미경 이미지 파일 형식으로 저장하십시오. 이후 촬영된 각 영역에 대해 채널당 하나의 JPEG 파일을 내보내고, 이미지 분석 도구를 사용하여 이미지 세그멘테이션, 공동 국소화(colocalization) 및 근접 분석(neighborhood analysis) 정량화를 수행한 후 무작위 세포 시뮬레이션을 실행하십시오.

시뮬레이션을 수행할 각 골수 분석 이미지의 위치를 지정합니다. 셀 접촉 도구(cell contact tool)에서 제공한 개별 CSV 파일들을 하나의 폴더에 넣으십시오. 단일 대퇴골 샘플에서 얻은 일련의 이미지들에 대해 일괄 시뮬레이션을 수행하려면, 원본 DPI 채널 JPEG 파일과 원본 기질(stromal) 채널 JPEG 파일들을 준비하십시오. 이때 모든 원본 JPEG 파일과 그에 해당하는 개별 CSV 파일들을 다른 폴더로 함께 이동시키십시오.

모든 파일이 준비되면 시뮬레이션 도구를 실행하십시오. 그다음 이미지 데이터 자동 로드(auto load image data) 확인란을 선택하십시오. 이 옵션을 선택하면 분석된 이미지에 해당하는 CSV 파일이 자동으로 열립니다.

다음으로, CSV 파일의 공통 태그와 배치 모드 시뮬레이션에 사용할 이미지 세트 수를 입력하십시오. 그 후, DPI 채널의 마스크를 생성하기 위해 파일 이름이 three로 끝나는 S stroma 채널에서 생성된 JPEG 파일을 로드하십시오. apply mask 상자를 체크하고, DPI 이미지를 이진 마스크로 변환하기 위한 임계값을 10으로 설정하십시오.

eight bit 및 dilate 상자를 선택하고 dilation 등급을 5 pixels로 설정합니다. 그런 다음 width erosion 상자를 선택하십시오. 이어서 시뮬레이션 이미지 분석에 사용할 vicinity radius의 원하는 값을 입력하고, 조혈 세포의 기질 구조를 자동으로 검출하기 위해 OSU 알고리즘을 사용하는 use OSU 상자를 선택하십시오.

원형으로 시뮬레이션합니다. 적절한 객체 분할 기능이 포함된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된 세포 유형의 세포 크기 분포를 측정하고, 이 측정값으로부터 모든 조혈 세포 유형의 시그마(sigma)를 결정합니다. 이미지 분석 도구에서 완전한 세포로 여전히 인식하는 가장 작은 객체의 직경(픽셀 단위)인 세포 크기 컷오프(cutoff)를 결정할 수 있습니다.

그런 다음 빨간색, 초록색 및 파란색 세포의 세포 크기 분포 시뮬레이션을 위해 세포 크기 컷오프와 픽셀 단위의 sigma 값을 입력합니다. 다음으로 cells and mask 탭에서 delete 상자를 체크하여, 세포가 마스크의 no-go 영역 내에 최소 1픽셀이라도 겹치는 경우 프로그램이 세포의 새로운 위치를 선택할 수 있도록 합니다. cell exclusion 탭 아래에서 avoid cell overlap 상자도 함께 체크합니다.

그 다음, 두 세포 중심 사이의 허용 최소 거리를 픽셀 단위로 입력합니다. 중첩이 한 세포의 중심에서 다른 세포의 중심까지의 최소 거리로 정의되는 경우, 최대 중첩 면적을 100%로 설정하십시오. 그런 다음 시뮬레이션 도구의 반복 횟수를 1000회로 설정합니다. 이어서 자동 저장 상자를 체크하여 배치 내 각 이미지의 모든 반복 횟수에 대해 시뮬레이션된 객체의 좌표를 텍스트 형식의 파일로 저장하십시오.

저장될 파일들에 사용할 공통 태그도 입력하십시오. 마지막으로, 시뮬레이션 실행(run simulation)을 클릭하여 각 기록된 이미지에 해당하는 1000장의 시뮬레이션 이미지 세트의 평균 접촉 및 인접 빈도를 결정합니다. 이를 위해 평균 접촉 및 인접 횟수를 이미지당 기록된 세포 수로 나누고, 해당 빈도를 기록된 이미지의 자동 공국소화 분석 결과와 비교하십시오.

이 그림에서는 형광 키메라 골수를 사용하여 호산구, 형질 세포 및 B 세포와 기질 세포 미세환경의 국소화 분석 결과가 제시되어 있습니다. 세포 접촉 및 인접 도구를 통해 생성된 CSV 파일에는 각 세포 집단의 세포 수와 픽셀 단위의 총 면적뿐만 아니라 접촉 또는 인접 횟수가 포함되어 있습니다. 무작위 세포 배치의 시뮬레이션을 수행하기 전, 세포 크기 분포를 가우스 분포로 설명하는 파라미터를 본 시뮬레이션에서 결정해야 하며, 세 가지 세포 집단에 대해 측정된 시그마의 상대적 값들이 유지되었습니다.

세포가 배치될 수 있는 영역을 정의하기 위해 픽셀 단위로 정의된 Sigma 값을 기록된 세포의 시각적 외형과 일치하도록 설정하는 동안, DAPI 채널로부터 마스크를 생성하였습니다. 이후 이진 이미지를 생성하기 위한 최적의 밀도 임계값으로 10이라는 값이 결정되었습니다. 그 다음, 예상한 대로 형질세포, 호산구 또는 B 세포가 기질 세포와 접촉하는 것의 관련성을 테스트하였습니다.

이러한 분석 결과, 기록된 이미지에서 형질세포와 B 세포의 접촉률이 시뮬레이션에 비해 유의미하게 높게 나타났습니다. 반면, 호산구와 기질 세포 간의 접촉에서는 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았습니다. 이 방법은 면역학, 혈액학, 병리학 또는 줄기세포 생물학 등 골수의 복잡한 조직 구조 분석이 필요한 모든 분야의 핵심적인 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.