2022년 9월 28일
여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.
설명된 프로토콜은 골수 조혈 줄기 및 전구 세포 및 골수 기질 세포의 표현형 분석을 허용합니다. 다양한 환경에서 이러한 집단에 대한 섭동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이전에 기술된 다른 방법과 비교하여, 이 기술은 조혈 세포, 특히 골수 기질 세포뿐만 아니라 두 개의 기능적 골수 영역, 내골 및 중앙 골수 부위의 표현형 분석을 가능하게 합니다.
시작하려면 배가 위로 향하게 한 안락사 동물을 페트리 접시에 놓고 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위를 사용하여 복부 위를 절개하고 피부를 발목까지 잡아 당깁니다. 다리 중 하나를 잡고 바닥을 잘라 가위를 사용하여 동물과 분리하십시오.
그런 다음 발목을 절단하여 다리에서 발을 제거하고 다리를 얼음처럼 차가운 PBS 2%FBS에 넣습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 엉덩이 뼈를 잡고 그 뒤를 잘라 가위를 사용하여 동물과 분리합니다. 엉덩이 뼈를 얼음처럼 차가운 PBS 2%FBS에 넣습니다.
다리와 엉덩이 뼈를 페트리 접시에 넣은 후 멸균 메스를 사용하여 뼈를 청소하십시오. 그런 다음 메스로 무릎을 절단하여 경골과 대퇴골을 분리하고 깨끗한 뼈를 얼음처럼 차가운 PBS 2%FBS에 넣습니다. 얼음처럼 차가운 PBS 2%FBS가 있는 모르타르에 대퇴골이나 경골을 넣고 유봉을 사용하여 모르타르 벽에 부드럽게 눌러 뼈를 부수십시오.
다음에, 생성된 세포 현탁액을 10 밀리리터 피펫을 사용하여 상하로 피펫팅하여 균질화하고, 이를 튜브의 상부에 놓인 40 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 50 밀리리터 튜브 내로 옮긴다. 모르타르를 PBS 2%FBS로 헹구고 동일한 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 동일한 50밀리리터 튜브로 용액을 옮깁니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 50밀리리터 튜브를 원심분리합니다.
상청액을 버린 후, 실온에서 5밀리리터의 RBC 용해 완충액에 세포 펠릿을 여러 번 위아래로 피펫팅하여 재현탁시킨다. 실온에서 2분간 배양한 후 15밀리리터의 PBS 2%FBS를 추가하고 50밀리리터 튜브를 원심분리합니다. 세포 펠릿이 붉게 보이지 않으면 상층액을 버리고 펠렛을 200마이크로리터의 PBS 2%FBS에 재현탁하고 세포 현탁액을 염색을 위해 96웰 V 바닥 플레이트의 웰로 옮깁니다.
앞에서 설명한 대로 뼈를 부수고 가위를 사용하여 P1000 피펫의 끝을 자르고 이를 사용하여 모르타르의 모든 내용물을 50밀리리터 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5 분 동안 500G에서 50 밀리리터 튜브를 원심 분리합니다. 상청액을 버린 후, 펠릿을 3 밀리리터의 콜라게나제 IV와 이 디스파스-II 용액에 재현탁시킨다.
튜브를 섭씨 37도에서 40분 동안 배양합니다. PBS 2%FBS로 튜브를 25밀리리터까지 채우고 소용돌이를 섞습니다. 다음으로, 내용물을 100 마이크로 미터 셀 스트레이너를 통해 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 기존 50 밀리리터 튜브에 PBS 2 % FBS 15 밀리리터를 추가하고 100 마이크로 미터 셀 스트레이너를 통해 새로운 50 밀리리터 튜브로 용액을 옮깁니다. 원심분리하고 상층액을 버린 후, 피펫으로 여러 번 위아래로 피펫팅하여 5밀리리터의 RBC 용해 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 실온에서 2분간 배양한 후, PBS 2%FBS 15밀리리터를 첨가한다.
다시, 튜브를 원심분리하고 상층액을 버린 후 세포 펠릿이 붉게 보이지 않으면 펠렛을 PBS 2%FBS 200마이크로리터에 재현탁하고 세포 현탁액을 염색을 위해 96웰 V 바닥판의 웰로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 4도에서 3분 동안 500G에서 원심분리합니다. 대퇴골을 페트리 접시에 놓고 멸균 메스를 사용하여 뼈 끝을 자릅니다.
그런 다음 100 마이크로 리터의 PBS 2 % FBS를 뼈 내부를 통해 각 측면에서 한 번씩 통과시켜 뼈의 중앙 부분을 세척하고 1 밀리리터의 PBS 2 % FBS가 들어있는 미세 원심 분리 튜브에 용액을 수집합니다. 이어서, 세포 현탁액을 4밀리리터의 PBS 2%FBS를 함유하는 플러싱된 골수로 표지된 50 밀리리터 튜브로 옮긴다. 얼음처럼 차가운 PBS 2%FBS로 절구에 뼈의 끝을 유봉을 사용하여 모르타르 벽에 부드럽게 눌러 부수십시오.
세포 현탁액이 균질화되면 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 분쇄된 골수로 표시된 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 PBS 2%FBS로 모르타르를 헹구고 용액을 동일한 튜브로 옮깁니다. 조혈 줄기 세포 및 다분화능 전구체의 유세포 분석은 건강한 젊은 성인 C57BL6J 마우스의 전체 골수에서 수행되었습니다.
전체 골수에서 기질 세포, 내피 세포 및 중간엽 줄기 세포의 분석에 있어서, 중간엽 줄기세포는 렙틴 수용체 발현을 기반으로 용이하게 동정할 수 있고, 내피 세포는 CD31 및 SCA-1의 발현을 기반으로 동정할 수 있다. ICAM1에 기초하여 세동맥 세포와 정현파 내피 세포의 구별을 보여주는 전체 골수에서 내피 세포의 유세포 분석. 중심 및 골수 조직에서 동맥 및 정현파 골수 내피 세포의 정량화는 동맥 골수 내피 세포가 내골 부위에 더 풍부한 반면 정현파는 중앙 골수 부위에서 더 빈번하다는 것을 보여줍니다.
홍조된 골수를 얻을 때 뼈의 중앙 부분 내부를 통해 PBS 2%FBS를 통과시키는 것으로 표시된 부피 또는 횟수를 초과해서는 안 됩니다. 설명된 방법을 표현형으로 분석된 세포 집단의 기능적 분석과 결합하면 연구된 조건에서 발생하는 이러한 집단에 대한 잠재적 섭동에 대한 추가 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 설명된 프로토콜은 내골 및 중심 골수에서 조혈 세포의 표현형 분석을 허용하여 연구자가 이러한 골수 위치에서 잠재적으로 발생할 수 있는 혈색소에 대한 섭동을 조사할 수 있도록 합니다.
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이 연구는 조혈 줄기 세포 및 전구 세포와 함께 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포를 분석하기 위해 마우스 골수 세포를 분리 및 염색하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 골수의 내피 및 중심 영역에서 세포를 농축하는 것을 용이하게 합니다.
High-resolution flow cytometry analysis of murine bone marrow enables precise phenotypic characterization of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and their stromal niche, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in hematology drug discovery. This approach allows R&D teams to interrogate the impact of genetic or disease perturbations on distinct marrow compartments, informing predictive confidence at critical discovery inflection points. The method's ability to distinguish endosteal and central marrow populations enhances portfolio decision-making for therapies targeting the hematopoietic microenvironment.
This flow cytometry protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling early hypothesis testing, target validation, and mechanistic de-risking for hematopoietic and niche-targeted programs.