Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells의 유세포 분석

설명된 프로토콜은 골수 조혈 줄기 및 전구 세포와 골수 기질 세포의 표현형 분석을 가능하게 합니다. 다양한 환경에서 이러한 개체군에 대한 섭동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 앞서 설명한 다른 방법과 비교했을 때, 이 기법은 특히 골수 기질 세포뿐만 아니라 두 개의 기능성 골수 영역인 엔도스티알 골수와 중앙 골수 영역에서 조혈 세포의 표현형 분석을 가능하게 합니다.

먼저 안락사된 동물을 배가 위로 향하게 하여 페트리 접시에 놓고 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위를 사용하여 복부 위를 자르고 발목까지 피부를 당겨 빼냅니다. 다리 중 하나를 잡고 바닥을 잘라 가위를 사용하여 동물과 분리합니다.

그런 다음 발목을 잘라 다리에서 발을 제거하고 다리를 얼음처럼 차가운 PBS 2%FBS에 넣습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 엉덩이 뼈를 잡고 가위를 사용하여 동물과 분리하기 위해 그 뒤를 자릅니다. 엉덩이 뼈를 얼음처럼 차가운 PBS 2%FBS에 넣습니다.

다리와 엉덩이 뼈를 페트리 접시에 넣은 후 멸균 메스를 사용하여 뼈를 청소합니다. 그런 다음 메스로 무릎을 절개하여 경골과 대퇴골을 분리하고 깨끗한 뼈를 얼음처럼 차가운 PBS 2%FBS에 넣습니다. 얼음처럼 차가운 PBS 2%FBS가 있는 절구에 대퇴골 또는 경골을 놓고 절굿공이를 사용하여 절구의 벽에 부드럽게 눌러 뼈를 부수십시오.

다음으로, 10ml 피펫을 사용하여 생성된 세포 현탁액을 위아래로 피펫으로 연결하여 균질화하고 튜브 상단에 배치된 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 50ml 튜브로 이동합니다. 모르타르를 PBS 2%FBS로 더 헹구고 동일한 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 동일한 50ml 튜브로 용액을 옮깁니다. 500G에서 50ml 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다.

상등액을 버린 후, 여러 차례 위아래로 피펫팅하여 실온에서 5ml의 RBC 용해 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 실온에서 2분 동안 배양한 후 PBS 2%FBS 15ml를 넣고 50ml 튜브를 원심분리합니다. 세포 펠릿이 붉게 보이지 않으면 상등액을 버리고 펠릿을 PBS 2%FBS 200마이크로리터에 재현탁탁한 다음 세포 현탁액을 염색을 위해 96웰 V 바닥판의 웰로 옮깁니다.

앞에서 시연한 대로 뼈를 으깬 후 가위를 사용하여 P1000 피펫의 끝을 자르고 이를 사용하여 모르타르의 모든 내용물을 50ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 500G에서 50ml 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버린 후, 펠릿을 3 밀리리터의 콜라겐 분해 효소 IV와이 dispase-II 용액에 재현탁시킵니다.

튜브를 섭씨 37도에서 40분 동안 배양합니다. 튜브를 PBS 25%FBS와 와류로 혼합하여 2ml로 채웁니다. 그런 다음 100마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 내용물을 새 50ml 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 기존 50 밀리리터 튜브에 15 밀리리터의 PBS 2%FBS를 추가하고 100 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용액을 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 원심분리하여 상층액을 버린 후, 피펫으로 여러 번 위아래로 피펫팅하여 5ml의 RBC 용해 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 실온에서 2분 동안 배양한 후 PBS 2%FBS 15ml를 추가합니다.

다시 튜브를 원심분리하고 상등액을 버린 후 세포 펠릿이 붉게 보이지 않으면 펠릿을 PBS 2%FBS 200마이크로리터에 재현탁시키고 세포 현탁액을 염색을 위해 96웰 V 바닥판의 웰로 옮깁니다. 그런 다음 500G에서 플레이트를 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리합니다. 페트리 접시에 대퇴골을 놓고 멸균 메스를 사용하여 뼈 끝을 자릅니다.

그런 다음 무데드 볼륨 0.5ml 인슐린 주사기를 사용하여 뼈 내부를 통해 100마이크로리터의 PBS 2%FBS를 각 측면에서 한 번씩 통과시키고 PBS 2%FBS 1ml가 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브에 용액을 모아 뼈의 중앙 부분을 세척합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 4ml의 PBS 2%FBS가 포함된 플러시된 골수로 표시된 50ml 튜브로 옮깁니다. 절구를 사용하여 절구의 벽에 부드럽게 눌러 얼음처럼 차가운 PBS 2%FBS로 모르타르의 뼈 끝을 으깨십시오.

세포 현탁액이 균질화되면 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 분쇄된 골수로 표시된 50ml 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 PBS 2%FBS로 모르타르를 헹구고 용액을 동일한 튜브에 옮깁니다. 조혈모세포와 다분화능 전구세포의 유세포 분석 분석은 건강한 젊은 성인 C57BL6J 마우스의 총 골수에서 수행되었습니다.

전체 골수에서 기질 세포, 내피 세포 및 중간엽 줄기 세포를 분석할 때 렙틴 수용체 발현을 기반으로 중간엽 줄기세포를 쉽게 확인할 수 있으며 CD31 및 SCA-1의 발현을 기반으로 내피 세포를 확인할 수 있습니다. ICAM1을 기반으로 한 세동맥 세포와 사인파 내피 세포의 차이를 보여주는 총 골수 내 세포의 유세포 분석 분석. 중앙 및 내골 조직에서 동맥 및 정현파 골수 내피 세포를 정량화한 결과, 동맥 골수 내피 세포는 내피 부위에 더 풍부하고, 정현파는 중앙 골수 부위에서 더 빈번하게 발생한다는 것을 보여줍니다.

세척된 골수를 얻을 때, 뼈의 중앙 부분 내부를 통해 PBS 2%FBS를 통과하도록 표시된 부피 또는 횟수를 초과해서는 안 됩니다. 설명된 방법을 표현형으로 분석된 세포 집단의 기능적 분석과 결합하면 연구된 조건에서 발생하는 이러한 집단에 대한 잠재적 섭동에 대한 추가 가치 있는 정보를 제공할 수 있습니다. 설명된 프로토콜은 내골수와 중심 골수에서 조혈 세포의 표현형 분석을 가능하게 하여 연구자가 이러한 골수 위치에서 특별히 발생할 수 있는 조혈에 대한 섭동을 조사할 수 있도록 합니다.