표면 EBL 날조 된 나노 구조 기판을 사용하여 생체 분자의 라만 분광학 감지 강화

우리는 나노 구조 기질과 고정화된 단백질 및 압타머와 인터페이스하는 나노 생물학적 시스템의 제조 및 특성화를 설명합니다. 나노 구조 기판의 리소그래피 제작, 생체 기능화 및 표면 강화 라만 분광법(SERS) 특성화와 관련된 관련 실험 단계가 보고됩니다. 표면 고정 단백질의 SERS 검출 및 단백질-리간드 및 압타머-리간드 결합의 프로빙이 입증되었습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 고체 나노 구조 기판과 고정된 생체 분자와 인터페이스하는 공액 나노 생물학적 시스템을 제작하고 특성화하는 것입니다. 이는 초고해상도 전자빔 리소그래피 또는 EBL을 활용하여 융합된 실리카 지지체에서 작은 금속 나노 구조 배열을 얻음으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 기질을 용액에 넣고 생체 분자를 표면에 고정시켜 나노 생물학적 계면을 생성합니다.

다음으로, 계면에서 생물학적 분자를 조사하기 위해 표면 강화 라면 분광법 또는 SIRS가 사용됩니다. 결과 Sir 스펙트럼은 기질 설계에 크게 의존하는 강도를 가진 특정 분자의 라면 모드의 특성을 나타냅니다. 적외선 분광법과 같은 기존 기술에 비해 우리 접근 방식의 주요 장점은 금속 나노 구조 내의 표면 플라즈마 및 공명으로 인해 감도가 크게 향상될 수 있다는 것입니다.

우리의 접근 방식은 분자 기능화와 전자빔 리소그래피의 조합을 사용하여 쉽게 제어할 수 있는 매우 선택적인 표면을 만듭니다. 이 방법은 구조 생물학의 탐사 연구 또는 고분자에 의해 동원되는 서비스에서 나노 생물학적 계면과 관련된 다양한 장치 개발에 이르기까지 여러 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법은 의학적 진단 또는 환경 감지로 확장되는 의미를 가진 생체 분자의 구조적 특성으로 과학적으로 제공할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 전통적으로 관련이 없었던 나노 제조, 표면 기능화, 생화학 및 분광학의 측면을 포함하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.폴리메틸메타크릴레이트 또는 PMMA의 스핀 코팅을 시작하려면 기판의 레지스트 및 전도성 층을 참조하십시오. 이를 위해 진공 척이 있는 웨이퍼 스피너를 사용하고 샘플을 척 중앙에 개별적으로 놓습니다. 유리 피펫을 사용하여 PMMA 레지스트 한 방울을 샘플 중앙에 놓습니다.

그런 다음 3, 500RPM에서 60초 동안 2초의 가속 시간으로 회전합니다. 다음으로, 기판을 베이킹한 후 섭씨 180도에서 3-5분 동안 기판을 굽고, 기판을 냉각시킨 상태에서 샘플을 실온으로 냉각한 다음 스피너 척으로 돌아갑니다. 기판에 전도성 폴리머 한 방울을 펴 바릅니다.

3000RPM에서 40초 동안 기판을 회전시키고 회전 후 2초 램프를 돌립니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전자빔 리소그래피 또는 EBL 노출을 수행한 후 샘플을 섭씨 80도에서 1분 동안 굽고, 전도성 폴리머를 제거하기 위해 이온화된 물이 담긴 비커를 준비합니다. 그런 다음 현상액 혼합물이 있는 두 번째 비커를 준비하고 5분 동안 저어주고 실온을 설정합니다.

마지막으로, 핀셋을 사용하여 세 번째 비커에 헹굼제로 이소프로판올을 준비합니다. 샘플을 물에 3초 동안 넣어 전도성 폴리머 필름을 제거합니다. 그런 다음 샘플을 현상액에 넣고 핀셋을 20초 동안 천천히 위아래로 움직여 즉시 기판을 이소프로판올로 옮기고 10초 더 헹구고 샘플을 질소로 건조하기 전에 10초 더 헹구고 증발된 금속이 샘플의 전면에 증착될 수 있도록 전자빔 증발기 시스템에 샘플을 거꾸로 로드합니다.

디자인 1과 3을 위해 샘플에 10나노미터 두께의 금층을 증착하고 디자인을 위해 10나노미터 두께의 은층을 증착합니다. 초당 약 0.1나노미터의 속도로 2개. 그런 다음 초음파 처리 시스템을 권장 높이까지 물로 채우고 별도의 비커에 아세톤을 채 웁니다.

비커 바닥에 샘플이 위로 향하게 하고 비커를 잡고 샘플을 10분 동안 담가둡니다. 수조에 넣고 아세톤의 높이가 물의 높이와 일치하도록 합니다. 그런 다음 초음파 처리 시스템을 켭니다.

최대 60초 동안 초음파 처리가 발생하도록 허용합니다. design one 샘플을 준비하려면 먼저 실온에서 MUA와 에탄올의 1밀리몰 용액을 준비하고 10분 동안 초음파 처리합니다. 적절한 나노 구조 기판을 MUA 용액에 48시간 동안 담그십시오.

그런 다음 샘플을 에탄올로 세 번 헹구고 5분 동안 건조시킵니다. 실내 온도를 설정합니다. 다음으로, EDC와 증류수의 75 밀리 몰 용액을 준비합니다.

또한 마이크로 피펫 침전물을 사용하여 증류수에 15 밀리 몰의 NHS 용액을 준비하고 100 마이크로 리터의 NHS를 기판의 금에 바르고 즉시 같은 영역에 100 마이크로 리터의 EDC를 첨가합니다. MUA의 자체 조립 단층을 활성화하기 위해 1분 동안 배양합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 단백질 한 방울, 용액을 기질의 동일한 영역에 놓습니다.

샘플을 페트리 접시의 한 칸에 넣고 다른 칸에 증류수 1ml를 넣습니다. 페트리 접시를 덮개로 밀봉하고 샘플을 섭씨 5도에서 24시간 동안 보관합니다. 다음으로, 각 비이커에서 20 초 동안 별도의 비커에 샘플을 연속적으로 증류수에 3 번 헹굽니다., 헹굼 후 또는 헹굼 중에 샘플을 건조시키지 마십시오.

인산칼륨 완충액에 포도당 결합 단백질 또는 GBP의 0.9 밀리몰 용액을 준비합니다. 또한 완충액에 100 밀리몰의 DG 포도당 용액을 준비합니다. 다음으로 30마이크로리터의 D 포도당 용액과 30마이크로리터의 GBP 용액을 혼합합니다.

1 밀리리터 플라스틱 마이크로 튜브 용기와 마이크로 피펫을 사용하여 30 분 동안 배양 한 다음 20 마이크로 리터의 리간드가없는 GBP 용액과 20 마이크로 리터의 리간드 결합 GBP 용액을 준비된 기판에 증착합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 밀봉된 덮개가 있는 페트리 접시에 샘플을 섭씨 5도에서 24시간 동안 보관합니다. 샘플을 실온에서 인산칼륨 완충 용액에 세 번 헹구어 준비합니다.

3개의 시료를 설계하고, 도파민 결합 용액 또는 DBA 용액을 1마이크로몰의 농도로 희석합니다. 최종 pH가 7.4인 트리스 EDTA 완충액을 사용하여 분석 저울에서 도파민 분말을 측정하고 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 교반 비드와 5분 동안 혼합하여 도파민 용액을 5마이크로몰 농도로 준비합니다. 그런 다음 각 기판의 표면에 DBA 용액을 20마이크로리터 방울 떨어뜨리고 샘플을 페트리 접시 위에 덮고 실온에서 1시간 동안 그대로 둡니다.

인산칼륨 완충액에서 샘플을 세 번 헹군 후 클린룸 등급 와이프 위에 샘플을 똑바로 세워 기판 앞면에 필름을 유지하면서 뒷면을 건조시킵니다. 샘플을 컨트롤로 따로 설정합니다. 다음으로 도파민 용액을 5마이크로리터 방울 떨어뜨려 기존 PBS 표면에 떨어뜨립니다.

나머지 샘플을 떨어뜨립니다. 샘플을 10분 동안 배양한 후 인산칼륨 완충 용액에서 샘플을 세 번 헹굽니다. 라면 분광법을 수행합니다.

레이저 노출에 의한 증발을 피하기 위해 각 샘플을 방수 챔버에 넣으십시오. 플라스틱 주사기에 화학적으로 불활성인 고진공 그리스를 채웁니다. 그런 다음 샘플을 유리 슬라이드에 놓고 샘플을 건드리지 않고 샘플 주위에 몇 밀리미터의 그리스를 분배합니다.

기판 위에 현미경 커버 슬립을 놓습니다. 부드럽게 눌러 밀봉을 형성하면 버퍼가 진공 그리스와 접촉하지 않도록 기판과 커버 슬립 사이에 얇은 액체 계면이 생성됩니다. 광학 라만 현미경 시스템을 사용하여 레이저를 켜지 않고 샘플링할 금속 나노 패턴 영역의 표면에 초점을 맞춥니다.

표시된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라만 샘플링을 수행합니다. 다음은 용융 실리카에 금과 은색 니켈의 나노 패턴 도트 어레이입니다. 전자빔 리소그래피 또는 EBL을 사용하면 뛰어난 위치와 치수를 얻을 수 있습니다.

도트 크기와 갭 너비를 제어하는 것은 EBL 노출에 의해 제어됩니다. 은, 니켈의 금 끝의 복용량, 육각형 배열이 여기에 표시됩니다. 이러한 매우 얇은 금속층의 핵형성 거동은 불연속적인 구조를 초래합니다.

다음은 설계 1에서 기질 고정 단백질 A의 직렬 스펙트럼이며, 어레이 1의 신호 강도는 어레이 2보다 훨씬 강합니다. 어레이 3의 신호는 매우 약했습니다. 갭 간격(gap spacing)은 플라즈마 분리(plasma uncoupling) 및 라멘 산란(ramen scattering)의 표면 향상(surface enhancement)에 대한 중요한 매개변수임이 분명합니다.

다음은 리간드가 없고 리간드 결합 상태에서 서로 다른 기질 설계의 효과를 보여주는 포도당 결합 단백질의 스펙트럼입니다. 마지막으로, 도파민 결합 압타머의 스펙트럼은 리간드가 없고 리간드 결합 분자에 대해 표시됩니다. 도파민 분말의 스펙트럼은 참고용으로 표시됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 기판의 오염을 피하는 것이 중요합니다. 분광학 기술은 매우 민감하고 이 절차를 사용하여 잘못된 판독값을 가질 수 있습니다. 특정 분석물에 대해 최적의 소스 기질 설계를 식별할 수 있습니다.

그런 다음 개발 후 기판 제작의 확장성을 향상시키기 위해 non-print phy와 같은 다른 nphy 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 생화학 및 바이오 센싱 분야의 연구원들이 용액에 남아 있는 동안 특정 표면이 없는 매우 적은 양으로 생물학적 분자를 감지하는 데 도움이 되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제조 기술을 사용하여 금속 나노 구조 크기 및 필름 특성을 제어하는 방법과 다양한 생체 분자 인식 전략을 활용하여 다양한 분석물을 표적으로 삼는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다.