Name: 세포외 소포 하위 집합 분석을 위한 Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip의 다중 모드 분석 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 배우세요 다중 바이오센싱과 원자력 현미경을 결합한 무표면 플라즈몬 공명 영상 플랫폼으로 세포외 소포 하위 집합을 실시간 분석하는 방법. 이 기술은 질병 바이오마커 연구와 약물 전달 시스템 개발에 활용됩니다.

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IVETh 핵심 시설(파리)의 Kelly Aubertin과 Fabien Picot는 라만 이미징 실험으로 인정받고 있습니다. 티에리 부르노프(Thierry Burnouf, 대만 타이베이 의과대학)와 주자나 크루포바(Zuzana Krupova, 프랑스 헬린쿠르 출신)는 각각 혈소판과 소 우유 샘플에서 추출한 EV 샘플을 제공한 것으로 인정받고 있습니다. 이 작업은 Bourgogne Franche-Comté 지역과 EUR EIPHI 대학원(NOVICE 프로젝트, 2021-2024)의 지원을 받았습니다. 이 작업의 일부는 CLIPP 플랫폼과 FEMTO-ENGINEERING의 RENATECH 클린룸 시설에서 수행되었으며, 이에 대해 Rabah Zeggari에게 감사드립니다.

<ol><li>Silva, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extracellular+vesicle-based+medicinal+products%3A+A+position+paper+of+the+group+%26%2334%3BExtracellular+Vesicle+translatiOn+to+clinicaL+perspectiVEs+-+EVOLVE+France%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group &#34;Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France&#34;.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).</li>
<li>Xunian, Z., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes.</a> Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).</li>
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<li>Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+single+extracellular+vesicles+for+biomedical+applications+with+especial+emphasis+on+cancer+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations.</a> Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604(2022).</li>
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<li>Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensional+characterization+of+extracellular+vesicles+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy.</a> Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006(2017).</li>
<li>Beekman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-capture+of+extracellular+vesicles+for+individual+multi-modal+characterization+using+AFM%2C+SEM+and+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy.</a> Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).</li>
<li>Malenica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+microscopy+methods+for+morphology+characterisation+of+extracellular+vesicles+from+human+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids.</a> Biomedicines. 9 (6), 603(2021).</li>
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<li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoBioAnalytical+characterization+of+extracellular+vesicles+in+75-nm+nanofiltered+human+plasma+for+transfusion%3A+A+tool+to+improve+transfusion+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977(2019).</li>
<li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+NanoBioAnalytical+platform+for+%C2%ABon-chip%C2%BB+qualification+and+quantification+of+platelet-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles.</a> Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).</li>
<li>Ridolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+high-throughput+nanomechanical+screening+of+single+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).</li>
<li>Vorselen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+membrane+determines+mechanics+of+erythrocyte+extracellular+vesicles+and+is+softened+in+hereditary+spherocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4960(2018).</li>
<li>Hardij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+tissue+factor+bearing+extracellular+vesicles+with+AFM%3A+Comparison+of+air-tapping-mode+AFM+and+liquid+Peak+Force+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045(2013).</li>
<li>Jorgensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicle+%28EV%29+Array%3A+Microarray+capturing+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+multiplexed+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920(2013).</li>
<li>Remy-Martin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+imaging+in+arrays+coupled+with+mass+spectrometry+%28SUPRA-MS%29%3A+Proof+of+concept+of+on-chip+characterization+of+a+potential+breast+cancer+marker+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).</li>
<li>Czamara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+of+lipids%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy of lipids: A review.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Penders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+automated+Raman+trapping+analysis+of+breast+cancer+cell-derived+extracellular+vesicles+as+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers.</a> ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).</li>
<li>Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+correction+using+asymmetrically+reweighted+penalized+least+squares+smoothing%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing.</a> Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).</li>
<li>Daaboul, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+detection+of+exosomes+by+interferometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Digital detection of exosomes by interferometric imaging.</a> Scientific Reports. 6, 37246(2016).</li>
<li>Ertsgaard, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+nanogap+platform+for+sub-volt+dielectrophoretic+trapping+and+real-time+Raman+imaging+of+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles.</a> Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).</li>
<li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

최근 가장 널리 사용되고 있는 EV 식별 방법은 EV의 기원을 확인하기 위한 단백질 특이적 면역블롯팅(Immunoblotting), EV의 구조를 확인하기 위한 TEM, 샘플 부피에서 EV의 수와 크기 분포를 정량화하기 위한 NTA입니다3. 그럼에도 불구하고 (생물)의학 연구에서 EV에 대한 높은 관심과 기존 분석 도구의 한계로 인해 과학계는 EV 특성화, 차별 및 정량화를 위한 새로운 방법을 개발하게 되었습니다.
대부분의 개발은 면역 표지 또는 면역 포획의 원리와 EV 검출을 위한 고급 물리적 방법을 결합하는 데 중점을 둡니다. 이러한 접근 방식 중 일부는 나노 물체 규모에서 최대한 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 개별 EV를 식별하는 데 중점을 둡니다. 다른 사람들은 임상용으로 저렴하고 신뢰할 수 있는 글로벌 방법을 제안하는 데 더 관심이 있습니다.
다중화된 금 기판에서 EV의 생...

진단 및 치료제 1,2,3,4,5에 대한 EV 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 이 분야가 직면한 과제와 함께 이러한 소포를 정량화하거나 특성화하기 위한 다양한 접근 방식과 기술이 개발 및 구현되었습니다. EV 식별에 가장 널리 사용되는 방법은 EV의 기원을 확인하기 위한 단백질 특이적 면역블로팅 및 단백질체학, 구조를 확인하기 위한 투과 전자 현미경(TEM), 샘플 부피에서 EV의 수와 크기 분포를 정량화하기 위한 나노입자 추적 분석(NTA)입니다.
그러나 이러한 기술 중 어느 것도 자체적으로 EV 하위 집합을 특성화하는 데 필요한 모든 정보를 제공하지 않습니다. 생화학적 및 물리적 특성의 다양성으로 인한 EV의 고유한 이질성은 특히 혼합물(원유 샘플)에 포함된 EV의 경우 신뢰할 수 있고 재현 가능한 글로벌 분석을 방해합니다. 따라서 검출 및 특성화 방법은 EV에 개별적으로 그리고 일반적으로 더 빠르지만 선택적이지 않은 다른 방법을 보완하는 데 필요합니다6.
TEM(또는 cryoTEM) 또는 AFM에 의한 고해상도 이미징을 통해 나노미터 분해능 7,8,9,10,11,12로 EV의 형태 및 계측을 측정할 수 있습니다. 그러나 EV와 같은 생물학적 물체에 대한 전자 현미경 사용의 주요 한계는 샘플의 고정 및 탈수가 필요한 연구를 수행하기 위해 진공이 필요하다는 것입니다. 이러한 준비는 관찰된 구조에서 용액 내 EV 형태로 변환하는 것을 어렵게 만듭니다. 이러한 시료의 탈수를 피하기 위해, cryoTEM의 기술은 EV 특성화에 가장 적합하다(13). EV의 미세 구조를 결정하는 데 널리 사용됩니다. 생체 기능화된 금 나노입자에 의한 소포의 면역 표지는 또한 EV의 특정 하위 집단을 식별하고 복잡한 생물학적 샘플에 존재하는 다른 입자와 구별하는 것을 가능하게 합니다. 그러나 전자 현미경으로 분석하는 EV의 수가 적기 때문에 복잡하고 이질적인 샘플을 대표하는 특성화를 수행하기 어려운 경우가 많습니다.
이러한 크기의 이질성을 밝히기 위해 ISEV(International Society for Extracellular Vesicles)는 더 작은 이미지와 함께 충분한 수의 광시야 이미지를 분석하여 고해상도14의 개별 EV를 밝힐 것을 제안합니다. AFM은 EV 연구를 위한 광학 접근 방식 및 전자 회절 기술의 대안입니다. 이 기술은 하나의 지지대에 증착된 샘플을 한 줄씩 스캔하고 피드백 루프를 통해 존재하는 요소와 팁 사이의 거리를 조정하는 유연한 캔틸레버로 고정된 날카로운 팁을 사용합니다. 이를 통해 샘플의 지형을 특성화하고 형태역학적 정보(15,16,17,18)를 수집할 수 있습니다. EV는 원자적으로 평평한 기판에 증착된 후 또는 항체, 펩티드 또는 앱타머에 의해 기능화된 특정 기판 상에 포획된 후 AFM에 의해 스캔되어 다양한 하위 집단을 특성화할 수 있다(18,19). 전처리, 라벨링 또는 탈수 없이 복잡한 생물학적 시료 내에서 EV의 구조, 생체역학 및 막 생체 분자 함량을 정량화하고 동시에 조사할 수 있는 능력으로 인해 AFM은 이제 온도 및 매체의 생리학적 조건에서 미세하고 다중모수적인 방식으로 EV를 특성화하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다.
본 논문은 다중화 형태로 (생)화학적으로 기능화할 수 있는 핵심 금 바이오칩을 이용한 방법론을 제안한다. 이 기판은 표면 플라즈몬 공명에 의한 EV 하위 집합의 생체 검출을 결합한 강력한 분석 플랫폼의 초석이며, EV가 칩에 흡착/이식 또는 면역포획되면 AFM은 EV의 도량형 및 형태역학적 특성화를 가능하게 합니다. 칩에 캡처된 EV 하위 집합의 라만 시그니처와 결합된 이 분석 플랫폼을 사용하면 사전 분석 단계 없이 라벨이 없는 방식으로 생물학적 샘플에 존재하는 EV를 검증할 수 있습니다. 이 백서는 기판 준비 및 데이터 수집에서 매우 엄격한 방법론의 도움을 받는 강력한 기술의 조합이 EV 분석을 심층적이고 확실하며 강력하게 만든다는 것을 보여줍니다.
제안된 접근 방식의 원리는 금 기판을 준비하고, EV 아형을 흡착/접목 또는 포획하고, AFM으로 스캔하여 각 EV 하위 집합의 크기와 형태를 추정하는 것입니다. 또한 흡착된 EV는 라만 분광법으로 분석됩니다. 이 기판은 실제로 복잡성이 증가하는 세 가지 유형의 인터페이스, 즉 네이키드, 화학적으로 기능화된 또는 리간드 마이크로어레이를 나타낼 수 있습니다. 프로토콜의 여러 단계를 설명하기 전에 독자는 표면 플라즈몬 공명 영상(SPRi), AFM 및 분광법을 결합한 그림 1의 나노바이오 분석 플랫폼(NBA) 접근 방식의 개략도를 참조합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg"> 그림 1 : NanoBioAnalytical 플랫폼. 이 접근 방식은 (A) 표면 플라즈몬 공명 영상, (B) 원자력 현미경 및 적외선/라만(나노) 분광법을 결합하며, 모두 동일한 기판(다중화된 금 칩)에 결합됩니다. 약어: NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi = 표면 플라즈몬 공명 영상; AFM = 원자력 현미경; EV = 세포외 소포체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
핵심 금 바이오칩은 모든 무표지 특성화 기술이 이 바이오칩에서 수행되기 때문에 플랫폼의 핵심을 구성합니다. EV 특성화(글로벌/전체 EV 또는 EV 하위 집합)의 요구와 사용된 방법의 한계/요구에 따라 세 가지 유형의 금 바이오칩 표면이 개발되었습니다: "네이키드", 화학적으로 기능화된 "C11/C16" 또는 "리간드" 금 표면이라고 하는 리간드 생체 기능화.
"네이키드(naked)"라고 불리는 네이키드 바이오칩은 금에 EV를 간단하게 흡착할 수 있습니다. 사용되는 완충액을 선택하고 수동적 인 방법 (배양 후 헹굼 단계)으로 또는 흐름 (SPRi)에서 모니터링하여이 흡착을 실현할 수 있습니다. 또한, 이 수동 흡착은 전체 칩(매크로어레이)에서 실현되거나 마이크로피펫 스포터를 사용하여 마이크로어레이에 국한될 수 있습니다. "언더 플로우 절차"를 통해 조사관은 동역학과 EV 흡착 수준을 추적할 수 있습니다. 네이키드 골드 기판에 대한 이러한 접근 방식은 화학층 계면이 분석 방법(예: 라만 분광법)을 방해할 수 있을 때 채택됩니다.
"C11/C16"이라고 하는 화학적으로 기능화된 바이오칩은 EV 샘플에 대한 글로벌 관점을 갖는 것이 목적일 때 티올레이트와 1차 아미드 결합을 형성하여 금 표면에 공유 결합된 EV의 조밀하고 견고한 "카펫"을 만드는 데 사용됩니다. 실제로, 이 경우, 금은 메르캅토-1-운데칸올(11-MUOH: "C11") 및 메르캅토-1-헥사데칸산(16-MHA: "C16")의 티올레이트 혼합물에 의해 기능화되고, 티올레이트의 분획은 화학적으로 활성화되어 표적과의 공유 결합을 확립한다. 다시 말하지만, 이 전략은 수동적으로("매크로어레이" 또는 마이크로피펫 스포터를 사용하는 여러 마이크로어레이에서 배양 후 헹굼 단계) 또는 유속(SPRi)에서 실현되어 금 표면의 EV 접목 및 동역학 수준을 따를 수 있습니다.
"리간드"라고 하는 리간드 생체 기능화 바이오칩은 화학적으로 활성화되어 서로 다른 리간드(예: 항체, 수용체)를 공유 접목하여 생물학적 샘플에 공존하는 서로 다른 EV 하위 집합을 선택적으로 (친화도로) 캡처합니다.

<table><tbody><tr><td>CD41a 항체</td><td>Diaclone SAS(프랑스)</td><td>447528</td><td></td></tr><tr><td>CP920</td><td>Microparticles GmbH, 독일</td><td>448303</td><td></td></tr><tr><td>DXR3xi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma</td><td>A6272</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>혈소판 농축액에서 유래한 Evs</td><td>공동 연구: Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>소우유에서 추출한 Evs</td><td>공동 연구: Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>시그마</td><td>56845</td><td></td></tr><tr><td>귀디온&nbsp;</td><td></td><td>853.223.020</td><td></td></tr><tr><td>마그네트론 스퍼터링</td><td>PLASSYS</td><td>SAB5300165</td><td></td></tr><tr><td>메르캅토-1-헥사데칸노산</td><td>시그마</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>메르캅토-1-운데칸올&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O8001</td><td></td></tr><tr><td>산 SPIP 것들</td><td>디지털 서프</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나노위저드 3 바이오사이언스&nbsp;</td><td>브루커-JPK&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>옥틸 글루코시드(OG)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumine 항체</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Albumin Serum (RSA)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate buffer&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPR-Biacore 3000</td><td>GE Healthcare/ Cytiva 생명 과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRi Biochip</td><td>MIMENTO 기술 플랫폼</td><td></td><td>바이오칩은 클린룸, Besancon</td></tr><tr><td>SPRi Plex II</td><td>Horiba Scientific</td>에서 자체 생산되었습니다.<td></td><td></td></tr><tr><td>설포-NHS</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

세포외 소포 하위 집합 분석을 위한 multiplexed surface plasmon resonance imaging chip의 다중 모드 분석 플랫폼

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

세포외 소포(EV)는 직경이 50나노미터에서 수백 나노미터에 이르는 모든 세포에서 생성되는 막 유래의 작은 소포이며 세포 간 통신 수단으로 사용됩니다. 그들은 다양한 질병에 대한 유망한 진단 및 치료 도구로 부상하고 있습니다. 크기, 구성 및 함량이 다른 EV를 생산하기 위해 세포가 사용하는 두 가지 주요 생물 발생 과정이 있습니다. 크기, 구성 및 세포 기원이 매우 복잡하기 때문에 특성 분석에는 분석 기술의 조합이 필요합니다. 이 프로젝트에는 EV의 하위 집단 특성화를 위한 처리량이 증가한 차세대 다중모수 분석 플랫폼의 개발이 포함됩니다. 이 목표를 달성하기 위해 이 작업은 그룹이 구축한 나노바이오 분석 플랫폼(NBA)에서 시작되며, 이를 통해 마이크로어레이 바이오칩에 갇힌 소포 표적의 원자력 현미경(AFM)에 의한 도량형 및 형태역학적 분석과 다중화된 생체 감지 방법의 조합을 기반으로 EV에 대한 독창적인 조사를 수행할 수 있습니다. 목표는 라만 분광법에 의한 표현형 및 분자 분석으로 이 EV 조사를 완료하는 것이었습니다. 이러한 개발을 통해 임상적 잠재력이 있는 생물학적 유체에서 EV 하위 집합을 구별하기 위한 다중 모드의 사용하기 쉬운 분석 솔루션을 제안할 수 있습니다

리간드 그라프팅을 위한 최적의 pH 조건 결정 바이오칩을 제조하는 데 사용되는 다양한 리간드는 pH 및 티올레이트 화학 층과 상호 작용할 수 있는 가용성의 함수로 테스트됩니다(그림 3). 리간드는 상이한 pH 값에서 아세테이트 완충액에 희석되고, C11C16 층으로 화학적으로 기능화된 바이오칩 상에 주입된다. 용액을 표면에 무작위로 주입하고 각 리간드 주입 후 세제(40mM에서 OG)를 주입하여 기준선을 회수합니다. 이 사전 농도 테스트를 통해 각 리간드 이식에 대한 최적의 pH를 결정할 수 있습니다. 도 3에 제시된 예에서, 리간드 그라프팅의 기울기 및 수준 측면에서 가장 좋은 pH로서 pH 6이 선택되었다.
SPRi CCD 이미지 SPRi 기계에 삽입한 후 바이오칩에 등...

이 논문은 세포외 소포 하위 집합의 특성화를 위해 처리량이 증가한 차세대 다중 매개변수 분석 플랫폼을 제안합니다. 이 방법은 마이크로어레이 바이오칩에 갇힌 소포 표적을 검증하기 위해 원자력 현미경에 의한 도량형 및 형태역학적 분석과 라만 분광법의 결합을 기반으로 합니다.

세포외 소포 하위 집합 분석을 위한 Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip의 다중 모드 분석 플랫폼

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

EV의 복잡한 특성으로 인해 관심 있는 하위 모집단을 인식하기 어렵고 이 프로토콜은 표현형, 크기 프로필 및 나노기계적 특성으로 이를 감지할 수 있습니다. 이러한 기술 조합은 비표지 분석법으로, 상태 매질과 혈장에서 EV를 실시간으로 감지할 수 있습니다. 이 기술은 병리학의 생물 지표로 사용되거나 약물 전달을 위한 나노 입자로도 사용되기 위해 관심 있는 나노 입자의 깊은 하위 집합을 특성화할 수 있습니다.매우 민감한 방법이기 때문에 관심 샘플을 주입하기 전에 바이오칩 준비에 주의를 기울이는 것이 필수적입니다. 칩을 코팅하고 기능화한 후, 바이오칩을 200밀리몰 에틸 디메틸아미노프로필 카르보디이미드/N-하이드록시숙신이미드와 리터당 50밀리몰의 N-하이드록시숙신이미드의 혼합물에서 실온의 어두운 곳에서 최소 30분 동안 배양합니다. 스폿터를 사용하여 300나노리터의 리간드 용액을 추가하고 바이오칩을 음파 수조 아래에서 30분 동안 배양합니다.초순수로 바이오칩을 상단에서 세척합니다. 프리즘과 굴절률이 동일한 오일 방울을 추가하여 바이오칩과 프리즘 사이에 균일한 얇은 층을 만들고 바이오칩과 굴절률이 동일한 프리즘에 부드럽게 놓습니다. 표면 플라즈몬 공명 영상의 경우 SPRi 시스템에 바이오칩을 장착합니다.소프트웨어 왼쪽의 드롭다운 메뉴로 이동하여 작업 디렉토리를 클릭합니다. 다른 지점이 보이는 이미지를 찾아 이 이미지를 클릭하여 선택합니다. 그런 다음 리간드 패밀리의 이름을 쓰고 Finish species definition(종 정의 완료)을 클릭합니다.커서가 있는 검은색 선을 최적의 작업 각도로 끕니다. 미러를 작업 각도로 이동을 클릭하고 작업 각도를 선택합니다. 이제 Kinetics를 클릭하십시오.소프트웨어에서 사용자에게 음성 컨트롤을 정의하라는 메시지가 표시되면 이 시점에서 음성 컨트롤 없음을 선택합니다. 쥐 혈청 알부민을 분당 50 마이크로 리터로 4 분 동안 주입합니다. 에탄올아민을 분당 20마이크로리터의 속도로 10분 동안 주입하여 표면에 여전히 존재하고 반응성인 카르복실기를 비활성화합니다.그 후, 4분 동안 분당 50마이크로리터의 속도로 40밀리몰 OG를 주입하여 바이오칩을 세척합니다. 생체 기능화된 칩에 특정 농도의 세포외 소포체를 주입하면서 동시에 다른 지점에서 소포의 상호 작용 동역학을 따릅니다. 또한 반사율 값과 상호 작용 수준을 결정합니다.안정화되면 칩에 글루타르알데히드를 주입하여 AFM 이미징을

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

우리는 다수의 미세 채널에서 입자의 검출 및 사이징 다중화, 코드 분할 다중 접속 (CDMA)과 저항 펄스 센서 (RPS)를 결합하는 집적 표면 전극 네트워크와 미세 유체 플랫폼을 보여준다.

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

이 프로토콜에서 우리는 형광 기반 나노-추적 분석 하 여 인간의 전체 혈액에서 세포 외 vesicles의 신속한 격리 및 특정 마커의 특성화에 대 한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 제시 결과 재현성의 높은 레벨을 표시 하 고 셀 문화 supernatants 조정 될 수 있습니다.

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

질병 및 악성 세포에 대 한 엑 소 좀 유래 바이오 마커의 임상 번역은 신속 하 고 정확한 정량 방법의 결여에 의해 방해 된다. 이 보고서는 작은 부피의 혈 청 또는 혈장 샘플에서 특정 엑 소 좀을 정량화 하는 저 배율 어두운 영역 현미경 이미지의 사용을 설명 합니다.

종양 유래 엑 소 솜을 정량화 하는 나노 플라즈마-강화 된 산란 및 저 배율 현미경 이미징 사용

세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

최신 세대의 EV 특성화 도구는 여러 파라미터에 대한 단일 EV 분석이 동시에 가능합니다. 나노유세포분석은 표지 없이 45nm보다 큰 모든 생물학적 입자를 측정하고 다양한 형광 표지 기술로 아집단의 특정 특성을 식별합니다.

나노유세포분석을 통한 단일 세포외 소포 막횡단 단백질 특성 분석

여기에서는 이중 리포터 유세포 분석 시스템을 사용하여 안지오텐신 변환 효소-2 결합 자기 마이크로스피어에 의해 포착된 온전한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스 입자에서 두 개의 고유한 스파이크 단백질 에피토프를 동시에 검출하는 새로 개발된 다중 형광 면역분석법에 대해 설명합니다.

Multiplex Dual-Reporter Strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링

여기에서는 인간 피험자의 눈물 및 타액과 같은 생물학적 액체에서 수집된 세포외 소포체(EV)의 특성화 방법을 보여줍니다. 이 방법에 사용된 스캐너는 샘플의 1μL에서 EV의 표현형, 크기 및 총 입자 수를 감지할 수 있습니다.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

여기서는 라벨 없는 표면 증강 라만 분광법(SERS)을 사용하여 개별 작은 세포외 소포(sEV)를 분석하는 프로토콜을 제시하여, 최소 침습 질환 진단과 sEV의 치료 전달 매개체 평가를 가능하게 합니다.

질병 진단 및 치료에 개별 sEV의 표면 강화 라만 산란 기반 생체감지 적용 탐구

분석 초원 심 분리기 (AUC)은 샘플 셀이 샘플과 참조 버퍼와 실험을하는 동안을 보유하고 있으며 고진공 및 60,000 RPM으로 로터 속도 최대 노출됩니다. 이 동영상은 AUC 실험이 매우 중요한 구성 요소의 조립, 로딩 및 정렬에 필요한 세부 사항에 대한 엄격한 관심을 입증합니다.

조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

배우세요 다중 바이오센싱과 원자력 현미경을 결합한 무표면 플라즈몬 공명 영상 플랫폼으로 세포외 소포 하위 집합을 실시간 분석하는 방법. 이 기술은 질병 바이오마커 연구와 약물 전달 시스템 개발에 활용됩니다.

세포외 소포 하위 집합 분석을 위한 Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip의 다중 모드 분석 플랫폼

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