질병 진단 및 치료에 개별 sEV의 표면 강화 라만 산란 기반 생체감지 적용 탐구
March 13th, 2026
여기서는 라벨 없는 표면 증강 라만 분광법(SERS)을 사용하여 개별 작은 세포외 소포(sEV)를 분석하는 프로토콜을 제시하여, 최소 침습 질환 진단과 sEV의 치료 전달 매개체 평가를 가능하게 합니다.
우리는 표면 강화 라만 산란과 머신러닝을 결합하여 암 조기 진단을 수행하고, 생의학 응용 분야도 제공합니다. 주요 실험적 도전 과제는 엑소좀 샘플의 고유한 이질성, 매우 복잡하고 고차원 분광 데이터이며, 이는 낮은 신호 대 잡음비로 인해 더욱 악화된다. 우선, 약 5마이크로리터의 작은 세포외 소포 샘플을 지정된 혈장 기판에 피펫팅합니다.
기질을 건조기에 넣어 방울이 완전히 마르도록 약 15분간 기다립니다. 그 후 건조된 기질을 공초점 라만 현미경으로 옮깁니다. 계측기 소프트웨어 WiRE 버전 4.4를 사용하여 데이터 수집을 시작합니다.
여기 레이저를 785나노미터, 5밀리와트로 설정하고 시스템을 보정하세요. 금 기판에서 스펙트럼을 얻으려면, 300 x 300마이크로미터 영역에서 정적 모드로 단일 소포를 찾기 위해 정적 스캔을 수행하며, 10마이크로미터 스텝 크기, 0.1초 노출, 50% 레이저 출력을 사용합니다. 소포를 찾으면, 1마이크로미터 단계, 0.2초 노출, 50% 레이저 출력을 사용하여 5x5 격자 내에서 정적 모드로 고해상도 지도 작성을 수행합니다.
다음으로, 다음과 같은 스캔을 통해 그래핀 기판에서 스펙트럼을 얻습니다. 초기 원시 스펙트럼을 스크리닝하고 과도한 노이즈나 비정상적인 스펙트럼 형태를 보이는 것은 제외합니다. 각 스펙트럼에 사비츠크-골레이 필터를 적용하여 형광 배경을 줄이고 스펙트럼 데이터를 부드럽게 만듭니다.
각 스펙트럼의 신호 대 잡음비를 피크-기준선 방법 또는 표준편차 방법을 사용하여 계산합니다. 각 스펙트럼에 대해 신호 대 잡음비를 대표 라만 밴드에서 기준선 뺀 후 피크 강도와 잡음의 표준편차의 비율로 계산합니다. 원래 스펙트럼에서 창 크기 11과 다항식 차수 3을 사용하여 Savitsky-Golay 평활화 버전을 빼서 노이즈를 추정합니다.
모든 스펙트럼을 신호 대 잡음비 상승순으로 순위를 매기고, 진단 피크의 지속성을 평가하여 임계값을 결정합니다. 그 다음 이 피크 중 하나가 기본 잡음으로 사라지는 지점에 임계점을 설정하는데, 이는 신호 대 잡음비 28에 해당합니다. 신호 대 잡음비 임계값 28 미만인 스펙트럼은 제외하여 고품질 스펙트럼만 보존하여 후속 분석을 위해 사용할 수 있습니다.
그리고 남은 각 스펙트럼을 최대 피크 강도 또는 곡선 아래 전체 면적으로 정규화합니다. 위암 환자나 건강한 대조군과 같은 출처에 따라 각 스펙트럼 측정에 라벨을 붙이세요. 라벨이 붙은 스펙트럼 데이터를 선형 커널을 가진 지지 벡터 분류기에 입력하고, 층화된 셔플 분할을 적용하여 각 접드에서 균형 잡힌 표현을 보장하기 위해 5배 교차 검증을 수행합니다.
이제 모든 폴드에서 정확도 지표를 평균화하여 전체 모델 성능을 평가합니다. 마지막으로, 시각화를 위해 표면 강화 라만 산란 데이터셋의 차원을 줄이기 위해 선형 판별 분석(LDA)을 사용하세요. 훈련된 선형 판별 분석 모델을 사용하여 표본 그룹 간 직접 분류를 수행합니다.
라만 스펙트럼과 해당 평균 스펙트럼을 분석하면, 조직, 혈액, 타액 샘플에서 분리된 단일 작은 세포외 소포에서 얻은 각 샘플 유형마다 뚜렷한 분자 서명이 드러났습니다. 선형 식별 분석 결과, 세포외 소포 데이터가 출처 조직, 혈액 또는 타액에 따라 명확히 군집되어 있음을 보여주었습니다. 지지 벡터 기계 분류기를 이용한 이진 분류는 조직 샘플에서 90.1%의 최고 정확도를 기록하며, 혈액은 70.9%, 타액은 60.7%입니다. LDA 기반 분류는 조직 유래 세포외 소포 데이터에서 건강한 암과 위암 샘플을 명확히 분리합니다.
혈액과 타액에서 유래한 세포외 소포 데이터에 대한 유사한 LDA 기반 분류 분할은 건강한 샘플과 암 샘플 간 최적의 분리가 떨어지는 것을 보였다. 그래핀 없이 독소루비신 배양 소포의 라만 스펙트럼은 약 1,081, 1, 206, 1,440 센티미터에서 일관된 피크를 보였다. 그래핀의 경우, 약 1,350 역센티미터의 D 피크와 약 1,580 역센티미터의 G 피크가 내부 표준으로 관찰되었습니다.
독소루비신 피크가 442 역센티미터에 있는 그래핀 G 피크의 비율은 약물 농도가 높아지고 잠복 시간이 길어질수록 증가했습니다. 조기 진단 가능성이 있는 질병 원인을 구별하기 위해 단일 소포 생화학적 지문 인식을 확립했습니다. 우리 기법의 세 가지 주요 장점입니다.
첫째, 매우 민감합니다. 둘째, 비침습적이라는 점입니다. 셋째, 입자를 분해하거나 물리적으로 분해할 필요가 없다는 점입니다.
앞으로는 스펙트럼 프로필을 단백질체 프로필과 연관시키고, 이를 통해 엑솜 내용과 세포 통신, 수송 같은 특정 기능과 연관시키는 데 도움을 줄 것입니다.
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Overview
This protocol presents a label-free analytical platform that integrates surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) with machine learning to detect and molecularly profile individual small extracellular vesicles (sEVs). The method enables high-specificity detection and classification of disease states, such as distinguishing gastric cancer from healthy controls, and quantifies drug loading in single vesicles, supporting both diagnostic and therapeutic applications.
Key Study Components
Area of Science
- Analytical chemistry
- Biomedical diagnostics
- Nanotechnology
- Machine learning applications in biosensing
Background
- Small extracellular vesicles (sEVs) are promising biomarkers for disease diagnosis and therapeutic monitoring.
- Traditional detection methods often require labeling or lysis, which can limit sensitivity and throughput.
- SERS provides molecular fingerprinting capabilities with high sensitivity.
- Machine learning enhances the analysis of complex, high-dimensional spectral data.
Purpose of Study
- To develop a label-free, high-throughput platform for single-vesicle analysis using SERS and machine learning.
- To distinguish between healthy and disease states (e.g., gastric cancer) using sEVs from various biofluids.
- To quantify drug (doxorubicin) loading in individual sEVs for therapeutic assessment.
Methods Used
- Isolation of sEVs via size exclusion chromatography or ultracentrifugation.
- Deposition of sEVs onto engineered plasmonic gold nanopyramid 2D array substrates.
- SERS data acquisition using a confocal Raman microscope with specific laser settings and mapping protocols.
- Preprocessing of spectra (noise filtering, normalization, signal-to-noise thresholding).
- Machine learning analysis using support vector classifiers (SVC) and linear discriminant analysis (LDA) for classification and visualization.
- Use of graphene-coated substrates as internal standards for drug quantification.
Main Results
- Distinct molecular signatures were observed for sEVs from tissue, blood, and saliva.
- Classification accuracies for distinguishing gastric cancer from healthy controls were 90.1% (tissue), 70.9% (blood), and 60.7% (saliva).
- LDA revealed clear clustering of sEVs by source and disease state, especially for tissue-derived samples.
- Quantification of doxorubicin loading in single sEVs was achieved, with graphene peaks serving as internal standards.
Conclusions
- The platform enables sensitive, non-invasive, and label-free detection of sEVs at the single-vesicle level.
- It allows for high-throughput analysis and captures population heterogeneity, aiding early disease detection.
- The method supports both diagnostic and therapeutic applications, including drug loading assessment.
