Name: Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 배우세요 마이크로토로이드 광 공진기를 이용한 라벨 없는 단일 분자 검출 기법을 통해 생화학적 연구에서 단일 분자 및 초소형 나노입자를 정밀하게 감지하는 방법을 익히세요. 이 기술은 단백질 폴딩과 결합 역학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences)의 국가연구서비스상(National Research Service Award, T32GM07616)의 지원을 받았습니다.

1. 실험 설정 및 샘플 준비 <ol><li> 리소그래피를 사용하여 에칭하고, 이전에 설명 된 바와 같이 6 과정을 용융 microtoroids를 제작. 일반적으로 80 내지 100 ㎛의 주요 직경, 2 ㎛의 작은 직경을 갖는 실리콘 웨이퍼 (칩)의 상단에 microtoroids를 제작. </li><li> 대략의 섬유 스풀에서 단일 모드 광섬유 (125 μm의 클래딩, 4.3 μm의 모드 필드 직경)의 미터 긴장을 풀고. </li><li> 광섬유의 풀린 부분의 중간에, 와이어 스트리퍼를 사용하여 광 화이버의 주위에 폴리머 코팅재의 작은 세그먼트 (2.5 cm)를 스트립. 주 :이 microtoroid 순간적으로 커플 광에 사용되는 광섬유의 부분이다. </li><li> 이소프로판올 알코올과 무료로 닦아 보풀 제거 섬유를 청소합니다. </li><li> 자기 클램프로 만든 섬유 홀더를 사용하는 대신에 섬유의이 부분을 잡으십시오. </li><li> meltin으로 ~ 500 nm의 얇은 스트립 섬유g 및 수소 토치가 60㎛ / 분에서 서로 반대 방향으로 움직이는 두 개의 스텝퍼 모터를 사용하여 당기는. ~ 10mm 높이 있어야 화염의 상부 내부에 광섬유를 위치. 광섬유를 통해 전송이 (오프 섬유 점멸로부터 측 방향으로 산란되는 광을 보면서)이나 오실로스코프에 연결된 포토 다이오드에 섬유를 연결하여 시각적으로 감시 할 수있는 요동 정지시 섬유 당기는 중지 . </li><li> 광섬유의 한쪽 끝을 절단 및 베어 섬유 어댑터에 삽입합니다. 수광부의 입력에 섬유의 끝을 놓습니다. </li><li> 섬유 커플 광섬유 결합기를 이용하여 레이저 광 스풀의 타단. </li><li> 에폭시 또는 양면 테이프를 사용하여 샘​​플 홀더의 상단에있는 microtoroid 칩 (스테인레스 스틸, 37.8 mm X 6.4 mm X 3.2 mm)를 놓습니다. </li><li> (3 축 나노 포지셔닝 포함하는 위치 결정 스테이지의 상부에 샘플 홀더를 마운트 N3 축 마이크로 미터 위에 anocube) 단계 (장치 목록 참조). 진동을 최소화하기 위해 공압 고립 된 광학 테이블에 모든 실험을 수행합니다. </li><li> 조대 위치 3 축 마이크로 미터를 사용하여 샘​​플 칩. </li><li> 나노 포지셔너를 사용하여 광섬유에 microtoroid 함유 칩과 평행을 맞 춥니 다. 참고 : 입력 광 (~ 633 ㎚)의 한 파장의 거리에 microtoroid을 맞 춥니 다. 이 프로세스의 시각화를위한 두 개의 촬상 컬럼 사용 상단과 칩의 측면 상에 위치 (대물 렌즈 및 카메라를 가진 튜브를 장비 목록 참조). </li><li> 인라인 편광 제어기를 사용하여 광섬유를 통해 지향 레이저 광의 편광을 최적화하는 편광을 조정 노브 (장치 목록 참조). 주 : 광섬유의 전송에서 측정 된 딥 좁은 나타날 때 최적의 편광이 달성된다. 오실로스코프 (자세한 내용은 단계 2.2 참조)이 수영을 관찰한다. </li><li> 구축스페이서로서 유리 현미경 슬라이드를 사용하여 샘​​플 스테이지 위에 유리 커버 슬립을 epoxying 의해 샘플 챔버. 참고 : 전체 설치를 포함하는 플렉시 유리 인클로저는 공기 흐름을 최소화하는 데 유용 할 수 있습니다. 작은 개구는 튜브를 사용하여 펌핑 할 수있는 솔루션을 수 있도록 남아 있어야합니다. </li><li> 열적 RT 수조 (~ 500 ml)에 1 시간 동안 ≥ 입자 현탁액 또는 단일 분자 수용액 평형. 참고 : 시료는 제조 업체, 예를 들어, PBS 또는 HEPES에서 지정한 관련 버퍼를 사용하여 마이크로 원심 튜브에 원하는 농도로 희석한다. 어떠한 바인딩 이벤트가 검출되지 않은 경우, 버퍼의 염 농도를 증가시킨다. </li><li> ~ 2 초 동안 솔루션 (1 ml)을 간략하게 포함 소용돌이 입자. </li><li> 1 mL의 샘플에서 챔버 내로 입자 함유 용액을 주입 / 1ml를 주사기 펌프를 사용하여 민. </li><li> 샘플 챔버가 작성되면, 주사기 펌프의 전원을 끄십시오. </li><li> 기록 데이터를 최소화하기 전에 30 초를 기다립니다측정에 영향을 미칠 수있는 유체의 흐름으로 인한 기계적인 진동의 영향. </li></ol> 2. 주파수 잠금 <ol><li> 커플 링은 유체의 주입으로 인해 방해되기 때문에, 나노 위치로 샘플 홀더를 이동시킴으로써 광섬유에 토 로이드 - 커플 재. </li><li> 다양한 파장 통해 컴퓨터 제어 입력을 레이저 스캐닝하여 microtoroid의 공진 파장을 찾아. 레이저의 파장을 조절하는 레이저 컨트롤러 내의 압전 소자에 삼각파 전압 신호를 전송하여이 단계를 수행한다. 이 파장에서 물에 빛의 낮은 흡수가로 가시 광선 (2.5 nm의 ± 635 나노 미터)를 사용하여 실험을 수행합니다. </li><li> 자동 평형 수광부로 광섬유의 출력을 연결하여 광섬유를 통해 광 투과율을 측정한다. BNC 케이블을 사용하여 오실로스코프에 수광부의 출력을 연결합니다. O 관찰n은 오실로스코프는 microtoroid의 공진 파장에서, 광섬유를 통해 전송 방울있다. </li><li> 케이블을 통해 피드백 컨트롤러 (장비 목록 참조) 고정 주파수의 주요 입력 수광부의 출력을 연결합니다. </li><li> 2 kHz의 디더 주파수와 19 FM의 파장 진동의 진폭과 잠금 최고 수준의 피크를 사용하여 자동 잠금 모드에서 주파수 잠금 피드백 제어를 실행합니다. 경험적으로 지글러 - 니콜스 튜닝 규칙 (14)을 사용하여 소프트웨어 창의 비례 적분 미분 설정을 설정한다. 참고 :이 값은 모든 실험의 시작 부분에 한 번 설정 만하면됩니다. </li><li> microtoroid의 공진 파장 레이저의 파장을 자동 - 잠금. 샘플 챔버를 충전 한 후이 단계를 수행합니다. 주 : 파장 변화가 너무 큰 경우, 피드백 제어기는 잠금을 잃게 자동 공진 파장의 위치를​​ 찾기 위해 스캔 모드로 전환. 이 OC파장에 대한 CURS 약 1 선폭 (여기 조사 모든 시스템에 대해 적어도 600 FM)보다 큰 이동합니다. </li><li> 24 비트 데이터 수집 카드를 사용하여 20 kHz에서 피드백 제어기의 출력을 기록한다. 데이터 수집 소프트웨어를 통해 텍스트 파일로 데이터를 내보낼. </li></ol> 3. 데이터 처리 및 분석 <ol><li> 푸리에 MATLAB에서 데이터를 변환. </li><li> 낮은 2 kHz에서의 부과 디더 주파수를 제거하기 위해 1 kHz에서 컷오프와 &quot;벽돌 벽&quot;필터를 사용하여 데이터를 전달 (보충 코드 스크린 샷 1 파일 참조). </li><li> 계산적 노치는 16 Hz의 윈도우 크기를 사용하여 데이터를 필터링. 참고 :이이 경우에, 소음의 알려진 원인을 제거하기위한 것입니다, 60 Hz의 전자 라인 노이즈 및 고조파 (레이저 드라이버에서 오는)뿐만 아니라 100 Hz에서의 고조파 (보충 코드 스크린 샷 1 파일 참조). </li><li> 역 푸리에 변환은 시간 도메인으로 데이터를 다시 변환. </li><li> 메디안 필터 창을 이용하여 상기 데이터1,001 샘플의 크기 (보충 코드 스크린 샷 2 파일 참조). </li><li> Kerssemakers 등. (15)의 스텝 찾는 알고리즘을 사용하여 공진 파장의 단계 변화를 찾습니다. </li><li> 각 바인딩 단계의 진폭의 히스토그램을 생성합니다. </li><li> 식을 사용하여 입자 크기를 계산한다. (1) (토론 참조). </li></ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
<li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnight%2C+A+%22Single+molecule+biology%22">Single molecule biology</a>. , Elsevier/Academic. (2009).</li>
<li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li>
<li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li>
<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
<li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li>
<li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li>
<li>Åström, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%85str%C3%B6m%2C+KJ+%22Feedback+systems+%3A+an+introduction+for+scientists+and+engineers%22">Feedback systems : an introduction for scientists and engineers</a>. , Princeton University Press. (2008).</li>
<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
<li>Su, T. -T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Label-free+detection+of+single+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%22">Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators</a>. , California Institute of Technology. (2014).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

입자가 결합 된 바와 같이, 환형 상승의 공진 파장 (λ). 입자가 바인딩 해제하면, 공진 파장은 대응 (스텝 - 다운 이벤트)를 감소시킨다. 입자 직경 (d)는 각각의 파장 단계의 진폭 히스토그램을 통해 결정될 수있다. 각 파장 단계의 높이가 결합 입자의 크기 변화로 인해 입자가 결합 microtoroid의 위치로 인해 변한다. 입자는 전기장 (E 0 맥스)이 최대가 microtoroid의 적도에 결합 할 때, 공진 파장 (단차)에서의 최대 변화가 발생한다. 이 최대 단차 (Δλ)은 식을 통해 입경에 관한 것이다. 은 입자 반경은 (1) 8, D는 입자 경계의 굴절 매체와 그 주변의 인덱스에 기초하여 유전 상수이고, V의 m은 Light 미사용의 모드 볼륨microtoroid 내의 t는 유한 요소 시뮬레이션을 통해 결정 <s...

단일 분자 검출 실험은 질병의 조기 진단을위한 바이오 센서에 사용되는 분석 물의 양을 감소시키는 데 유용하며, 분자 (3)의 기본 특성을 조사하기위한. 이러한 실험은 일반적으로 라벨 그러나, 라벨은 항상 이벤트가 검토되고 교란 수, 비용 증가, 특정 단백질을 얻을 수없고, 특히 현장 실험 또는 포인트 외 실시간 들면 불편할 수있다하여 수행 의료 진단. 라벨없는 바이오 센서에 대한 현재 금 표준 그러나 상업적 표면 플라즈몬 공명 시스템은 전형적 nm 인 검출 순서에 전형적인 하한을 가지고, 표면 플라즈몬 공명 (4)이다. 최근, 광 공진기는 라벨이없는 단일 분자 biodetection 5 유망 기술로 등장했다. 장기 (NS)에 기초하여 광 공진기 일 -6,7-의 광 가둠. 빛은 순간적이다일반적으로, 광섬유를 통해 이러한 장치에 연결된다. 섬유 거치지 광의 파장 공진기의 공진 파장과 일치 할 때, 효율적으로 공진기에 커플 빛. 이 결합 된 광은 완전히 내부 공진기의 둘레 근방에 소 산장을 발생 공진기의 공동 내에 반영한다. 입자는 공진기, 입자 (8)의 체적에 비례하여 변화 공진기의 공진 파장 산장 인드에 진입. 검출 능력의 관점에서, 미세 공진기 이전 단일에게 인플루엔자 바이러스 입자 (100 ㎚) 9,10 검출하는데 사용되어왔다. 최근 plasmonically 향상된 미세 광학 공진기 그러나이 접근법은 드 0.3 μm의 (2)에 입자 포획 영역을 제한하고, 분자 (11) 및 8 량체 올리고 12 알부민 단일 소 혈청을 검출하는데 사용되어왔다바이스. 큰 캡처 영역 바이오 센서는 입자 검출의 가능성을 최대화 이상적이다. 큰 (&gt; 100 μm의 2) 캡쳐 영역과 현재 솔루션 기반의 라벨없는 바이오 센싱 기술은 폴리스티렌 입자를 ≥ 25 nm의 검출에 한정되어있다. 우리는 용액 중의 분자의 단일 시간 - 분해 검출 할 수있는 에바 네 슨트 광 위스퍼 링 공진기 (FLOWER) (13) (도 1)을 잠그기 주파수라고도 광 공진기 기술 기반의 라벨없는 바이오 센싱 시스템을 개발 하였다. FLOWER 주파수 로크 피드백 제어, 평형 검출 한 단일 단백질 분자로 내려 작은 입자를 검출하는 필터링 연산과 결합 microtoroid 광학 공진기의 길이 광자 수명을 이용한다. 주파수 록의 이용은 스위프 또는 레이저 파장을 스캐닝 할 필요없이, 입자 결합으로 시스템이 항상 microtoroid의 이동 공명을 추적 할 수 있도록큰 범위. 꽃의 원리 플라즈몬 강화를 포함하는 다른 기법의 검출 능력을 향상시키기 위해 사용될 수있다. 다음 것에서, FLOWER를 행하는 절차를 설명한다.

<table><tbody><tr><td>가변 다이오드 레이저</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>레이저 컨트롤러</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>주파수 잠금 피드백 컨트롤러</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>자동 균형 포토리시버</td><td>Newport</td><td>모델 2007</td><td></td></tr><tr><td>인라인 편광 컨트롤러</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>24비트 데이터 수집 카드</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 인터루킨-2</td><td>피어스 생명</td>공학 <td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>20nm 폴리스티렌 비드</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>광학 테이블</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>이미징 컬럼용 대물 렌즈</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>이미징 컬럼(어댑터 튜브)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>이미징 컬럼용 고해상도 CCD 카메라</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

아래로 단일 분자 한계 분자의 작은 농도를 검출하는 것은 이러한 질병의 조기 발견 및 분자의 행동에 기초 연구 등의 분야에 영향을 미친다. 단일 분자 검출 기술은 일반적 그러나, 라벨 비용 및 복잡성을 증가, 항상 사용할 수 없으며, 이벤트가 연구되고있다 교란 형광 태그 또는 양자점과 같은 라벨을 사용한다. 광학 공진기는 라벨의 사용없이 하나의 분자를 검출하는 수단으로서 유망 나왔다. 현재 용액에 비 plasmonically 향상된 베어 광 공진기 장치에 의해 검출 된 가장 작은 입자는 25 nm의 폴리스티렌 구 1이다. 우리는 위스퍼 에바 네 센트 광 공진기 수용액 2 라벨없는 단일 분자 검출이 한계를 능가 달성 (FLOWER)를 잠그기 주파수로 알려진 기술을 개발했다. 신호 강도가 입자 볼륨 확장, 우리의 작품은&gt; 100 배의 양식 개선을 나타냅니다NT 기술의 현재 상태 위에 잡음비 (SNR)에 신호한다. 여기 FLOWER 뒤에 절차 야전에서의 사용을 증가시키기위한 노력으로 제시된다.

이벤트를 결합 입자는 분명히 시간 (그림 2A)를 통해 microtoroid의 공진 파장의 단계와 같은 변화로 볼 수 있습니다. 이러한 단계 높이는.도 2b에 도시 된 바와 같이, 히스토그램은 각각 2-4, 대표 엑소 좀의 결합에서 트레이스 (nanovesicles), 5 nm의 실리카 비드, 및 단일 인간 인터루킨 2 분자를 표시하는 도면이다. 계단 형 이벤트 입경 확장된다는 사실은이 기술이 정확하게 수행되었음을 나타낸다. 후술하는 바와 같이 이것은, 단차 (도 2b)의 히스토그램을 생성하고, 이론적으로 예측 관찰 최대 스텝 높이를 비교하여 분석 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/5...

우리는 용액에서 단일 분자를 감지할 수 있는 FLOWER(Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator)로 알려진 광학 공진기 기술을 기반으로 하는 무표지 바이오센싱 시스템을 개발했습니다. 여기에서는 이 작업의 이면에 있는 절차를 설명하고 제시합니다.

Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

이 절차의 전반적인 목표는 광학 공진기 기술과 주파수 잠금(frequency locking) 기반의 기술을 사용하여 라벨 없이 단일 분자와 초소형 나노입자를 검출하는 것입니다. 이 방법은 단백질 접힘 및 결합 역학과 같은 생화학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표적 분자를 검출하기 위해 라벨을 붙일 필요가 없다는 점입니다.이 기술을 위한 준비 과정은 마이크로 OID 칩을 광섬유에 결합하는 작업을 포함합니다. 먼저, 마이크로 OID 칩을 준비하십시오. 이는 마이크로 OID가 제작된 약 6.5 millimeter by 5.5 millimeter 크기의 실리콘 칩입니다.이 이미지에서 보듯, micro OID는 장축 직경이 80~100 µm이고 단축 직경이 2 µm입니다. 우선 칩은 따로 두고, 칩을 결합하기 위해 광섬유를 준비하십시오. 스풀에 감긴 싱글 모드 광섬유를 사용하여 약 1m 정도를 풀어냅니다.와이어 스트리퍼를 준비하고 풀려 있는 광섬유의 대략 중간 지점을 잡습니다. 스트리퍼를 사용하여 광섬유에서 2.5 centimeter 길이의 폴리머 코팅 부분을 제거합니다. 이렇게 코팅이 제거된 영역이 광섬유의 결합 영역이 됩니다.파이버를 스트리핑한 후, 보풀 없는 와이프와 이소프로판올 알코올을 사용하여 스트리핑된 영역을 세척합니다. 다음으로, 마그네틱 클램프가 있는 파이버 홀더를 사용하여 세척된 부분을 고정합니다. 다음 단계에서는 스테퍼 모터를 배치하여 파이버를 서로 반대 방향으로 당기도록 합니다.피복이 벗겨진 영역의 양측에 스테퍼 모터를 부착할 수 있도록 광섬유 홀더를 배치합니다. 또한, 광원으로 사용할 레이저를 광섬유의 한쪽 끝에 부착합니다. 스테퍼 모터를 서로 반대 방향으로 작동시켜 광섬유를 늘리고, 수소 토치를 사용하여 광섬유의 피복이 벗겨진 부분을 녹입니다.파이버에서 측면으로 산란되는 빛을 지속적으로 모니터링하십시오. 빛이 깜빡이는 것은 파이버를 통한 빛 투과율이 변동하고 있음을 나타내며, 더 많은 가늘게 만들기 과정이 필요하다는 뜻입니다. 깜빡임이 멈추면 가열과 파이버 당기기를 중단하십시오. 이때 파이버는 약 500 nanometers 정도로 가늘어진 상태가 됩니다.광섬유를 가늘게 만든 후, 광원을 분리하고 광섬유와 자성 클램프 홀더를 스테퍼 모터에서 제거하십시오. 다음으로, 포지셔닝 스테이지가 설치된 공압 절연 벤치로 광섬유를 옮기십시오. 샘플 칩 앞의 지지 블록 위에 있는 자성 클램프 홀더에 광섬유를 배치하십시오.포지셔닝 스테이지는 3축 마이크로미터 상단에 위치한 3축 나노 포지셔닝 스테이지입니다. 나노 포지셔닝 스테이지 외에도 정렬을 돕기 위한 상단 및 측면 뷰 이미징 컬럼이 있습니다. 파이버의 피복이 벗겨진 부분이 포지셔닝 스테이지 근처에 오도록 하여 작업을 계속합니다.섬유의 자유단을 측정 시스템에 도입할 준비를 합니다. 자유단을 절단한 후, 이를 베어 파이버 어댑터(bare fiber adapter)에 삽입합니다. 어댑터를 사용하여 섬유를 오실로스코프에 연결된 자동 균형 포토 리시버(auto balanced photo receiver)의 입력단에 연결합니다.이제 광섬유의 반대쪽 끝에 집중하십시오. 먼저, 이 끝을 광 커플러(optical coupler)에 연결합니다. 그런 다음 50 50 빔 분할기와 ATT 가변 다이오드 레이저로부터 입력을 받는 인라인 편광기의 출력단에 광섬유를 결합하십시오.여기까지 수행된 연결 상태를 나타낸 모식도입니다. 빔 분할기의 두 번째 출력단은 인라인 편광기를 통과하여 자동 균형 광 수신기의 참조광으로 사용됨에 유의하십시오. 다음 단계는 스테인리스강 샘플 홀더를 사용하여 마이크로 OID 칩을 장착할 준비를 하는 것입니다.양면테이프를 사용하여 칩을 샘플 홀더에 고정합니다. 그런 다음 마이크로 칩을 샘플 홀더 위에 놓습니다. 이제 칩이 부착된 샘플 홀더를 나노 포지셔닝 스테이지 위에 장착합니다.홀더와 칩이 3축 마이크로미터가 장착된 포지셔닝 스테이지 위에 배치된 모습입니다. 광섬유를 기준으로 샘플 칩의 위치를 거칠게 조정합니다. 거친 위치 조정이 완료된 후의 칩과 광섬유의 모습입니다.다음으로, 포지셔너를 추가로 조정하고 이미징 컬럼을 사용하여 칩을 광섬유와 평행하게 정렬합니다. 레이저 파장을 갖는 마이크로 OID를 사용하며, 이 이미지는 광섬유와 마이크로t의 모습입니다. 미세 위치 조정 단계 후, 시야 중심 근처의 원형 스티커가 위치 조정 보조 도구로 사용됩니다. 이제 마이크로의 공진 파장을 찾는 단계로 이동합니다.레이저 파장을 약 635 nm ± 2.5 nm로 조절하기 위해 삼각파 전압 신호를 생성합니다. 이제 공명 지점을 찾기 위해 파장을 스캔합니다. 오실로스코프를 통해 파이버를 통한 투과율을 관찰하십시오.공진 파장에서 투과율이 감소하는 점에 유의하십시오. 이 시점에서 레이저 광의 편광을 조절하십시오. 인라인 편광 컨트롤러를 조정하여 광섬유 내 레이저 광의 편광을 최적화하십시오.오실로스코프로 광 수신기의 출력을 확인하고, 측정된 투과 딥(transmission dip)이 가장 좁게 나타날 때까지 편광을 조정합니다. 편광 최적화 후, 샘플 스테이지 위에 샘플 챔버를 구축합니다.챔버는 현미경 슬라이드 글라스 조각에 에폭시로 고정된 유리 커버슬립으로 구성됩니다. 슬라이드는 스페이서 역할을 하여 커버슬립이 칩과 파이버 위로 돌출되도록 합니다. 1 mL 시린지 펌프와 튜빙을 배치하여 실험 샘플을 분당 1 mL의 속도로 챔버에 주입하십시오.다음으로, 펌프에 주입할 실온 평형 상태의 샘플 1 mL를 준비합니다. 본 실험에서는 5 nm 실리카 비드가 포함된 용액을 사용합니다. 샘플을 로딩한 후 샘플 챔버를 관찰하며 샘플을 주입합니다. 챔버가 가득 차면 주입을 중단하며, 이 챔버는 5 nm 실리카 비드 용액으로 채워진 상태가 됩니다.진동의 영향을 최소화하기 위해 30초 동안 기다린 후, 마이크로 공진기의 공진 파장을 탐색합니다. 오실로스코프를 사용하여 공진 시의 딥(dip)과 파이버를 통한 투과도를 다시 관찰합니다. 이것은 비례 적분 미분 또는 PID 컨트롤러를 포함한 이 시점의 실험 장치 모식도입니다.적분기와 디더(dither)입니다. 컨트롤러를 피크 상단 잠금(top of peak locking) 방식의 자동 잠금 모드로 실행하십시오. 디더 주파수를 2 kHz로 설정하고 파장 진동 진폭을 19 fm로 설정하십시오.PID 설정을 경험적으로 찾아내어 레이저의 파장을 마이크로 공동의 공진 파장에 자동으로 고정하십시오. 피드백 컨트롤러의 출력을 기록하여 데이터를 수집하십시오. 다음은 크기순으로 세 가지 서로 다른 결합 입자를 사용한 프로토콜을 통해 생성된, 시간(초)에 따른 공진 이동(펨토미터)의 대표적인 트레이스입니다.입자는 엑소좀 또는 나노 소포체입니다. 5 nm 실리카 비드와 인간 인터루킨 2 분자입니다. 각 데이터 세트의 수직 및 수평 AE의 서로 다른 척도에 유의하십시오.입자 크기에 따라 데이터에서 서로 다른 스케일이 관찰되는 것은 해당 기술이 올바르게 수행되었음을 나타냅니다. 입자가 OID에 결합하면 OID의 공명 파장이 증가하여 트레이스에서 단계적인 상승(step up)이 나타납니다. 입자가 해리되면 공명 파장이 감소하여 단계적인 하강(step down)으로 이어집니다.각 파장 단계의 높이는 입자의 크기와 마이크로 OID 상의 위치에 의해 결정됩니다. 시간 척도는 입자 OID 역학에 의해 결정됩니다. 이 기술을 숙달하면 올바르게 수행했을 때 약 3시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 환경을 최대한 깨끗하고 먼지가 없는 상태로 유지하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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