Name: 물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 배우세요 물방울 미세 유체에서 광섬유를 활용한 다색 형광 검출 기법을 통해 고속 생물학적 스크리닝을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 효소 진화 및 희귀 표현형 식별 연구에 효과적으로 적용됩니다.

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이 작업은 국방고등연구계획국(DARPA) 보조금 번호 84389.01.44908, NSF CAREER 상(DBI-1253293), NIH 탐색/개발 연구 보조금(CA195709), NIH New Innovator Awards(HD080351, DP2-AR068129-01) 및 UCSF 자원 할당 프로그램의 New Directions 보조금의 지원을 받았습니다.

1. SU8 마스터 제작 <ol><li> 디자인 소프트웨어를 사용하여 세 개의 층 제조를위한 미세 유체 구조를 설계하고 10 μm의 해상도 회로 기판 필름의 공급 업체가 인쇄 된 디자인을 가지고있다. 장치 설계의 세부 사항은 첨부 된 문헌 6에 제시되어 채널 형상은도 1에 도시한다. 층은 각 층의 제조 (8)로부터 특징을 배치 할 수 있도록 정렬 마크를 포함한다. </li><li> 스핀 코터에 미리 청소 3 인치 직경의 실리콘 웨이퍼를 놓고 척에 부착하는 진공의 전원을 켭니다. 80 ㎛의 층 두께를 제공 한 다음 1750 rpm에서 30 초, 500 rpm에서 20 초 동안 상기 웨이퍼 및 회전의 중심에 SU8-3050 1 ㎖을 적용한다. </li><li> 웨이퍼를 제거하고, 30 분 동안 135 ° C의 열판에서 굽는다. 웨이퍼는 다음 단계로 이동하기 전에 실온으로 냉각 할 수있다. </li><li> 평행 190m에서 1 차 레이어 마스크에 코팅 된 웨이퍼를 노출3 분 동안 LED nm의 W, 365. 노출 후, 다음 단계로 진행하기 전에, 1 분 동안 RT에 다음 시원한를 135 ° C 형 열판에 웨이퍼를 배치합니다. </li><li> 스핀 코터에 웨이퍼를 놓고 척에 부착하는 진공의 전원을 켭니다. 40 ㎛의 두께의 부가 층을 제공하는 결과로, 5,000 rpm에서 30 초 후, 500 rpm에서 20 초 동안 상기 웨이퍼 및 회전의 중심에 SU8-3050 1 ㎖을 적용한다. </li><li> 다음 단계로 이동하기 전에 30 분 동안 135 ° C의 열판에 RT로 다음 멋진 웨이퍼와 빵을 제거합니다. </li><li> 1.3 패턴 형상에 2 차 레이어 마스크를 맞추고 3 분 동안 LED nm의 평행 190 mW의 365에 코팅 된 웨이퍼를 노출합니다. 노출 후, 다음 단계로 진행하기 전에, 4 분 30 초 동안 135 ° C의 열판에 RT에 다음 시원한 놓습니다. </li><li> 스핀 코터에 웨이퍼를 놓고 척에 부착하는 진공의 전원을 켭니다. 그 후, 500 rpm에서 20 초 동안 상기 웨이퍼 및 회전의 중심 (30)을 1 ㎖ SU8-3050 적용초 1,000 rpm에서 100 μm의 두께의 부가 층을 제공하는 결과. </li><li> 다음 단계로 이동하기 전에 30 분 동안 135 ° C의 열판에 RT로 다음 멋진 웨이퍼와 빵을 제거합니다. </li><li> 1.3 패턴 형상에 3 번째 레이어 마스크를 맞추고 3 분 동안 LED nm의 평행 190 mW의 365에 코팅 된 웨이퍼를 노출합니다. 노출 후, 다음 단계로 진행하기 전에, 9 분 동안 135 ° C의 열판에 RT에 다음 시원한 놓습니다. </li><li> 30 분, 프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트의 교반 욕에 침지하여 마스크를 개발한다. 1 분 동안 135 ° C의 열판에 이소프로판올과 빵의 웨이퍼를 세척 할 것. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 성형 용 100mm 페트리 접시에서 개발 마스터를 놓습니다. </li></ol> 2. PDMS 소자 제조 <ol><li> 플라스틱 컵에 경화제 5 g과 실리콘계 50 g을 조합하여 하나 PDMS 10을 준비한다. 저어 스틱 장착 된 회전 도구를 사용하여 내용을 섞는다. ℃,30 분 동안 데시 케이 터 내부의 혼합물로서, 또는 모든 기포가 제거 될 때까지. </li><li> 마스터 이상 3mm의 두께를주고 더 탈 가스에 대한 데시 케이 터에 다시 배치 할 PDMS를 따르십시오. 일단 모든 기포를 제거하고, 80 분 동안 80 ℃에서 구워 장치. </li><li> 패터닝 측과 깨끗한 표면에 메스과 장소를 사용하여 금형에서 장치를 잘라 내기 및 0.75 mm 생검 펀치와 유체 입구와 출구를 펀치. 120 ㎛ 내지 220 ㎛의 높이 형상은 장치의 측면에서 접근 할 수 있도록 장치는 절단되어야한다. </li><li> 플라즈마는 300 W의 플라즈마 세정기에서 20 초 동안 1 밀리바 O 2 플라즈마에서 3 인치 유리 슬라이드에 의한 사전 세정 2인치 함께 업 기능면 장치를 취급한다. 유리 슬라이드의 플라즈마 처리면 상에 PDMS 소자의 패턴면을 배치하여 PDMS 소자 접합. 80 ° C의 오븐에서 장치를 넣고 40 분 동안 조립 된 장치를 굽는다. </li><li> 채널 렌더링플루오르 표면 처리 유체 장치를 세척하는 주사기를 사용하여 소수성. 10 분, 용매를 증발시켜 즉시 80 ℃에서 장치를 굽는다. </li></ol> 광학 구성 요소 3. 준비 <ol><li> 105 μm의 코어 125 μm의 클래딩의 마지막 5mm의 피복을 제거하여 레이저 여기 광을 준비 NA 0.22 광파이버 =. </li><li> 2 차 섬유 동일한 3.1를 반복하여 2 차 컬러 레이저 여기 광을 준비한다. </li><li> 200 μm의 코어 225 μm의 클래딩 3.1를 반복하여 형광 신호를 수집하기위한 섬유를 제조, NA 0.39 광파이버 =. </li><li> 끝이 평평한 표면에 끝나지 않는 경우, 섬유 서기관과 끝을 다시 절단 - 모든 섬유의 끝을 검사합니다. </li><li> 50 mW의, 405 nm의 레이저로 레이저 광 커플러를 부착하고 레이저에 105 μm의 핵심 섬유 중 하나를 첨부합니다. 레이저 파워의 센서에서 벗겨진 단부 지시m은 레이저 파워를 최대화하도록 레이저 커플러의 미세 조정을 사용한다. </li><li> 50 mW의, 473 nm의 레이저 3.5를 반복합니다. </li><li> 레이저 광을 차단하고 방출 형광을 전송하는 렌즈 튜브를 사용하여 PMT에 446/510/581/703 나노 쿼드 대역 통과 필터를 탑재. 그 빛이 PMT를 타격하기 전에 필터를 통해 이동하므로 섬유 커플러를 연결합니다. </li><li> 3.7 조립 장치에 3.3에서 섬유를 연결합니다. </li></ol> 4. 오프라인 혼합 된 에멀젼 생성 <ol><li> 60 μm의 X 60 μm의 구멍과 흐름 초점 마이크로 유체 dropmaker 장치를 가져옵니다. </li><li> 2 % 이온 성 플루오로 9 HFE 7500 오일 1 ML의 주사기를 입력합니다. </li><li> 1 nM의 FITC / 10 나노 미터 CB, 10 nM의 FITC / 10 나노 미터 CB, 1 nM의 FITC / 100 nM의 다음 형광의 다음과 같은 조합 (FITC) 및 덱스 트란 - 복합 파란색 염료 PBS에서 (CB)를 1 ml를 주사기의 일련의 입력 CB 및 10 nM의 FITC / 100 나노 CB. </li><li> 반전 마이크로의 무대에 dropmaker 장치를 장착대처와 주사기 펌프에 수성과 석유 주사기. 커플 PE-2 튜브를 이용하여 단말기로 주사기. </li><li> 500 μL / 수성 솔루션에 대한 석유와 250 μL / 시간 동안 시간에 주사기 펌프를 실행, 4.3에서 솔루션을 포함하는 80 μm의 방울의 혼합물을 만들 수 있습니다. 수성 시료의 종류마다, 교차 오염을 제거하기 위해 새로운 dropmaker 장치를 사용한다. 빈 주사기로 각 염료 조합에서 에멀젼 ~ 200 μl를 수집합니다. </li><li> 4 액적 형태가 단일 컬렉션 주사기에 수집 한 후, 반복적으로 주사기를 회전시킴으로써, 에멀젼을 혼합한다. </li><li> 반복 수용액은 PBS에 0.​​1, 1, 10, 100 nM의 FITC를 함유 4.2-4.6 단계. </li></ol> 5. 광섬유 삽입 <ol><li> &lt;100 마이크로 초 셔터 속도를 할 수있는 디지털 카메라와 결합 거꾸로 현미경의 무대에서 2 단계에서 제조 된 미세 유체 칩을 놓습니다. </li><li> 측면, INSE에서 조심스럽게 작업주 유동 채널을 통해 천공 않도록주의하면서 가장 먼 상류 120 ㎛의 채널에 473 nm의 레이저에 연결된 광을 실온. </li><li> 상기 가장 먼 하류 120 μm의 하이 사이드 채널에 405 nm의 레이저에 연결된 광섬유를 삽입 300 ㎛ 인 섬유의 간격을 제공한다. </li><li> 2 개의 레이저 여기 섬유에 수직 220 μm의 높이 채널로 PMT 결합 섬유를 삽입합니다. </li></ol> 혼합 유제 6. 형광 검출 <ol><li> PE-2 관으로 검출 장치의 스페이서 오일 입구에 2 % 이온 성 플루오로 HFE 7500 가득 5 ML의 주사기를 탑재합니다. </li><li> PE-2 튜브를 사용하여 장치의 액적 재 주입 입구에 수직 배향 주사기 펌프와 커플 혼합 FITC / CB 에멀젼을 함유하는 주사기를 탑재. 폐기물 용기에 장치 출구에서 PE-2 튜브의 길이를 연결합니다. </li><li> 두까지 1,000 μL / 시간에 펌프를 각각 실행하여 국무 장치기름 방울은 정기적으로 장치에 결합하고 하류 유입 될 볼 수 있습니다. </li><li> 상기 검출 영역을 이동하는 액적 사이에 상당한 간격을 제공하는 스페이서 오일 6000 μL / 시간 실행되도록 유속 100 μL / 시간 방울을 조정한다. </li><li> 상기 레이저를 켜고 데이터 취득 프로그램을 시작하고, 초기 잡음 플로어를 100 배 이상이다 신호를 제공하는 PMT의 이득을 조정한다. 겹의 모든 피크가 하나의 선형 스케일링 timetrace에 잘 볼 수 있도록 레이저 출력을 조정한다. </li><li> 적어도 20 kHz에서의 PMT 전압 timetrace 60 초 획득. 이러한 matlab에 같은 컴퓨팅 프로그램에 데이터를 가져 오기 및 사용자 지정 계산 프로그램 스크립트를 사용하여 기록 이중선의 피크의 높이를 측정한다. 참고 :이 보충 정보로 제공됩니다. </li><li> 반복 405 nm의 레이저가 꺼져로, 4.7에서 만든 FITC 전용 혼합 된 에멀젼을 사용하여 6.2-6.7 단계를 반복합니다. </li></ol>

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<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

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광섬유 검출 유체 채널에 대해 광섬유의 정렬을 필요로한다. 우리 장치 다층 포토 리소그래피로 제조 된 가이드 채널을 이용하기 때문에, 서로에 대한 마스크의 위치가 매우 중요하다. 섬유 가이드 채널은 유체 채널에 너무 근접하면, 유체 누출 가능성이있다; 상기 가이드 채널이 너무 멀리 위치하거나 오정렬되는 경우, 검출 섬유에 의해 수집 된 형광 신호는 크게 감소 될 수있다. 적절한 정렬은 사진 패터닝 동안 함께 배치되는 마스크에 같은 동심원으로 정렬 마크를 디자인하여 도움을받을 수 있습니다. 또한, 장치에 광섬유를 수동으로 삽입 사용할 수 없게 그들을 렌더링, 장치 내에서 섬유의 끝을 깰 수있는 잠재력을 가진 섬세한 과정이다. 현미경으로 관찰하면서 키 된 PDMS 장치에 결합 된 유리 슬라이드에 대해 섬유 억제 천천히 섬유를 삽입하기 SUCCessful 섬유 삽입. 미리 형성된 에멀젼의 마지막 재 주입 취급의 최소 발생한다. 유화가 만든 빈 주사기로 직접 입금되면이 방울 재 주입에 사용되는 때까지 이상적으로, 그것은 양도 할 수 ...

마이크로 유체 방울은 캐리어 오일에 현탁 한 수용액 방울 다수의 실험으로 구획하여 높은 처리량 생물을위한 플랫폼을 제공한다. 물방울은 단일 세포 분석이 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 3 등의 다양한 용도에 사용하고, 진화 4 효소되었다. 밝고 신호 빠른 시간 응답 헤르쯔 레이트로 서브 - 나노 리터 액적 부피를 검출 호환되는 형광 분석법, 마이크로 유체 방울의 검출의 표준 모드이다. 많은 애플리케이션은 동시에 두 개 이상의 색상을위한 형광 검출을 필요로한다. 예를 들어, 우리의 실험은 흔히 분석의 결과를 검출 한 채널을 사용하여 액적 분류 실험은 PCR 활성화 행하고, 5 분석 음성 적이 가산 있도록 보조 배경 염료를 사용한다. 액적 미세 유체에 대한 일반적인 탐지 스테이션 바있다표면 형광 현미경에 나오지도, 샘플에 집중 될 현미경에 여유 공간이 레이저에서 여기 광을 소개하는 빛을 조작 체계를 복잡 필요합니다. 형광 액적으로부터 출사 된 후, 각 검출 채널 파장 대역의 중앙에 하나의 광전자 증 배관 (PMT)를 사용되도록 형광을 방출되는 광을 여과한다. 표면 형광 현미경 기반 광 검출 시스템은 그들의 비용, 복잡성 진입 장벽을 제공하고 유지 보수가 필요했다. 광학 섬유는 섬유가 수동 미러 기반 광 경로에 대한 필요성을 제거하고, 광 경로는 광 파이버 커넥터를 사용하여 인터페이스 될 수 있도록 미세 유체 소자에 삽입 될 수 있기 때문에, 상기 수단은, 단순하고 강력한 검출 방식을 구성하기 위해 제공한다. 본 논문에서는 광 화이버의 어레이를 이용하여 다색 형광 검출을 수행하는 컴팩트 한 모듈 방식의 조립 및 검증을 설명다 하나의 광 검출기 (6). 광학 섬유는 개별 레이저에 결합되고, 일정한 공간 오프셋에서 L 형상의 유로로 정상적으로 삽입된다. 형광 수집 섬유 여진 영역과 평행하게 배향되며, 하나의 PMT에 접속된다. 액적들이 다른 시간에 레이저 빔을 통과하기 때문에, PMT에 의해 기록 된 데이터는 시간적 해당 사용자가 액적 각각 별개의 레이저 광에 의해 여기 된 후 방출 된 형광을 구별 할 수 있도록 오프셋을 나타낸다. 이러한 시간 시프트는 이색 미러와 대역 통과 필터의 시리즈를 사용하여 별도의 PMT 출사 광을 분리 할 필요가 없다. 검출기의 효능을 검증하기 위해, 우리는 다른 색상과 농도의 염료를 캡슐화 방울 인구에서 형광을 정량. 시스템의 감도는 단색 형광 검출을 조사하고,이 0.1nm하는 200X 감도 노출 수까지 농도의 액 적을 검출하는 능력을 표시한다문헌 7에서보고 된 최근의 광섬유 기반 방식에 비해 ovement.

<table><tbody><tr><td>포토 마스크</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 "실리콘 웨이퍼, P 형, 버진 테스트 등급</td><td>대학 웨이퍼</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>BD</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>10ml 주사기</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 게이지 바늘</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 폴리에틸렌 튜브</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>일반적으로 HFE 7500</td></tr><tr><td>Ionic Krytox 계면활성제로</td><td></td><td></td> 알려진 합성 <td>지침, 참조 #10</td></tr><tr><td>Dextran-conjugated cascade blue dye</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 나트륨염</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Quad bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>파이버 포트</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>렌즈 튜브</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>패치 케이블, 200 &#956; M 코어 / 225 &#956; 하나의 벗겨진 끝과 하나의 FC/PC 커넥터가 있는 m 클래딩 광섬유</td><td>Thorlabs</td><td>사용자 정의</td><td></td></tr><tr><td>패치 케이블(105 &#956); M 코어 / 125 &#956; 한쪽 끝이 벗겨지고 FC/PC 커넥터가 하나씩 있는 m 클래딩 광섬유</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &#956; m 섬유 스트리핑 도구</td><td>Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &#956; m 섬유 스트리핑 도구</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>레이저 섬유 어댑터</td><td>OptoEngine</td><td>FC/PC 어댑터</td><td></td></tr><tr><td>405 nm CW 레이저 at 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>CNI 레이저</td></tr><tr><td>473 nm CW 레이저 디스트리뷰터 at 50&nbsp; MW</td><td>광엔진</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

형광 분석은 밝은 신호와 빠른 시간 응답으로 인해 액적 미세유체역학에 사용되는 가장 일반적인 판독입니다. 멀티플렉스 분석법(multiplex assay), 효소 진화(enzyme evolution) 및 분자 생물학 강화 세포 분류(molecular biology enhanced cell sorting)와 같은 응용 분야에서는 두 가지 이상의 형광 색상을 검출해야 합니다. 자유 공간 레이저를 epifluorescence microscope에 결합하는 표준 multicolor 검출 시스템은 부피가 크고 비용이 많이 들며 유지 관리가 어렵습니다. 이 논문에서는 광섬유에 결합된 레이저가 있는 미세유체 채널의 이산 영역을 여기시켜 다색 검출을 수행하는 계획을 설명합니다. 방출된 빛은 단일 광검출기에 연결된 광섬유에 의해 수집됩니다. 여기(excitation)는 서로 다른 공간적 위치에서 발생하기 때문에 방출된 빛의 정체성을 시간적 변화로 인코딩할 수 있으므로 더 복잡한 광 필터링 체계가 필요하지 않습니다. 이 시스템은 4가지 고유한 염료 조합을 포함하는 액적 집단을 검출하고 플루오레세인의 나노몰 미만 농도를 검출하는 데 사용되었습니다.

광섬유의 삽입을 허용하는 PDMS 소자의 제조는 다양한 높이 (도 1)의 채널을 만들 수있는 여러 단계의 포토 리소그래피 절차를 필요로한다. 먼저, SU-8 80 μm의 높은 층은 실리콘 웨이퍼 상에 스핀 및 유체 핸들링 형상을 작성하는 마스크를 이용하여 패터닝된다. 다음, SU-8의 부가 40 ㎛의 층이 웨이퍼 상에 방사하고, 120 ㎛의 높이 레이저 광 삽입 채널을 형성 할 것이다 형상을 생성하는 제 2 마스크를 사용하여 패터닝된다. 마지막으로, 100 ㎛의보다 SU-8은 웨이퍼 상에 방사하고, 220 ㎛의 높이 검출 광섬유 삽입 채널을 제공하기 위해 패터닝된다. 마스터 개발 차례로 유리 슬라이드에 결합 된 PDMS 소자를 몰드하기 위해 사용된다. 최종 조립은 측면을 통해 액세스 디바이스 120 ㎛ 내지 220 ㎛의 높이 광섬유 채널의 상부에 천공 구멍을 통해 액세스 80 μm의 높이 유동 형상을 포함장치. <p class="j...

액적 미세유체역학에서 다색 형광 검출은 일반적으로 부피가 크고 복잡한 에피 형광 현미경 기반 검출 시스템을 포함합니다. 여기에서는 단일 광검출기에서 수집한 다색 데이터를 시간적으로 인코딩하기 위해 광섬유 어레이를 사용하는 소형 모듈식 다색 검출 체계에 대해 설명합니다.

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

본 절차의 전반적인 목표는 광섬유를 이용한 액적 미세유체 형광 검출의 간단한 응용 사례를 시연하는 것입니다. 이 방법은 희귀 표현형의 식별 및 효소의 지향성 진화와 같은 고처리량 생물학적 스크리닝의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 액적 미세유체 내에서 형광 검출을 간단하고 저렴하게 적용할 수 있다는 점입니다.먼저, 세척된 지름 3인치 실리콘 웨이퍼를 스핀 코터의 진공 척 위에 놓습니다. 그런 다음, 웨이퍼 중앙에 SU-8 3050 1 mL를 도포하고, 웨이퍼를 회전시켜 80 µm 두께의 포토레지스트 층을 형성합니다. 코팅된 웨이퍼를 스핀 코터에서 분리하여 135 °C로 예열된 핫플레이트 위에 올립니다.30분 후 웨이퍼를 꺼내어 다시 실온으로 식힙니다. 다음으로, 웨이퍼를 평평한 표면에 놓고 첫 번째 레이어 마스크를 웨이퍼에 맞춥니다. 콜리메이티드(collimated) 190 milliwatt, 365 nanometer LED 아래에서 3분 동안 웨이퍼를 노광합니다.노광 후, 웨이퍼를 135 °C 핫플레이트 위에 1분간 올려두었다가 다시 실온으로 식힙니다. 식으면 웨이퍼를 다시 스핀 코터 위에 올려 척에 고정합니다. 웨이퍼 중앙에 SU-8 3050 1 mL를 추가로 도포하고 500 r.p.m.에서 20초 동안 회전시킵니다.이어서 5,000 r.p.m.에서 30초 동안 원심분리합니다. 다음으로, 핫플레이트 위에서 웨이퍼를 굽습니다. 실온까지 다시 식힌 후, 마스크 정렬 표면 위에 다시 놓습니다.해부 현미경을 사용하여 두 번째 층 마스크를 웨이퍼 상의 패턴 정렬 마크에 수동으로 맞춥니다. 정렬이 제대로 완료되면 이전과 동일한 조건으로 코팅된 웨이퍼를 4-1/2분 동안 노광합니다. 노광 후, 웨이퍼를 135 °C의 핫플레이트 위에 1분 동안 놓아 가열한 다음, 웨이퍼를 식히고 다시 스핀 코터에 부착합니다.SU-8 3050 1 mL을 웨이퍼에 세 번째로 도포하고, 스핀 코팅하여 포토레지스트를 100 µm 더 추가합니다. 웨이퍼를 꺼내 135 °C 핫플레이트에서 30분간 베이킹합니다. 그 후, 실온으로 냉각시켜 정렬 표면 위에 놓습니다.세 번째 레이어 마스크를 이전 기하학적 구조에 맞게 정렬하고, 이전 조건과 동일하게 9분 동안 코팅된 웨이퍼를 노광합니다. 노광 후, 웨이퍼를 135 °C 핫플레이트 위에 1분 동안 올려두었다가 실온으로 냉각합니다. 냉각이 완료되면, 현상액이 든 교반 욕조에 웨이퍼를 30분 동안 담가 마스크를 현상합니다.마지막으로, 웨이퍼를 isopropanol로 세척한 후 135 °C의 핫플레이트에서 1분 동안 최종적으로 베이킹합니다. 현상된 마스터는 몰딩 전까지 100 mm 페트리 접시에 보관하십시오. 플라스틱 컵에 실리콘 베이스 50 g과 경화제 5 g을 혼합하여 10:1 비율의 PDMS 혼합물을 준비합니다.로터리 툴을 사용하여 내용물을 혼합한 다음, 데시케이터 내부에서 30분 동안 또는 모든 기포가 제거될 때까지 혼합물을 탈기합니다. 탈기된 PDMS를 준비된 마스터 위에 부어 3 mm 두께가 되도록 합니다. 그 후, 추가 탈기를 위해 페트리 접시를 다시 데시케이터에 넣습니다.모든 기포를 제거한 후, 장치를 80 °C에서 80분 동안 굽습니다. 냉각되면 메스로 장치를 몰드에서 잘라내어 120 µm와 220 µm 텔레지오메트리(telegeometries) 모두에 장치 측면에서 접근할 수 있도록 합니다. 그런 다음 0.75 mm 생검 펀치로 유체 유입구와 유출구를 뚫습니다.특징부가 위로 향하도록 장치를 미리 세척된 유리 슬라이드와 함께 배치하고, 300 watt 플라즈마 세척기에서 1 millibar 산소 플라즈마로 20초 동안 플라즈마 처리합니다. PDMS 장치의 패턴 면을 플라즈마 처리된 유리 슬라이드 면 위에 단단히 밀착시켜 장치를 접합합니다. 그런 다음, 장치를 80 degree Celsius 장치 오븐에 넣고 조립된 장치를 40분 동안 베이킹합니다.베이킹이 완료되면, 시린지를 사용하여 소자에 불소계 표면 처리액을 흘려보내 채널을 소수성으로 만듭니다. 그 후, 용매를 증발시키기 위해 즉시 소자를 80 °C에서 10분 동안 베이킹합니다. 광섬유의 끝부분 5 mm에서 절연체를 제거하여 두 개의 레이저 여기용 섬유를 준비합니다.또한, 더 큰 광섬유의 끝부분 5mm에서 절연체를 제거하여 형광 신호를 수집하기 위한 파이버를 준비합니다. 현미경으로 모든 파이버의 끝부분을 검사합니다. 끝부분이 평평한 표면으로 마무리되지 않은 경우, 파이버 스크라이브(fiber scribe)를 사용하여 끝단을 다시 절단합니다.다음으로, 50 milliwatt, 405 nanometer 레이저에 레이저 파이버 커플러를 연결하고 105 micrometer 코어 파이버 중 하나를 레이저에 연결합니다. 레이저 파워 미터 센서의 피복이 벗겨진 끝부분을 향하게 한 뒤, 레이저 커플러의 미세 조정 다이얼을 사용하여 레이저 출력을 최대화합니다. 50 milliwatt, 473 nanometer 레이저를 사용하여 다른 파이버를 튜닝하는 동일한 과정을 수행합니다.그 후, 레이저 광은 차단하고 방출된 형광은 투과시키기 위해 렌즈 튜브를 사용하여 광전 증배관에 쿼드 밴드패스 필터를 장착합니다. 빛이 광전 증배관에 도달하기 전 필터를 통과하도록 파이버 커플러를 부착합니다. 다음으로, 수집 파이버를 파이버 커플러에 연결합니다.제작된 미세유체 칩을 최소 100 microsecond의 셔터 속도가 가능한 디지털 카메라가 연결된 도립 현미경의 스테이지 위에 놓습니다. 측면에서 조심스럽게 작업하여, 473 nanometer 레이저와 연결된 광섬유를 가장 상류에 있는 120 micrometer 채널에 삽입합니다. 이때 메인 흐름 채널까지 뚫고 지나가지 않도록 주의하십시오.그런 다음, 405 nanometer 레이저에 연결된 파이버를 가장 하류에 위치한 120 micrometer 높이의 사이드 채널에 삽입하여 파이버 간격을 300 micrometers로 유지합니다. 마지막으로, 더 큰 광전증배관(photo multiplier tube)에 연결된 파이버를 두 개의 레이저 여기 파이버와 수직이 되도록 220 micrometer 높이의 채널에 삽입합니다. 2% 이온성 불소계 계면활성제(ionic fluorosurfactant)가 포함된 HFE 7500으로 5 milliliter 시린지를 채운 후, PE2 튜빙을 사용하여 검출 장치의 스페이서 오일 유입구에 장착합니다.다음으로, FITC와 청색 염료가 혼합된 에멀젼을 시린지에 채우고, 이를 PE2 튜브를 통해 액적 재주입 입구로 장치와 연결된 수직 방향의 시린지 펌프에 장착합니다. 장치 출구에서 폐액 용기까지 PE 튜브를 연결합니다. 그런 다음, 오일과 액적이 장치 내에서 규칙적으로 결합하여 하류로 흐르는 것이 보일 때까지 각 펌프를 1,000 µL/h의 속도로 가동하여 장치를 프라이밍합니다.스페이서 오일(spacer oil)의 유량은 6,000 µL/h로, 액적의 유량은 100 µL/h로 조정하여 검출 영역을 통과하는 액적 사이에 충분한 간격이 생기도록 합니다. 그 다음, 레이저를 켜고 데이터 수집 프로그램을 시작합니다. 이어서, 광전증배관(photo multiplier tube)의 게인을 조정하여 기저 노이즈 레벨(baseline noise floor)보다 100배 이상 높은 신호가 나오도록 설정합니다.마지막으로, 단일 선형 스케일 시간 추적선 상에 모든 더블릿 피크가 명확하게 보이도록 레이저 출력을 조정하십시오. 검출 채널을 통해 흐르는 액적은 레이저 결합 광섬유 각각의 전면에 위치한 불연속적인 여기 영역을 통과하게 됩니다. 검출 광섬유는 방출된 형광을 시간적 편차와 함께 기록하며, 이때 피크 간의 간격은 액적이 한 여기 영역에서 다음 영역으로 이동하는 데 걸리는 시간과 상관관계가 있습니다.이를 통해 추가적인 광 필터링과 별도의 광전증배관이 필요하지 않게 됩니다. 검출 체계의 효능은 405 nanometers 및 473 nanometers에서 들뜨는 염료를 포함하는 액적의 혼합 에멀젼을 검출함으로써 테스트되었습니다. 이 그래프는 약 50 hertz로 흐를 때 재주입된 네 가지 액적 유형 간의 명확한 분리를 보여줍니다.플루오레세인(fluorescein)만 포함된 액적을 측정하여 검출기의 동적 범위와 절대 감도를 조사하였습니다. 데이터는 0.1에서 100 nanomolar 범위의 염료 농도를 검출하는 시스템의 능력을 보여줍니다. 이 영상을 시청하고 나면 삽입된 광섬유 어레이와 단일 광검출기를 활용하여 단순하고 소형화된 형광 검출 시스템을 구현하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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생명공학

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