물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 광섬유를 사용한 액적 미세유체역학 형광 검출의 간단한 응용을 시연하는 것입니다. 이 방법은 희귀 표현형의 식별 및 효소의 지시된 진화와 같은 고처리량 생물학적 스크리닝의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 액적 미세유체역학에서 형광 검출을 간단하고 저렴하게 적용할 수 있다는 것입니다.

시작하려면 미리 청소된 3인치 직경의 실리콘 웨이퍼를 스핀 코터의 진공 척에 놓습니다. 그런 다음 웨이퍼 중앙에 1ml의 SU-8 3050을 바르고 웨이퍼를 회전시켜 80마이크로미터 두께의 포토레지스트 층을 제공합니다. 스핀 코터에서 코팅된 웨이퍼를 제거하고 섭씨 135도로 예열된 핫플레이트에 놓습니다.

30분 후 웨이퍼를 제거하고 실온으로 다시 식힙니다. 다음으로, 웨이퍼를 평평한 표면에 놓고 첫 번째 레이어 마스크를 웨이퍼에 정렬합니다. 시준된 190밀리와트, 365나노미터 LED 아래에 웨이퍼를 3분 동안 노출시킵니다.

노출 후 웨이퍼를 섭씨 135도의 핫플레이트에 1분 동안 올려 놓은 다음 실온으로 다시 식히십시오. 냉각되면 웨이퍼를 스핀 코터에 다시 놓고 척에 부착합니다. 웨이퍼 중앙에 SU-8 3050 밀리리터를 추가로 바르고 500rpm에서 20초 동안 회전합니다.

5, 000 rpm에서 30 초 동안 이어집니다. 다음으로 핫플레이트에서 웨이퍼를 굽습니다. 실온으로 다시 식힌 다음 마스크 정렬 표면에 다시 놓습니다.

해부 범위를 사용하여 두 번째 레이어 마스크를 웨이퍼의 패턴화된 정렬 표시에 수동으로 정렬합니다. 적절하게 정렬되면 이전과 동일한 조건으로 코팅된 웨이퍼를 4-1/2분 동안 노출시킵니다. 노출 후 웨이퍼를 섭씨 135도의 핫플레이트에 1분 동안 놓은 다음 웨이퍼를 식히고 스핀 코터에 다시 부착합니다.

SU-8 3050 1ml를 웨이퍼에 세 번째로 바르고 회전하여 100마이크로미터의 포토레지스트를 추가합니다. 웨이퍼를 제거하고 섭씨 135도의 핫플레이트에서 30분 동안 굽습니다. 그런 다음 실온으로 식히고 정렬 표면에 놓습니다.

세 번째 레이어 마스크를 이전 형상에 정렬하고 이전 조건을 사용하여 코팅된 웨이퍼를 9분 동안 노출시킵니다. 노출 후 웨이퍼를 섭씨 135도의 핫플레이트에 1분 동안 올려놓고 실온으로 냉각합니다. 식으면 웨이퍼를 현상액의 교반 욕조에 30분 동안 담가 마스크를 현상합니다.

마지막으로 웨이퍼를 이소프로판올로 세척한 다음 섭씨 135도의 핫플레이트에서 1분 동안 마지막으로 한 번 굽습니다. 개발 된 마스터는 성형 될 때까지 100mm 페트리 접시에 보관하십시오. 플라스틱 컵에 50g의 실리콘 베이스와 5g의 경화제를 결합하여 10:1 PDMS 혼합물을 준비합니다.

내용물을 회전 도구로 혼합한 다음 30분 동안 또는 모든 기포가 제거될 때까지 건조기 내부에서 혼합물의 가스를 제거합니다. 가스가 제거된 PDMS를 준비된 마스터 위에 붓고 3mm의 두께를 만듭니다. 그런 다음 추가 가스 제거를 위해 페트리 접시를 데시케이터에 다시 놓습니다.

모든 거품이 제거되면 장치를 섭씨 80도에서 80분 동안 굽습니다. 냉각되면 장치 측면에서 120마이크로미터 및 220마이크로미터 원격 기하계에 모두 접근할 수 있도록 메스를 사용하여 금형에서 장치를 절단합니다. 그런 다음 0.75mm 생검 펀치로 유체 입구와 출구를 펀칭합니다.

플라즈마는 300와트 플라즈마 클리너에서 20초 동안 사전 세척된 유리 슬라이드와 1mbar 산소 플라즈마와 함께 기능이 위로 향하도록 장치를 처리합니다. PDMS 장치의 패턴이 있는 면을 유리 슬라이드의 플라즈마 처리된 면에 단단히 배치하여 장치를 접착합니다. 그런 다음 장치를 섭씨 80도의 장치 오븐에 넣고 조립된 장치를 40분 동안 다시 넣습니다.

구워지면 주사기를 사용하여 불소 표면 처리 유체로 장치를 세척하여 채널을 소수성으로 만듭니다. 그런 다음 즉시 장치를 섭씨 80도에서 10분 동안 굽고 용매를 증발시킵니다. 광섬유의 마지막 5mm에서 절연체를 제거하여 두 개의 레이저 여기 광섬유를 준비합니다.

또한 더 큰 광섬유의 마지막 5mm에서 절연체를 제거하여 형광 신호를 수집하기 위한 광섬유를 준비합니다. 현미경으로 모든 섬유의 끝을 검사하십시오. 팁이 평평한 표면에서 끝나지 않으면 섬유 스크라이브로 끝을 청소하십시오.

다음으로, 레이저 파이버 커플러를 50밀리와트, 405나노미터 레이저에 연결하고 105마이크로미터 코어 파이버 중 하나를 레이저에 연결합니다. 레이저 파워 미터 센서의 벗겨진 끝을 지시하고 레이저 커플러의 미세 조정을 사용하여 레이저 출력을 최대화합니다. 50밀리와트, 473나노미터 레이저를 사용하여 다른 광섬유를 조정하기 위해 동일한 프로세스를 수행합니다.

그런 다음 렌즈 튜브를 사용하여 광 증배관에 쿼드 대역통과 필터를 장착하여 레이저 광을 차단하고 방출된 형광을 투과시킵니다. 광 커플러를 연결하여 빛이 광 승수 튜브에 닿기 전에 필터를 통과하도록 합니다. 다음으로, 수집 광섬유를 광섬유 커플러에 부착합니다.

제작된 미세유체 칩을 최소 100마이크로초의 셔터 속도를 낼 수 있는 디지털 카메라와 결합된 도립 현미경의 스테이지에 놓습니다. 측면에서 조심스럽게 작업하면서 473 나노미터 레이저에 결합된 광섬유를 가장 먼 업스트림 120마이크로미터 채널에 삽입합니다. 주 흐름 채널에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 405 나노미터 레이저에 결합된 광섬유를 가장 먼 다운스트림 120마이크로미터 높이의 측 채널에 삽입하여 300마이크로미터의 광섬유 간격을 제공합니다. 마지막으로, 더 큰 광 승수 튜브 결합 광섬유를 두 개의 레이저 여기 광섬유에 수직인 220마이크로미터 높이의 채널에 삽입합니다. 2% 이온 불소수계면활성제가 함유된 HFE 7500으로 채워진 5ml 주사기를 채우고 PE2 튜브를 사용하여 감지 장치의 스페이서 오일 주입구에 장착합니다.

다음으로, 주사기에 FITC와 파란색 염료 에멀젼이 혼합되어 주입하고 PE2 튜브를 사용하여 액적 재주입 주입구로 장치에 결합된 수직 방향 주사기 펌프에 장착합니다. 장치 출구에서 폐기물 용기까지 길이의 PE 튜브를 연결합니다. 그런 다음 오일과 물방울이 장치에서 정기적으로 결합되어 하류로 흐르는 것으로 보일 때까지 시간당 1, 000 마이크로 리터로 각 펌프를 실행하여 장치를 프라이밍합니다.

스페이서 오일이 시간당 6, 000 마이크로 리터, 액적이 시간당 100 마이크로 리터로 흐르도록 유량을 조정하여 검출 영역을 통해 이동하는 액적 사이에 상당한 간격을 제공합니다. 그런 다음 레이저를 켜고 데이터 수집 프로그램을 시작합니다. 다음으로, 기준선 잡음 플로어의 100배 이상인 신호를 제공하도록 광 승수 튜브 게인을 조정합니다.

마지막으로, 모든 이중선 피크가 선형으로 확장된 단일 시간 추적에서 명확하게 보이도록 레이저 출력을 조정합니다. 검출 채널을 통해 흐르는 액적은 각 레이저 결합 광섬유 앞에서 개별 여기 영역을 만납니다. 검출 파이버는 액적이 한 여기 영역에서 다음 여기 영역으로 이동하는 데 걸리는 시간과 상관관계가 있는 피크 분리와 함께 시간적 변화와 함께 방출된 형광을 기록합니다.

따라서 추가 광 필터링과 별도의 광 증배관이 필요하지 않습니다. 검출 계획의 효능은 405 나노 미터와 473 나노 미터에서 여기하는 염료를 포함하는 액적의 혼합 에멀젼을 검출하여 테스트되었습니다. 이 그래프는 약 50Hz로 흐를 때 재주입된 4가지 액적 유형 간의 명확한 분리를 보여줍니다.

검출기의 동적 범위와 절대 감도는 플루오레세인 전용 액적을 측정하여 조사했습니다. 이 데이터는 0.1에서 100 나노몰 범위의 염료 농도를 감지하는 시스템의 능력을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 삽입된 광섬유 어레이와 단일 광 검출기를 활용하여 간단하고 컴팩트한 형광 검출 시스템을 구현하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.