Name: 3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 학습하세요 3차원 영상 및 형광 면역조직화학법을 사용하여 인간 피부 생검에서 표피 내 신경 섬유의 미토콘드리아를 시각화하고 정량화하는 방법을. 이 기술은 복잡한 신호에서 특정 미토콘드리아 신호를 분리하여 신경학적 질환의 기전을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품 신경과 연구는 프로그램 NS061039 01A2 건강 보조금 K08의 국가 학회에 의해 지원 되었다 &#38; 발견, 그리고 미시간 대학에서 A. Alfred Taubman 의료 연구 연구소. 이 작품은 형태학 및 이미지 분석 핵심 미시간 당뇨병 연구 센터, 국립 연구소의 당뇨병과 소화와 신 장병에서 5 P 90 DK-20572 건강 그랜트의 국가 학회에 의해 투자의 사용. 저자는 인간의 피부 샘플의 그들의 관대 한 기부에 대 한 제이 로빈슨 싱글톤과 A. 고 든 스미스 (유타 대학) 감사 하 고 싶습니다.

피부 펀치 생체 검사 (솔트 레이크 시티, 유타) 유타 대학 당뇨병 센터에서 큰 지역 사회 기반의 1 차 진료소 네트워크에서 모집 된 과목에서 얻은 했다. 이 연구는 미시간 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었고 헬싱키의 선언의 신조를 준수. 테스트 하기 전에 각 주제에서 동의 얻어 작성.
 1. 형광 Immunohistochemistry <ol><li>intraepidermal 신경 섬유 immunohistochemistry 위한 준비 펀치 생 검: <ol><li>수행 3mm 피부 biopsies 의료 여 직원을 1.5에서 전체 생 장소 mL 잠 &#39; s 통 솔루션 (2 %paraformaldehyde, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.4에에서 0.3% 포화 picric 산) 4 ° C 하룻밤에.</li>
		<li>16-24 h 또는 샘플 싱크 때까지 4 ° C에서 30% 자당의 솔루션 샘플 PBS에 린스.</li>
		<li>최적의 절삭 온도에 소스 샘플 화합물 (10 월)는 cryomold를 사용 하 여. 금형에서 아래로 향하게 하는 표 피와 전체 3mm 생을 놓고 약 2 mL 10 월 동결 건조 얼음에 형의 몰드를 채울 합니다. 저장소 사용 하 여 준비까지-80 ° C에.</li>
		<li>잘라 50 µ m 두께 cryostat를 사용 하 여 횡단면 고 180 µ L 부동 액 스토리지 솔루션을 사용 하 여 잘 (30% 에틸렌 글리콜, PBS에서 30% 글리세롤) 당 96 잘 접시의 개별 우물에 저장 합니다. 다음 방향 96 잘 접시의 8 우물입니다. 서로 떨어져 200-300 µ m에서 각 생 사이트 섹션 얼룩.</li>
	</ol></li></ol> 1 일: <ol start="2"> <li>지층 corneum의 일반적인 라벨 끄다: <ol><li>레이블 96 잘 접시 그림 1에서 보듯이.</li>
		<li>피펫으로 150 µ L 줄이기 위해 각 우물에 이차 항 체 34 , 35의 일반적인 바인딩 재고 신호 증강 솔루션의. 전송 섹션 inoculating 루프를 사용 하 여 신호 증강 솔루션으로. 
		참고: 조직 손상 또는 찢 어 조직 섹션을 피하기 위해 함께 작업 하는 동안 주의. 플랫 로커에 실 온에서 30 분 동안 신호 증강 솔루션에서 유지.</li>
		<li>준비 린스 각 우물에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 150 µ L을 추가 하 여 행 2와 3 96 잘 접시의 우물.</li>
		<li>신중 하 게 행 2와 실 온에서 10 분의 1 x PBS에 린스 섹션 전송.</li>
		<li>린스 (3 행) 실 온에서 10 분에 대 한 1 x PBS에 두 번째 시간.</li>
	</ol></li> <li>5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 차단 솔루션 준비: <ol><li>준비 5 %BSA 포함 하는 솔루션을 차단 하는 5%와 0.3% 트리톤 X 100 (TX-100) 0.1 M PBS (표 1 참조) 섹션 동안에 잠복기는 신호 증강 해결책입니다. BSA는 솔루션으로 쉽게 이동 하지 않습니다. BSA는 완전히 해소 될 때까지 소용돌이 솔루션.</li>
		<li>각 우물에 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 96 잘 접시의 4 행에 차단 우물 준비.</li>
		<li>솔루션을 차단 하는 5 %BSA 개별 우물으로 섹션을 전송 하 고 섹션 평면 로커에 실 온에서 1-2 h에 대 한 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 품 어.</li>
	</ol></li> <li>1 %BSA 솔루션 및 주요 항 체의 희석을 rinsing 준비: <ol><li>TX-100 0.1 M PBS (표 2 참조) 동안 섹션 준비 1 %rinsing 솔루션 1 %BSA 0.3%를 포함 하는 5 %BSA 차단 솔루션에서 잠복기. BSA는 솔루션으로 쉽게 이동 하지 않습니다. BSA는 완전히 해소 될 때까지 소용돌이 솔루션.</li>
		<li>섹션 5 %BSA 차단 솔루션에 잠복기는 하는 동안 1% BSA rinsing 솔루션에서 기본 항 체 희석.
		<ol><li>1500 µ L의 1 차적인 항 체 솔루션을 만들고 각 추가 행 5에서 잘.</li>
			<li>희석 주 항 체: 신경 관련 레이블, 토끼 polyclonal 항 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP9.5)를 사용 하 여 1:1, 000에. 미토 콘 드리 아-특정 라벨을 사용 하 여, 단일 클로 널 항 pyruvate 효소 E2/E3bp 항 체 (PDH) 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 1: 100에서 마우스.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>준비 1 차 항 체: <ol><li>피펫으로 150 µ L 각 1 차적인 항 체의 잘에 96 잘 접시의 5 행.</li>
		<li>루프 도구를 사용 하 여 1 차적인 항 체를 포함 하는 5 행에 차단 솔루션 (4 행)에서 전송 섹션.</li>
		<li>단단히 밖으로 건조에서 그것을 지키려고 parafilm으로 접시 포장.</li>
		<li>1 시간 실 온에서 평면 로커에 샘플을 놓고 다음 하룻밤 플랫 로커에 4 º C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol></li></ol> 주 2: <ol start="6"> <li>린스 샘플: <ol><li>행 6, 7, 8 각 우물에 솔루션을 rinsing 1 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 96 잘 접시의 준비 린스 우물.</li>
		<li>첫 1% BSA rinsing 솔루션 (6 행)에 섹션을 전송 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 린스 섹션 1 %BSA 실 온에서 7과 1 시간에 8 행에 솔루션을 rinsing에 잠복기에 의해 두 번 더 반복.</li>
	</ol></li> <li>1 %BSA 솔루션을 rinsing에 이차 항 체 희석: <ol><li>이차 항 체 솔루션 섹션 1 %BSA 솔루션 (8 행)을 rinsing의 마지막 린스에 잠복기는 하는 동안 만들 1500 µ L.</li>
		<li>이차 항 체 희석: PGP9.5 (녹색 형광 활용된 염소 안티 토끼 항 체, 1:1000), 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 PDH (레드 형광 활용된 염소 반대로 마우스, 1:1, 000)에 대 한 대 한.</li>
	</ol></li> <li>준비 이차 항 체: <ol><li>96 잘 접시의 9 행으로 이차 항 체의 피펫으로 150 µ L.</li>
		<li>부드럽게 이차 항 체 웰 스 (행 9)에 해결책 (8 행)을 rinsing 1 %BSA 섹션을 전송.</li>
		<li>사용 parafilm 랩 단단히 밖으로 건조에서 그것을 지키려고 접시. 커버 알루미늄 호 일. 1 시간에 대 한 실 온에서 평면 로커에 샘플을 놓고 다음 하룻밤 플랫 로커에 4 ˚C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol></li></ol> 제 3 일: <ol start="9"> <li>준비는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 여 1 x PBS 청소: <ol><li>피펫으로 150 µ L의 행 10, 11 및 12에 1 x PBS를 필터링.</li>
		<li>행 10 샘플을 전송 하 고 실 온에서 1 h 1 x PBS에 씻어. 커버 알루미늄 호 일로 96 잘 접시 고 린스 동안 플랫 로커에 놓습니다. 반복 필터링 PBS 린스 2 x 1 번 더 각 행 11 및 12에에서 실 온에서 1 h.</li>
	</ol></li> <li>현미경 슬라이드 조직 단면도 장착을 위한 준비: <ol><li>장소 50 µ L의 필터링 슬라이드 1 x PBS.</li>
		<li>50으로 1 x PBS (행 12)에서 전송 섹션 µ L 드롭. 신중 하 게 조직 전개 하 고 부드럽게 유리 슬라이드에 병합 하 여 PBS의 드롭에 섹션을 배치 합니다. 유리 피 펫을 장착 시 약 희석을 피하기 위해 초과 PBS를 제거 합니다. 섹션 유리 전구를 만지지 마십시오.</li>
		<li>피펫으로 1-2 방울 DAPI를 포함 하는 사용 하 여 현미경 슬라이드 섹션 위에 직접 장착 시 약의 관리 섹션의 방향을 방해 하지. 부드럽게 섹션 50 mm x 24 mm #1.5 현미경 유리 coverslip 장소.</li>
		<li>고는 coverslip 배치 하면서 형성 된 기포는 coverslip 가장자리에서 과잉 액체를 닦아. 새 슬라이드를 준비 하 고 장착 홍보를 반복각 섹션에 대 한 ocess.</li>
		<li>치료/건조 실 온에서 어두운 하룻밤에 슬라이드를 삽입 하 여 설치 미디어. 슬라이드 4 ° C 또는-20 ° C (2 주 이상) 장기 저장을 위한 단기 (1-2 주)에 대 한 전송. 
		주: 부정적인 컨트롤 단계 1.4.2.2에서에서 PGP9.5 또는 PDH에 대 한 1 차 항 체를 생략 하 고 신경이 나 표 피에서 미토 콘 드리 아의 구별할 수 없는 라벨 표시. 컨트롤이 수행한 긍정적인는 PDH에 대 한 항 체 그것을 증명 하기 위해 레이블이 모든 미토 콘 드리 아 (데이터 표시 되지 않음). 녹색 형광 단백질 (GFP) 신호 레이블 미토 콘 드리 아를 잠재로 불리고 그리고 다음 고정 되었고 PDH 항 체와 붉은 형광 스테인드 교양된 기본 마우스 지 루트 ganglion 신경에 긍정적인 컨트롤 수행 이차 항 체입니다. GFP를 표현 했다 모든 미토 콘 드리 아 공동 PDH immunohistochemistry (데이터 표시 되지 않음)에 대 한 레드 라벨으로 분류 했다.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocal 영상 <ol><li>confocal 영상 수행: <ol><li>수집 이미지는 거꾸로 한 현미경에 기름 침수 (1.25 숫자 조리개 (없음)) 목표 X 40 confocal 현미경 스캐닝 레이저를 사용 하 여.
		<ol><li>각 초점면에서 순차적으로 형광 신호 취득: 핵: 여기 λ = 405 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 420-480 nm 신경 섬유: 여기 λ = 488 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 505-560 nm Mitoch ondria: 여기 λ = 543 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 606-670 nm</li></ol></li> <li>현미경 소프트웨어에 다음과 같은 검색 매개 변수를 입력: 2 프레임 평균 및 2.2;의 확대와 함께 600 Hz의 스캔 속도 12 비트 강도 해상도 (4096 회색 수준)입니다.
		<ol><li>설정 최적화 측면 검사용 현미경 소프트웨어 (스캔 해상도 1024 x 1024 =) 및 축 해상도/광학 단면 (confocal 조리개 z 단계 크기 210의 = 1 공기 단위 (AU) nm). 
			참고: 결과 XYZ 해상도 172.2 x 30-50 µ m x 176.1 µ m x 176.1 µ m의 이미지 크기와 172.2 nm x 210 nm nm.</li>
		</ol></li> <li>신경 신호 (그린 형광)에 대 한 실시간 검색을 활성화 하 고 찾아서 설정 상단 z-초점 조정 조직 섹션 내에서 신경 신호를 포함 하는 현미경 소프트웨어에 초점 비행기를 내립니다. 총 z 범위는 일반적으로 30-50 µ m 50 µ m 조직 섹션.</li>
		<li>표 피는 가로 또는 세로로 위치에 이미지 라이브 검색 중 현미경 소프트웨어 검색 필드를 회전.</li>
		<li>별도로 각 신호를 스캔 하 고 검출기 (광 전 증폭 관 관, PMT) 조정 전압 및 오프셋 어떤 이상과 포화 픽셀에서 최소화/제거. 
		참고: 위의 매개 변수 검사 시간이 걸릴 z 조각 수에 따라 약 20-40 분.</li>
	</ol></li></ol> 3. 3D 시각화 및 분석의 미토 콘 드리 아 내에서 인간 Intraepidermal 신경 섬유 <ol><li>3D 표 피 분리: <ol><li>원본 이미지를 복제 하 고 최대 강도 사용 하 여 식별 하 고 표 피를 분리 하는 이미지의 (초점 보기 확장) 프로젝션.</li>
		<li>결 석 지층 corneum 피부 등의 원치 않는 영역을 제거 하려면 표 피의 위쪽과 아래쪽 가장자리를 따라 추적 도구 관심의 영역을 사용 intraepidermal 신경 섬유의. 이 선택 영역을 자르기.</li>
	</ol></li> <li>신경 및 미토 콘 드리 아 형광 신호에 사용 deconvolution: 참고: Deconvolution 형광 신호 무결성을 복원 하는 데 도움이. 이미지에 그들의 원래 소스에서 신호를 확산 하는 얼마나 많은 결정 하는 형광 신호를 사용 하기 때문에이 프로토콜에서 사용 하는 복원 장 님 deconvolution 이라고 (지점 확산 기능). 프로세스는 그것의 원래 위치에 다시 확산 신호를 재할당 함으로써 신호 해상도를 향상 시킵니다.
	<ol><li>계산 지점 확산 기능 (PSF) 녹색 형광 신경 신호 (그린 형광)에 대 한 다음 매개 변수: <ol><li>설정 계산된 PSF confocal. 1.25 1.515 숫자 조리개를 중간 굴절 인덱스를 설정 합니다. 핀 홀 탐지기 1 공기 단위 (거리)를 설정 합니다. 설정된 레이저 여기 파장 488 nm 및 방출 파장 515 nm.</li>
		</ol></li> <li>PSF 빨간 형광 미토 콘 드리 아 신호 (레드 형광)에 대 한 다음 매개 변수 계산: <ol><li>세트 confocal PSF 계산. 1.25 1.515 숫자 조리개를 중간 굴절 인덱스를 설정 합니다. 핀 홀 탐지기를 1로 설정 AU. 617 543 nm 및 방출 파장을 설정된 레이저 여기 파장 nm.</li>
		</ol></li> <li>Deconvolution 해당 PSFs를 사용 하 여 신경 및 미토 콘 드리 아 형광 신호는 위에 나열 된 최적화와 반복 복원 기능 설정 100% 자신감 10 사이클의 반복 제한.</li>
	</ol></li> <li>신경 특정 표면 작성: <ol><li>사용은 &#34; 서피스를 생성 &#34; 도구 deconvolved 녹색 형광 보조 라벨에 PGP9.5의에서 신경의 단단한 표면을 식별 신경.</li>
		<li>Uncheck는 &#34; 부드러운 &#34; 기능을 사용 하 여 절대 강도 기능 신경 신호에 대 한 임계값을 설정 하는 때문에 그것은 상당히 밝은 배경 형광 보다.</li>
		<li>절대 강도 기능 사용 하 여 신경 신호에 대 한 임계값을 설정 하는 때문에 그것은 크게 배경 형광 보다 밝은. 정확 하 게 식별 하는 신경을 충분히 낮은 임계값 설정.</li>
		<li>필터 작은, 비 신경 표면 밖으로 크기에 따라. 
		참고: 필요한 경우 수동으로 편집 내 추가 비 신경 서피스는 &#34; 편집 &#34; 여러 개체를 강조 하기 위해 제어 키를 누른 다음 Delete 키로 삭제 탭.</li>
	</ol></li> <li>격리 신경 특정 형광 미토 콘 드리 아 신호: <ol><li>볼 신경 표면의 편집 탭을 선택 하는 &#34; 마스크 속성 &#34; 기능. 단계 3.3에서에서 만든 신경 표면은 keratinocytes와 관련 된 미토 콘 드리 아 신호에서 그 신경 내의 미토 콘 드리 아를 격리 하는 데 사용 됩니다.</li>
		<li>로 &#34; 마스크 모든 &#39; 엽니다 단추는 &#34; 마스크 채널 &#34; 창, 풀 다운 메뉴 아래에서 deconvolved 레드-형광 신호를 선택 &#34; 채널 선택 &#34; 미토 콘 드리 아 신호.</li>
		<li>확인 표시를 넣어 하 고 상자에 클릭 합니다 &#34; 마스크를 적용 하기 전에 중복 채널 &#34; 옵션.</li>
		<li>클릭 라디오 버튼의 앞에 &#34; 일정 내부/외부 &#34; 확인 표시를 넣어 하 고 마스크 설정 상자에서 클릭 옵션은 &#34; 설정에 외면 복 &#34; 옵션 및 입력 값에 대 한 0.00. 확인을 클릭 버튼을 만들 신경 표면 내 미토 콘 드리 아 신호를 나타내는 새로운 채널.</li>
	</ol></li> <li>미토 콘 드리 아-특정 표면 작성: <ol><li>사용은 &#34; 서피스를 생성 &#34; 도구를 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호를의 새로 만든된 형광 채널에서는 미토 콘 드리 아의 단단한 표면 3.4 단계.</li>
		<li>Uncheck는 &#34; 부드러운 &#34; 기능 및 선택은 &#34; 배경 빼기 &#34; 임계값을 설정 하는 기능. 이 기능은 미토 콘 드리 아 신호 주변 지역 대비를 사용 하 여 배경에서 미토 콘 드리 아를 식별.</li>
		<li>세트 미토 콘 드리 아를 정확 하 게 식별 하 게 충분히 낮은 임계값 값입니다. 이 예제에서 더 낮은 임계값 2000 16 비트 (65536) 규모에 대 한 설정 했다.</li>
		<li>필터 크기에 따라 미토 콘 드리 아 표면. 이 예제에서는 1.0 복 복 제한 설정, 최저는 제한 가능 합니다. 필요한 경우 수동으로 내 미토 콘 드리 아 비 표면에 밖으로 편집 된 &#34; 편집 &#34; 여러 개체를 선택 하려면 CONTROL 키를 누른 다음 Delete 키로 삭제 탭. 
		참고: 때때로, 소프트웨어가 만들어집니다 구별할 수 형광 미토 콘 드리 아 신호 연결 되지 않은 표면. 이러한 경우에, 그것은 그들을 제거할 수 있는 &#34; 편집 &#34; 탭</li>
	</ol></li> <li>수출 분석에 대 한 형태학 값 계산: <ol><li>신경 및에서 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 값을 내보내기는 &#34; 통계 &#34; 전자 스프레드시트 소프트웨어와 추가 분석을 위해 탭.</li>
		<li>신경 및 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 볼륨 값을 내보낼.</li>
		<li>개별 신경 섬유에 각 이미지의 수를 세 고 전자 스프레드시트에 값을 기록.</li>
		<li>각 이미지에 대 한 전자 스프레드시트에서 분석에 대 한 다음 잠재적인 값 계산: <ol><li>모든 신경 표면 위한 볼륨 합계.</li>
			<li>필터 보다 0.02 µ m 3와 빈의 볼륨 아래 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 밖으로 표면 크기. 예를 들어 0.02-같은 저장소를 사용 하 여 0.04 0.04-0.08, 0.08-0.16, 0.16-0.32, 0.32-0.64, 0.64-1.28 1.28-2.56, 2.56 µ m 3 보다 큰. 
			참고: 0.02 µ m 3 mitonchodria 36 , , 37 38의 이전 게시 된 볼륨에 따라 미토 콘 드리 아 볼륨의 하한값 설정.</li>
			<li>쓰레기통 (0.02-2.56 µ m 3 이상)를 통해 각 빈 내 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 수와 표면의 총 수를 계산.</li>
			<li>신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 각 빈에서의 비율을 계산합니다. 수를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 표면의 총 수로 나눈 빈 당.</li>
			<li>모든 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 볼륨 합계.</li>
			<li>모든 미토 콘 드 리아 표면 볼륨의 합으로 총 신경 표면 볼륨을 분할 하 여 미토 콘 드리 아 신호 신경의 비율을 계산.</li>
			<li>모든 미토 콘 드 리아 표면 수로 총 신경 표면 볼륨을 분할 하 여 신경 볼륨 당 미토 콘 드리 아의 수를 계산.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

아니 충돌의 관심 선언.

이 프로토콜은 분리, 계량 및 크기와 인간의 피부 생 검에서 3d에서 IENFs 내 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분포 분석 설계 되었습니다. 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 부동성 형광 immunohistochemistry는 얼룩 답사 연구44,45에 대 한 다양 한 방법론을 제공 하는 각 샘플에서 여러 신호를 분석 하 고 설계 되었습니다. 이 절차는 confocal 현미경 이미지 및 3D 분석에 필요한 50 µ m 섹션에 걸쳐 이미지 수집을 극대화 하기 위해 조직에 항 체의 침투에 대 한 수 있습니다. 또 다른 중요 한 단계는 이미지 수집 매개 변수를 측정 하는 미토 콘 드리 아에 대 한 해상도 유지 하면서 이미지 당 충분 한 신경을 캡처 사이 균형 이다. 조직 섹션에 사용 하 고 표준 피부 생 검 프로토콜은 약 3 m m 긴45,,</su...

미토 콘 드리 아 세포 에너지, 칼슘, 그리고 괴 규제, apoptotic 세포 죽음1,2,3버퍼링 생산을 포함 하는 중요 한 세포 기능을 제공 합니다. 신 경계는 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 뉴런 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 형태로 세포 에너지의 높은 수준의 생성 제안 몸4 에 비해 높은 신진 대사 속도 있다. 많은 신경 기능 ATP5,6시 냅 스 특히 의존 하는 증거 문서. 따라서, 신경 세포 내 미토 콘 드리 아의 유통이 중요 합니다.
정보를 많이 보여주었다는 인신 매매와 신경 미토 콘 드리 아의 도킹 지난 10 년 동안은 매우 통제. 모터 단백질 신경 통해 특정 세포 구획을 미토 콘 드리 아를 배포에서 포함 된다. 뉴런 프로젝트 축 삭과 dendrites soma에서 멀리 떨어져 있기 때문에 미토 콘 드리 아의 인신 매매 하는 것이 특히 중요 합니다. Kinesin 모터 단백질 주로 직접 (소마)에서 참가자 다 모터 단백질 직접 (소마) 쪽으로 역행 운동7,,89 동안 microtubules 따라 미토 콘 드리 아의 매매 , 10. 같은 미토 콘 드리 아 막 잠재력과 존재와 미토 콘 드리 아 밀매11,,1213의 방향에 영향을 주는 충 동 전도 셀룰러 신호가 있다.
미토 콘 드리 아, 수송 이외에 미토 콘 드리 아 노드의 Ranvier, 시 냅 스8,14, 등의 높은 에너지 요구를 있는 특정 세포 구획을 지역화 하려면 특수 단백질 17. 사실, 축 삭 내의 미토 콘 드리 아의 대다수는 비 운동9,13,18. Syntaphilin 앵커 걸 골격19-21을 다른 단백질 앵커 미토 콘 드리 아 동안 축 삭을 따라 microtubules에 미토 콘 드리 아 같은 특수 단백질. 성장 인자와 같은 칼슘 이온의 미토 콘 드리 아 운동 어디 그들은 필요한21,,2223지역에 지역화를 지원 하기 위해 보고 되었다.
함께 찍은, 밀매 하 고 미토 콘 드리 아의 도킹 뉴런의 적절 한 기능을 위해 생명 이다. 이 지원 중단 미토 콘 드 리아 인신 매매에 연결 되었습니다 Alzheimer의 질병, 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, Huntington의 질병, 유전 경련을 포함 하 여 여러 신경학 상 조건 paraparesis, 그리고 광섬유 위축15,,2425,26,27. 최근 연구 결과 당뇨병 신경 병, 당뇨병28,,2930,31과 관련 된 감각 손실에 대 한 잠재적인 메커니즘으로 미토 콘 드 리아 기능 장애 및 병 리에 집중 했다 ,,3233. 가설은 당뇨병 피부 신경 결말의 감각 계획 내의 미토 콘 드리 아의 배포 변경입니다. 따라서, 기술은 시각화 하 고 계량 미토 콘 드리 아 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs), 지 루트 신경 절 감각 afferents의 원심 끝에 내에서 개발 되었다. 기술을 결합 하 여 특정 미토 콘 드리 아와 신경 섬유 라벨의 형광 immunohistochemistry confocal 현미경 검사 법부터 z-시리즈 수집 관련 신경의 분포를 측정 하기 위해 강력한 3 차원 이미지 분석 소프트웨어와 신호 미토 콘 드리 아에서 인간의 피부 펀치 생 검이이 목표를 달성 하기 위해.

<table><tbody><tr><td>2% Zamboni's Fixative</td><td>Newcomer Supply, 위스콘신주 미들턴&nbsp;</td><td>1459A</td><td>2% 파라포름알데히드, 0.2% 포화 피크르산 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4</td></tr><tr><td>10x 인산염 완충 식염수(PBS)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>BP399-4</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>Image-iT FX Signal Enhancer</td>를 구성하기 위해 <td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>I36933</td>은 <td>비특이적 결합을 줄여 Alexa Fluor 염료 신호를 향상시킵니다</td></tr>. <tr><td>Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td><td>Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td><td>14730-1-AP</td><td>PGP9.5로 약칭되며 단종된 AbD Serotec(Cat. No. 7863-0504) 항체</td></tr><tr><td>Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td><td>abcam, Cambridge, MA</td><td>ab110333</td><td>약칭</td></tr>: <tr><td>PDH Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11034</td><td>red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11032</td><td>녹색 형광 접합 2차 항체</td></tr><tr><td>알부민, Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A7906-100</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T9284</td><td>TX-100</td></tr><tr><td>0.22 &micro로 약칭; m 필터</td><td>EMD Millipore, Billerica MA</td><td>MILLEX GP SLGP 033NS</td><td>0.22 &마이크로; m Millipore 필터</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>13-374-10</td><td>Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td></tr><tr><td>Non-calibrated Loop</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>22-032092</td><td>Decon LeLoop (MP 199-25)</td></tr><tr><td>96-well Assay Plate</td><td>Corning Incorporated, Corning, NY</td><td>3603</td><td>96-well flat bottom plate</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>P-36931</td><td>핵의 DAPI 염색</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리 50 x 24 mm</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-544E</td><td>Coverslips</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-550-15</td><td>현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>Leica SP5 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td><td>SP5</td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>Volocity x64 소프트웨어&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td><td>버전 4.4.0</td><td>Volocity 소프트웨어는 이미지 처리</td></tr><tr><td>Imaris x64 3 차원 분석 소프트웨어</td><td>Bitplane, Concord, MA</td><td>버전 7.7.1</td><td>Imaris 소프트웨어는 이미지 분석 프로토콜의 3.3 단계부터 3.5 단계까지 사용됩니다</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft, Redmond, WA</td><td>버전 Office 2013</td><td>엑셀 스프레드시트 소프트웨어는 형태 측정 기능을 요약하기 위해 프로토콜의 3.6단계에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>최적 절단 온도 화합물</td><td>Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td>약칭 OCT</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td><td>CM1850</td><td>Cryostat for cutting 50 &micro; m 절편</td></tr><tr><td>CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>C10600</td><td>녹색 형광 신호로 미토콘드리아를 표지하기 위한 포지티브 컨트롤로 사용</td></tr></tbody></table>

3 차원 영상 및 인간 intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

이 프로토콜의 목표 intraepidermal 신경 섬유 내에서 미토 콘 드리 아 연구입니다. 따라서, 3D 이미징 및 분석 기술은 신경 특정 미토 콘 드리 아를 격리 하 여 평가 하는 감각 신경의 말 초에 있는 미토 콘 드리 아의 질병 유발 변경 개발 되었다. 프로토콜 형광 immunohistochemistry, confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 분석 기법을 결합 합니다. 상세한 매개 변수는 이러한 기술을 사용 하 여 신경 특정 미토 콘 드리 아를 분리 하는 방법의 구체적인 예를 제공 하기 위해 절차를 통해 정의 됩니다. 항 체 신경 라벨을 사용 했다 하 고 피부의 조직 섹션에서 미토 콘 드리 아 신호 펀치 생 검는 각각 신경 및 미토 콘 드리 아 녹색과 적색 형광 신호를 시각화 하는 간접 면역 형광에 의해 그 뒤를 이었다. 부터 Z-시리즈 이미지 confocal 현미경 검사 법으로 인수 했다 고 3D 분석 소프트웨어 처리 하 고 신호를 분석 하는 데 사용 되었다. 그것은 정확한 매개 변수, 설명에 따라 필요가 없습니다 하지만 얼룩, 수집 및 분석 단계를 통해 선택 하는 것 들과 일치 하는 것이 중요 하다. 이 프로토콜의 힘 그것은 다양 한 상황에 적용 한 형광 신호를 사용 하 여 그렇지 않으면 불가능 한 것을 혼자 공부 하는 다른 신호를 분리 하는 곳입니다.

시각화 및 인간 IENFs 내 미토 콘 드리 아의 정량화
형광 immunohistochemistry 신경, 미토 콘 드리 아, 그리고 핵 시각화를 인간의 피부 생 검으로 여러 신호 동시 라벨에 대 한 수 있습니다. 96 잘 접시 immunohistochemistry 절차의 단계를 구성 하는 편리한 방법입니다. 그림 1 는이 구성 계정에 대 한 솔루션의 12 단계를 통해 처리 될 8 섹션까지 보여준다. 무료-부동 메서드 플랫 로커와 부드러운 동요와 결합 항 체 양쪽에서 섹션 침투에 대 한 충분 한 액세스는 보장 합니다. 프로토콜 기본 및 보조는 항 체 4 ° C에서 지속적으로 신경 및 미토 콘 드리 아를 라벨에 하룻밤 외피 때문에 크게는 완료, 3 일이 걸린다.
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이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

본 이미징 및 분석 기술의 전반적인 목표는 복잡한 신호에서 특정 정보를 분리하는 것입니다. 구체적으로, 본 프로토콜에서는 표피 내의 다른 미토콘드리아와 구분하여 신경 특이적 미토콘드리아를 시각화하고 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 건강한 개인의 표피 내 신경 섬유 속 미토콘드리아가 신경 합병증 환자의 신경 특이적 미토콘드리아와 어떻게 다른지와 같은 신경학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 복잡한 신호에서 특정 정보를 추출할 수 있다는 점입니다. 이 프로토콜은 주변 신호로부터 이 빨대 내부의 신호와 같은 특정 신호를 분리하는 데 도움이 됩니다. 먼저 이 도식에 따라 96-웰 플레이트에 라벨을 붙여 피부 생검 조직의 형광 면역 조직 화학 염색을 준비하십시오.그런 다음 2차 항체의 비특이적 결합을 줄이기 위해 스톡 신호 증폭 용액 150 µL를 첫 번째 행의 각 웰에 피펫으로 분주합니다. 96-웰 플레이트의 두 번째와 세 번째 행의 각 웰에 1x 인산염 완충 식염수를 150 µL씩 넣어 세척 웰을 준비합니다. 그 후 네 번째 행의 웰에 5% BSA 블로킹 용액 150 µL를 추가합니다.1차 항체인 PGP9.5와 PDH를 1% BSA 세척액 1,500 µL에 희석하고, 5행의 각 웰에 150 µL씩 분주합니다. 백금이를 사용하여 절편들을 1행의 신호 증강 용액으로 옮깁니다. 절편들이 5행의 1차 항체 용액에 들어가면, 증발을 방지하기 위해 플레이트를 실험실용 랩으로 단단히 감싼 후 평면 로커를 사용하여 실온에서 1시간 동안 시료를 교반합니다.4°C에서 하룻밤 동안 흔들어주며 배양합니다. 실험 2일 차를 시작하며 96-웰 플레이트의 6, 7, 8행 웰에 1% BSA 세척액 150 µL를 피펫으로 분주합니다. 1,500 µL의 1% BSA에 형광체 결합 2차 항체를 첨가합니다.그런 다음 9행의 각 웰에 2차 항체 용액 150 µL를 피펫으로 분주합니다. 6, 7, 8번 웰을 거치게 하여 절편들을 헹굽니다. 절편들이 9행의 2차 항체 용액에 들어가면, 형광 신호를 보호하기 위해 플레이트를 파라필름으로 감싸고 알루미늄 호일로 덮습니다.이전과 동일하게 흔들어주며 배양합니다. 3일째 되는 날, 멸균 여과된 1x PBS 150 microliters를 10, 11, 12행에 피펫으로 분주합니다. 샘플을 10행으로 옮긴 후 플레이트를 알루미늄 호일로 덮습니다.실온에서 로킹(rocking)하며 1시간 동안 헹굽니다. 다음으로, 슬라이드 위에 필터링된 1x PBS 50 microliters를 피펫팅하여 절편 마운팅을 위한 현미경 슬라이드를 준비합니다. 헹굼 과정이 완료되면, 12행의 절편을 슬라이드로 옮긴 후 DAPI가 포함된 마운팅 시약 1~2방울을 절편 위에 직접 떨어뜨립니다.50 mm x 24 mm 크기의 1.5 커버글라스를 절편 위에 조심스럽게 덮습니다. 슬라이드를 보관하거나 이미징하기 전, 봉입제가 경화될 수 있도록 실온의 암소에서 하룻밤 동안 둡니다. 도립 레이저 주사 공초점 현미경에서 40X 오일 침강 대물렌즈를 선택합니다.핵, 신경 섬유 및 미토콘드리아를 이미지화하는 데 적절한 레이저와 검출기를 선택하십시오. 현미경 소프트웨어에 12-bit 강도 분해능, 2프레임 평균화를 적용한 500 Hertz 스캔 속도, 2.2 배율의 줌 등 다음 스캔 파라미터를 입력하십시오. 스캔 분해능을 1024 by 1024로 선택하여 현미경 소프트웨어가 최적의 수평 분해능을 갖도록 설정하십시오.공초점 조리개(confocal aperture)를 1 air unit으로 선택하고 Z 스텝 크기를 210 nanometers로 설정하여 축 방향 해상도와 광학적 섹셔닝을 최적화하십시오. 각 신호를 개별적으로 스캔하고, 과포화 또는 저포화된 픽셀을 제거하기 위해 검출기 전압과 오프셋을 조정하십시오. 신경 신호에 대해 라이브 스캔을 활성화하고, 현미경 소프트웨어에서 Z 초점 제어 장치를 조정하여 조직 절편 내의 신경 신호를 포함하는 상단 및 하단 초점면을 찾아 설정하십시오.형광 신호의 크로스토크(crosstalk)를 제거하기 위해 순차적 스캔(sequential scanning) 방식으로 최종 Z 시리즈를 스캔하십시오. 원본 이미지의 복제본에서 선택 도구를 사용하여 표피 주변 영역을 지정함으로써, 표피를 각질층 및 진피로부터 분리하십시오. 그런 다음 선택 영역에 맞춰 이미지를 자르십시오.분산 함수 계산 기능을 사용하여 녹색 및 적색 형광 컨포컬 신호에 대한 점 퍼짐 함수(point spread functions)를 계산하십시오. 그런 다음 매질 굴절률은 오일의 경우 1.515로, 40X 오일 대물렌즈의 수치 구경은 1.25로 매개변수를 설정하십시오. 검출기 핀홀을 1 air unit으로 설정하고 레이저 여기 파장을 선택하십시오.반복 복원(iterative restoration)을 100% 신뢰도로 설정하고, 반복 제한을 10회로 지정하며, 녹색 및 적색 형광 신호의 디컨볼루션(deconvolution)을 위해 녹색 및 적색 PSF를 사용하십시오. 표면 생성(create surface) 도구를 사용하여 디컨볼루션된 신경 신호 주변에 표면을 생성하며, 이때 smooth feature 체크를 해제하고, 임계값 설정으로 absolute intensity를 선택하며, 하한 임계값은 3,000, 상한 임계값은 65,535로 설정하십시오. 10 voxels 이상의 표면만 유지하십시오.Nerve surface의 edit 탭을 사용하여 단일 비신경 표면을 선택하거나, Control 키를 누른 상태로 여러 비신경 표면을 선택하여 비신경 표면을 제거합니다. Delete 버튼을 눌러 선택한 비신경 표면을 삭제합니다. Nerve surface의 edit 탭에서 mask properties에 있는 mask all 버튼을 누릅니다.새 창의 채널 선택 항목에서 channel five mitochondria deconvolved를 선택한 다음, 마스크를 적용하기 전 duplicate channel을 체크하십시오. constant inside/outside 라디오 버튼을 누르고 set voxels outside surface를 0.0으로 설정한 뒤 OK 버튼을 누르십시오. 마지막으로, create surface 도구를 사용하여 uncheck smooth feature를 선택하고 임계값 설정을 위해 background subtraction을 사용하여 마스킹된 deconvolved 미토콘드리아 신호 주변에 표면을 생성함으로써 미토콘드리아 특이적 표면을 만드십시오.가장 큰 구체의 직경을 1.50 micrometers로 설정하고, 하한 임계값은 2, 000, 상한 임계값은 최대 65, 535로 설정하십시오. 표면 값은 1.0 voxels 이상으로 유지해야 합니다. 이 대표 3D 공초점 현미경 이미지는 신경 특이적 녹색 형광 신호를 보여줍니다.신경 신호를 나타내는 시안색의 3D 표면을 생성합니다. 그런 다음 신경 표면을 마스킹 도구로 사용하여 나머지 표피 미토콘드리아 신호로부터 신경 특이적 미토콘드리아 신호를 분리합니다. 결과적으로 얻은 신경 특이적 미토콘드리아 적색 형광 신호를 사용하여, 시안색으로 표시된 신경 표면 내의 미토콘드리아 주변에 마젠타색으로 표시되는 표면을 생성합니다.이를 통해 신경 섬유 내의 미토콘드리아를 상세하게 관찰할 수 있습니다. 여기서는 미토콘드리아 표면 데이터를 크기 빈도 히스토그램으로 제시하여, 부피에 따라 다양한 굴곡에 존재하는 미토콘드리아의 백분율을 시각화하였습니다. 이 절차를 수행할 때는 염색 과정 중 조직을 세심히 관리하여, 모든 절편에 걸쳐 균일하고 일관된 염색이 이루어질 수 있도록 조직이 용액에 완전히 잠기게 하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 인간 표피 내 신경 섬유 내의 미토콘드리아를 시각화하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 상세 프로토콜은 신경병증과 같은 미토콘드리아 기반 신경 질환의 발병 기전을 이해하는 것을 목표로, 다른 연구자들이 인간 피부 생검 조직을 염색, 이미징, 처리 및 분석하는 방법을 학습할 수 있도록 설계되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Hamid, H. S., et al. 인간 표피내 신경 섬유 내 미토콘드리아의 3차원 이미징 및 분석. J. Vis. Exp. (2017) 이 비디오는 3차원 이미징을 사용하여 신경 특이적 미토콘드리아를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 사전 라벨링된 표피내 신경 섬유의 순차적 스캔을 획득하고 3D 표면 이미지를 생성하여 신경 구조와 관련된 미토콘드리아를 분리하고 표시하는 프로세스를 간략하게 설명합니다.

Intraepidermal Nerve Fibers 내 미토콘드리아의 시각화

고통스러운 신경 병증 (PN)의 통각 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs)의 변화를 연구하기 위해, 우리는 직접 통각 IENFs에서 관찰 입체 형태 변화를 검사 할 수 프로토콜을 개발했다. IENFs의 3 차원 분석은 PN에 IENF의 형태 학적 변화를 평가하는 잠재력을 가지고있다.

인간의 피부 생검에서 통각 Intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상

동적 길이 이미징 및 기자 형질 전환 생쥐의 신경 종말의 선택적 레이저 병변에 대한 프로토콜은 제공됩니다.

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

포유류 뇌 조직에서 미토콘드리아 시각화 및 분석은 어려운 작업입니다. 여기에서는 연속 블록면 주사 전자 현미경(SBFSEM)의 3차원(3D) 재구성 분석을 사용하여 이 중요한 에너지 생성 소기관의 형태학적 및 체적 분석에 대한 통찰력을 얻는 방법을 설명합니다.

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우리는 광액성 신경필라멘트 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형질성 광섬유 마우스에서 말초 신경의 단일 골수축축에서 신경필라멘트의 축산수송을 분석하는 방법을 설명합니다.

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트랜스제닉 형광 마우스를 사용하여, 살아있는 동물에서 무손상 좌골 신경의 운동 및 감각 축삭 내 엔도솜 및 미토콘드리아의 신호전달의 생체내 축삭 수송을 평가하기 위해 상세한 프로토콜이 기술된다.

축삭 수송의 생체 내 이미징을위한 툴킷 확장

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췌장암 세포의 미토콘드리아 미세구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법

본 연구는 생 체 내 2광자 영상 접근법을 통해 쥐의 앞발 피부에서 저역계 기계수용체(LTMR) 축삭 말단 구조를 시각화하는 방법을 제시합니다. 개별 축삭의 반복적이고 고해상도 영상을 사용하여 이 방법은 발달 과정과 성인에서 피부 감각 회로의 구조와 기능을 연구할 새로운 플랫폼을 제공합니다.

마우스 피부의 촉각 감각 축삭 형태의 생명체 내 2광자 영상

미토콘드리아 염료 표지 말단 미토콘드리아의 국소 주입 시 생 체 내 공초점 현미경 검사. 이 방법은 건강한 근육을 가진 쥐와 병든 쥐의 골격근 조직에서 입증된 개념 증명을 활용하여 고해상도 미토콘드리아 시각화를 제공합니다.

마우스의 근육 및 말단 슈반 세포에서 미토콘드리아 형태의 현장 정량화 방법

학습하세요 3차원 영상 및 형광 면역조직화학법을 사용하여 인간 피부 생검에서 표피 내 신경 섬유의 미토콘드리아를 시각화하고 정량화하는 방법을. 이 기술은 복잡한 신호에서 특정 미토콘드리아 신호를 분리하여 신경학적 질환의 기전을 이해하는 데 활용됩니다.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

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