3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

본 이미징 및 분석 기술의 전반적인 목표는 복잡한 신호에서 특정 정보를 분리하는 것입니다. 구체적으로, 본 프로토콜에서는 표피 내의 다른 미토콘드리아와 구분하여 신경 특이적 미토콘드리아를 시각화하고 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 건강한 개인의 표피 내 신경 섬유 속 미토콘드리아가 신경 합병증 환자의 신경 특이적 미토콘드리아와 어떻게 다른지와 같은 신경학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 복잡한 신호에서 특정 정보를 추출할 수 있다는 점입니다. 이 프로토콜은 주변 신호로부터 이 빨대 내부의 신호와 같은 특정 신호를 분리하는 데 도움이 됩니다. 먼저 이 도식에 따라 96-웰 플레이트에 라벨을 붙여 피부 생검 조직의 형광 면역 조직 화학 염색을 준비하십시오.

그런 다음 2차 항체의 비특이적 결합을 줄이기 위해 스톡 신호 증폭 용액 150 µL를 첫 번째 행의 각 웰에 피펫으로 분주합니다. 96-웰 플레이트의 두 번째와 세 번째 행의 각 웰에 1x 인산염 완충 식염수를 150 µL씩 넣어 세척 웰을 준비합니다. 그 후 네 번째 행의 웰에 5% BSA 블로킹 용액 150 µL를 추가합니다.

1차 항체인 PGP9.5와 PDH를 1% BSA 세척액 1,500 µL에 희석하고, 5행의 각 웰에 150 µL씩 분주합니다. 백금이를 사용하여 절편들을 1행의 신호 증강 용액으로 옮깁니다. 절편들이 5행의 1차 항체 용액에 들어가면, 증발을 방지하기 위해 플레이트를 실험실용 랩으로 단단히 감싼 후 평면 로커를 사용하여 실온에서 1시간 동안 시료를 교반합니다.

4°C에서 하룻밤 동안 흔들어주며 배양합니다. 실험 2일 차를 시작하며 96-웰 플레이트의 6, 7, 8행 웰에 1% BSA 세척액 150 µL를 피펫으로 분주합니다. 1,500 µL의 1% BSA에 형광체 결합 2차 항체를 첨가합니다.

그런 다음 9행의 각 웰에 2차 항체 용액 150 µL를 피펫으로 분주합니다. 6, 7, 8번 웰을 거치게 하여 절편들을 헹굽니다. 절편들이 9행의 2차 항체 용액에 들어가면, 형광 신호를 보호하기 위해 플레이트를 파라필름으로 감싸고 알루미늄 호일로 덮습니다.

이전과 동일하게 흔들어주며 배양합니다. 3일째 되는 날, 멸균 여과된 1x PBS 150 microliters를 10, 11, 12행에 피펫으로 분주합니다. 샘플을 10행으로 옮긴 후 플레이트를 알루미늄 호일로 덮습니다.

실온에서 로킹(rocking)하며 1시간 동안 헹굽니다. 다음으로, 슬라이드 위에 필터링된 1x PBS 50 microliters를 피펫팅하여 절편 마운팅을 위한 현미경 슬라이드를 준비합니다. 헹굼 과정이 완료되면, 12행의 절편을 슬라이드로 옮긴 후 DAPI가 포함된 마운팅 시약 1~2방울을 절편 위에 직접 떨어뜨립니다.

50 mm x 24 mm 크기의 1.5 커버글라스를 절편 위에 조심스럽게 덮습니다. 슬라이드를 보관하거나 이미징하기 전, 봉입제가 경화될 수 있도록 실온의 암소에서 하룻밤 동안 둡니다. 도립 레이저 주사 공초점 현미경에서 40X 오일 침강 대물렌즈를 선택합니다.

핵, 신경 섬유 및 미토콘드리아를 이미지화하는 데 적절한 레이저와 검출기를 선택하십시오. 현미경 소프트웨어에 12-bit 강도 분해능, 2프레임 평균화를 적용한 500 Hertz 스캔 속도, 2.2 배율의 줌 등 다음 스캔 파라미터를 입력하십시오. 스캔 분해능을 1024 by 1024로 선택하여 현미경 소프트웨어가 최적의 수평 분해능을 갖도록 설정하십시오.

공초점 조리개(confocal aperture)를 1 air unit으로 선택하고 Z 스텝 크기를 210 nanometers로 설정하여 축 방향 해상도와 광학적 섹셔닝을 최적화하십시오. 각 신호를 개별적으로 스캔하고, 과포화 또는 저포화된 픽셀을 제거하기 위해 검출기 전압과 오프셋을 조정하십시오. 신경 신호에 대해 라이브 스캔을 활성화하고, 현미경 소프트웨어에서 Z 초점 제어 장치를 조정하여 조직 절편 내의 신경 신호를 포함하는 상단 및 하단 초점면을 찾아 설정하십시오.

형광 신호의 크로스토크(crosstalk)를 제거하기 위해 순차적 스캔(sequential scanning) 방식으로 최종 Z 시리즈를 스캔하십시오. 원본 이미지의 복제본에서 선택 도구를 사용하여 표피 주변 영역을 지정함으로써, 표피를 각질층 및 진피로부터 분리하십시오. 그런 다음 선택 영역에 맞춰 이미지를 자르십시오.

분산 함수 계산 기능을 사용하여 녹색 및 적색 형광 컨포컬 신호에 대한 점 퍼짐 함수(point spread functions)를 계산하십시오. 그런 다음 매질 굴절률은 오일의 경우 1.515로, 40X 오일 대물렌즈의 수치 구경은 1.25로 매개변수를 설정하십시오. 검출기 핀홀을 1 air unit으로 설정하고 레이저 여기 파장을 선택하십시오.

반복 복원(iterative restoration)을 100% 신뢰도로 설정하고, 반복 제한을 10회로 지정하며, 녹색 및 적색 형광 신호의 디컨볼루션(deconvolution)을 위해 녹색 및 적색 PSF를 사용하십시오. 표면 생성(create surface) 도구를 사용하여 디컨볼루션된 신경 신호 주변에 표면을 생성하며, 이때 smooth feature 체크를 해제하고, 임계값 설정으로 absolute intensity를 선택하며, 하한 임계값은 3,000, 상한 임계값은 65,535로 설정하십시오. 10 voxels 이상의 표면만 유지하십시오.

Nerve surface의 edit 탭을 사용하여 단일 비신경 표면을 선택하거나, Control 키를 누른 상태로 여러 비신경 표면을 선택하여 비신경 표면을 제거합니다. Delete 버튼을 눌러 선택한 비신경 표면을 삭제합니다. Nerve surface의 edit 탭에서 mask properties에 있는 mask all 버튼을 누릅니다.

새 창의 채널 선택 항목에서 channel five mitochondria deconvolved를 선택한 다음, 마스크를 적용하기 전 duplicate channel을 체크하십시오. constant inside/outside 라디오 버튼을 누르고 set voxels outside surface를 0.0으로 설정한 뒤 OK 버튼을 누르십시오. 마지막으로, create surface 도구를 사용하여 uncheck smooth feature를 선택하고 임계값 설정을 위해 background subtraction을 사용하여 마스킹된 deconvolved 미토콘드리아 신호 주변에 표면을 생성함으로써 미토콘드리아 특이적 표면을 만드십시오.

가장 큰 구체의 직경을 1.50 micrometers로 설정하고, 하한 임계값은 2, 000, 상한 임계값은 최대 65, 535로 설정하십시오. 표면 값은 1.0 voxels 이상으로 유지해야 합니다. 이 대표 3D 공초점 현미경 이미지는 신경 특이적 녹색 형광 신호를 보여줍니다.

신경 신호를 나타내는 시안색의 3D 표면을 생성합니다. 그런 다음 신경 표면을 마스킹 도구로 사용하여 나머지 표피 미토콘드리아 신호로부터 신경 특이적 미토콘드리아 신호를 분리합니다. 결과적으로 얻은 신경 특이적 미토콘드리아 적색 형광 신호를 사용하여, 시안색으로 표시된 신경 표면 내의 미토콘드리아 주변에 마젠타색으로 표시되는 표면을 생성합니다.

이를 통해 신경 섬유 내의 미토콘드리아를 상세하게 관찰할 수 있습니다. 여기서는 미토콘드리아 표면 데이터를 크기 빈도 히스토그램으로 제시하여, 부피에 따라 다양한 굴곡에 존재하는 미토콘드리아의 백분율을 시각화하였습니다. 이 절차를 수행할 때는 염색 과정 중 조직을 세심히 관리하여, 모든 절편에 걸쳐 균일하고 일관된 염색이 이루어질 수 있도록 조직이 용액에 완전히 잠기게 하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 인간 표피 내 신경 섬유 내의 미토콘드리아를 시각화하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 상세 프로토콜은 신경병증과 같은 미토콘드리아 기반 신경 질환의 발병 기전을 이해하는 것을 목표로, 다른 연구자들이 인간 피부 생검 조직을 염색, 이미징, 처리 및 분석하는 방법을 학습할 수 있도록 설계되었습니다.