3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

이 이미징 및 분석 기술의 전반적인 목표는 복잡한 신호에서 특정 정보를 분리하는 것입니다. 특히, 이 프로토콜은 표피 내의 다른 미토콘드리아와 함께 신경 특이적 미토콘드리아를 시각화하고 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 건강한 개인의 표피내 신경 섬유 내의 미토콘드리아가 신경학적 합병증이 있는 환자의 신경 특이적 미토콘드리아와 어떻게 비교되는지와 같은 신경학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 복잡한 신호를 가져와 특정 정보를 추출한다는 것입니다. 이 프로토콜은 이러한 빨대의 신호와 같은 특정 신호를 주변 신호와 분리하는 데 도움이 됩니다. 이 회로도에 따라 먼저 96웰 플레이트를 라벨링하여 피부 생검의 형광 면역조직화학 염색을 준비합니다.

그런 다음 150마이크로리터의 스톡 신호 인핸서 용액을 피펫팅하여 2차 항체가 상단 열의 각 웰로 비특이적으로 결합하는 것을 줄입니다. 150마이크로리터의 1x 인산염 완충 식염수를 96웰 플레이트의 2열과 3열에 있는 각 웰에 추가하여 헹굼 웰을 준비합니다. 그런 다음 150마이크로리터의 5%BSA 차단 용액을 4열의 웰에 추가합니다.

1차 항체 PGP9.5 및 PDH를 1, 500마이크로리터의 1%BSA 헹굼 용액에 희석하고 5열의 각 웰에 150마이크로리터를 추가합니다. 접종 루프를 사용하여 단면을 첫 번째 행의 신호 인핸서 용액으로 이동합니다. 절편이 5열의 1차 항체 용액에 들어가면 증발을 방지하기 위해 실험실 필름으로 플레이트를 단단히 감싼 다음 실온의 평평한 로커에서 1시간 동안 샘플을 교반합니다.

섭씨 4도에서 밤새 흔들며 배양합니다. 절차의 2일차는 150마이크로리터의 1%BSA 헹굼 용액을 96웰 플레이트의 6열, 7열, 8열에 있는 웰에 피펫팅하여 시작합니다. 형광단 접합 2차 항체를 1, 500 마이크로리터의 1%BSA에 추가합니다.

그런 다음 150 마이크로 리터의 2 차 항체 용액을 9 열의 각 웰에 피펫으로 넣습니다. 6, 7, 8 우물을 통과하여 섹션을 헹굽니다. 절편이 9열의 2차 항체 용액에 들어가면 플레이트를 파라필름으로 감싸고 알루미늄 호일로 덮어 형광 신호를 보호합니다.

이전과 같이 흔들림으로 배양하십시오. 3일차에는 150마이크로리터의 멸균 피펫으로 1x PBS를 10열, 11열, 12열로 여과했습니다. 샘플을 10행으로 옮긴 다음 알루미늄 호일로 플레이트를 덮습니다.

흔들면서 실온에서 1시간 동안 헹굽니다. 다음으로, 여과된 1x PBS 50마이크로리터를 슬라이드에 피펫팅하여 섹션을 장착하기 위한 현미경 슬라이드를 준비합니다. 헹굼이 완료되면 12행의 섹션을 슬라이드로 옮긴 다음 DAPI가 포함된 장착 시약을 섹션 바로 위에 1-2방울 떨어뜨립니다.

섹션 위에 50mm x 24mm 1.5 현미경 유리 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 슬라이드를 저장하거나 이미징하기 전에 실온에서 밤새 어두운 곳에 두어 장착 매체를 경화시킵니다. 도립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 40X 오일 이멀젼 대물렌즈를 선택하십시오.

적절한 레이저와 검출기를 선택하여 핵, 신경 섬유 및 미토콘드리아를 이미지화합니다. 현미경 소프트웨어에 다음 스캔 매개변수를 입력하고, 12비트 강도 해상도, 두 프레임 평균으로 500Hz의 스캔 속도, 2.2의 줌을 입력합니다. 1024 x 1024의 스캔 해상도를 선택하여 최적화된 측면 해상도를 위해 현미경 소프트웨어를 설정합니다.

210 나노미터의 Z 단계 크기를 가진 하나의 공기 단위의 공초점 조리개를 선택하여 축 해상도와 광학 절단을 최적화합니다. 각 신호를 개별적으로 스캔하고 검출기 전압 및 오프셋을 조정하여 과포화 및 과소 포화 픽셀을 제거합니다. 신경 신호에 대한 실시간 스캔을 활성화하고 Z 초점 컨트롤을 조정하여 조직 섹션 내의 신경 신호를 포함하는 현미경 소프트웨어에서 상단 및 하단 초점면을 찾고 설정합니다.

최종 Z 시리즈를 순차 스캔으로 스캔하여 형광 신호 누화를 제거합니다. 원본 이미지의 복제 이미지에 선택 도구를 사용하여 표피 주위의 영역을 그려 각질층과 진피에서 표피를 분리합니다. 그런 다음 선택 영역까지 이미지를 자릅니다.

Calculate spread 함수 기능을 사용하여 녹색 및 빨간색 형광 공초점 신호에 대한 점 확산 함수를 계산합니다. 그런 다음 오일의 중간 굴절률에 대한 매개변수를 1.515로, 40X 오일 대물렌즈에 대한 개구수를 1.25로 설정합니다. 검출기 핀홀을 하나의 에어 유닛으로 설정하고 레이저 여기 파장을 선택합니다.

반복 복원을 100% 신뢰도로 설정하고, 반복 제한을 10 사이클로 설정하고, 녹색 및 빨간색 형광 신호의 디컨듈레이션을 위해 녹색 및 빨간색 PSF를 사용합니다. 표면 생성 도구를 사용하여 uncheck smooth feature, 임계값을 위한 절대 강도, 하한 임계값 3, 000 및 상한 임계값 65, 535를 선택하여 디컨볼루션된 신경 신호 주위에 표면을 만듭니다. 표면을 10 복셀 이상으로 유지하십시오.

신경 표면의 편집 탭을 사용하여 단일 비신경 표면을 선택하거나 Control 키를 누른 상태에서 여러 비신경 표면을 선택하여 비신경 표면을 제거합니다. Delete 버튼을 눌러 선택한 비신경 표면을 삭제합니다. 신경 표면의 편집 탭을 사용하여 마스크 속성에서 마스크 전체 버튼을 누릅니다.

새 창에서 채널 선택 아래에서 디컨볼루션된 채널 5 미토콘드리아를 선택한 다음 마스크를 적용하기 전에 중복 채널을 선택합니다. 라디오 버튼을 눌러 내부/외부를 일정하게 설정하고 복셀 외부 표면이 0.0으로 설정되어 있는지 확인하고 확인 버튼을 누릅니다. 마지막으로, Create Surface 툴을 사용하여 미토콘드리아 특정 곡면을 생성하고, uncheck smooth feature를 선택하고 background-subtraction을 사용하여 임계값을 설정함으로써 마스킹된 디컨볼루션된 미토콘드리아 신호 주위에 곡면을 만듭니다.

가장 큰 구의 지름을 1.50마이크로미터로, 하한값을 2, 000으로, 상한 문턱을 최대 65, 535로 설정합니다. 표면을 1.0 복셀 이상으로 유지하십시오. 이 대표적인 3D 컨포칼 현미경 이미지는 신경 특이적 녹색 형광 신호를 보여줍니다.

청록색으로 표시된 3D 표면은 신경 신호에 대해 생성됩니다. 그런 다음 신경 특이적 미토콘드리아 신호는 신경 표면을 마스킹 도구로 사용하여 나머지 표피 미토콘드리아 신호와 격리됩니다. 그 결과로 생성된 신경 특이적 미토콘드리아 적색 형광 신호는 청록색으로 표시된 신경 표면 내의 미토콘드리아 주위에 자홍색으로 표시되는 표면을 만드는 데 사용됩니다.

이를 통해 신경 섬유의 미토콘드리아를 자세히 볼 수 있습니다. 여기에서 미토콘드리아 표면 데이터는 크기에 따라 다양한 굽힘 각각에 존재하는 미토콘드리아의 백분율을 시각화하기 위해 크기 빈도 히스토그램으로 표시됩니다. 이 절차를 시도하는 동안에는 염색 과정에서 조직을 관리하여 조직이 용액에 완전히 잠겨서 단면 전체에 걸쳐 균일하고 일관된 염색을 제공하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간 표피내 신경 섬유 내에서 미토콘드리아를 시각화하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 당사의 상세 프로토콜은 신경병증과 같은 미토콘드리아 기반 신경 질환의 발병 기전의 기전을 이해하기 위해 인간 피부 생검을 염색, 이미지화, 처리 및 분석하는 방법을 다른 연구자에게 가르치기 위해 고안되었습니다.