Imaging- 및 유동 세포 계측법 기반의 셀 위치의 분석 및 3D 흑색 종 회전 타원체의 세포주기

이 방법의 전반적인 목표는 2D 세포 배양과 비교하여 스테로이드 내의 세포주기 상태 및 위치와 관련하여 다세포 스테로이드에서 세포를 식별, 특성화 및 분리하는 것입니다. 3D OID 모델은 스페로를 유세포 분석 및 이미징 기술과 결합하여 종양 구조와 미세 환경을 모방하여 생체 내 암의 생물학을 요약합니다. 이 방법은 종양 미세환경이 약물 감수성, 세포 운동성 및 증식을 어떻게 변화시키는지와 같은 암 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다.

이 방법의 주요 장점은 세포주기의 실시간 시각화를 가능하게하고 절차가 완료 될 것임을 입증하는 특정 스테로이드 영역에서 살아있는 세포의 정제를 허용한다는 것입니다 샤프, 우리 실험실의 연구 조교 행크의 균형 소금 용액 또는 HBSS 100 밀리리터에 1.5 % aros를 전자 레인지하여 3D 스테로이드 형성 준비를 시작하거나 3-5 분 동안 플라스크를 간헐적으로 소용돌이쳐서 보증합니다. 아로스가 완전히 용해되었다는 것을. 그런 다음 즉시 100 마이크로 리터의 aros 용액을 평평한 바닥의 96 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하여 아로스가 응고되도록 합니다.

다음으로, 세포 배양 인큐베이터에서 FCI 구조체를 발현하는 흑색종 세포의 80% 합류 세포 배양을 제거합니다. HBSS 10ml로 세포를 씻으십시오. EDTA에 0.05% 1.5ml를 첨가한 다음 섭씨 37도에서 약 2분 동안 세포를 배양합니다.

세포가 소생을 분리하면 10ml의 세포 배양에 현탁시킵니다. 보통. 수동으로 hemo, cytometer 및 도립 현미경을 사용하여 세포를 세고 25, 세포 배양 배지에서 밀리리터 당 000 세포로 희석하십시오. 그런 다음 200마이크로리터의 셀 현탁액을 피펫으로 만들어 96웰 aros 플레이트의 각 웰을 오버레이합니다.

플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 약 3일 동안 배양하여 세포 스페로이드를 형성합니다. 인큐베이션 이미지 다음, Forex 대물렌즈와 위상차 필터를 사용한 도립 현미경의 스페로이드. 스페로이드는 절편 및 이미징을 위해 세포 스테로이드를 준비하기 위해 작고 대략 구형의 세포 응집체로 나타나야 합니다.

1 밀리리터 피펫을 사용하여 매 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 스테로이드가 원뿔의 바닥에 가라앉도록 합니다. 다음으로, 중간 이중 흡입을 제거한 다음 실온에서 최소 2시간 동안 10% 중성 완충 포르민으로 배양하여 스페로이드를 고정합니다.

그런 다음 SP는 세포의 절편 및 이미징 후 며칠 동안 섭씨 4도의 HBSS에 보관할 수 있습니다. Sphe 이미지 분석 소프트웨어를 열고 정량 분석 전용 구성을 선택합니다. 그런 다음 새 라이브러리를 만들고 원시 데이터 파일을 라이브러리로 끌어 스페로이드 컨포칼 이미지 파일을 가져옵니다.

다음으로, 측정 탭으로 이동하여 프로토콜 창에서 명령을 올바른 순서로 끌어다 놓아 이미지 분석 프로토콜을 구축합니다. 녹색 채널에서 개체를 찾으려면 찾기 섹션에서 프로토콜 창으로 개체 찾기 명령을 끌어다 놓고 적절한 채널을 선택합니다. 처리 아래에 있는 열기 명령을 추가한 다음 별도의 터치 개체 명령을 추가하여 셀을 구분합니다.

마지막으로 필터링 섹션에서 크기별로 개체를 추가하고 제외합니다. 50마이크로미터 미만의 물체에 대해 작은 비세포 물체를 제외하도록 명령합니다. 그런 다음 새 개체 찾기 명령을 프로토콜 창으로 끌어다 놓습니다.

동일한 단계에 따라 빨간색 채널을 선택하고 모든 후속 명령을 적용합니다. 개체를 찾으면 숨기기 채널 또는 채널 표시 명령을 사용하여 빨간색 및 녹색 개체가 빨간색 및 녹색 핵에 해당하는지 시각적으로 확인합니다. 필요한 경우 측정을 클릭한 다음 피드백 옵션을 클릭하여 개체 마스크의 모양을 수정합니다.

이제 초기 S상 셀에 해당하는 노란색 개체를 찾으려면 결합 섹션에 있는 intersect 명령을 사용하고 녹색 개체와 교차하는 빨간색 개체를 선택합니다. 다시 말하지만, 50마이크로미터 미만의 크기로 개체를 제외합니다. G 단상 셀을 식별하려면 결합 섹션에 있는 빼기 명령을 사용하고 빨간색 개체에서 노란색 개체 빼기를 선택하여 빨간색 개체만 찾습니다.

마찬가지로, 독점적으로 빨간색과 독점적으로 녹색 물체 모두에 대해 SG 2 및 MPH 위상 셀과 상관관계가 있는 배타적으로 녹색 물체를 식별하기 위해 녹색 물체에서 노란색 물체를 뺍니다. 필요에 따라 형상 계수가 0.25보다 큰 필터링 섹션에서 필터 모집단 명령을 적용하여 비세포 개체를 제거합니다. 그런 다음 S 스페로이드 윤곽선을 찾습니다.

녹색 또는 빨간색 채널의 찾기 섹션에서 개체 찾기 명령을 사용합니다. Processing 섹션에서 닫힌 명령을 사용하여 개별 셀을 하나의 개체로 결합합니다. 그런 다음 개체에 구멍 채우기 명령을 추가하여 sphe의 구멍을 채웁니다.

그런 다음 미세 필터를 사용하여 Sphero 오브젝트에서 노이즈를 제거합니다. 30, 000마이크로미터보다 작은 개체를 제거하려면 크기별 개체 제외를 선택하여 스페로이드 윤곽선 찾기를 마칩니다. 모든 객체가 정의되면 관련 섹션에서 측정 거리를 추가하여 각 OID에서 S 스페로이드 윤곽선의 가장자리까지의 거리를 결정합니다.

노란색, 독점적으로 빨간색 및 독점적으로 녹색 개체군 각각에서 이 작업을 수행합니다. 셀에서 가장 가까운 S 스페로이드 가장자리까지의 최소 거리를 시각화하려면 측정 탭을 열고 피드백 옵션을 선택한 다음 관계를 선택합니다. 그런 다음 거리 표시를 선택합니다.

마지막으로 프로토콜을 저장하여 프로토콜에 의해 생성된 데이터를 저장합니다. 측정(measurement) 섹션에서 측정(make measurement) 항목을 선택합니다. 그런 다음 데이터를 해석하려면 측정 항목을 선택하고 측정 섹션의 분석 탭으로 이동한 다음 분석 메뉴에서 분석을 선택하여 스테로이드 가장자리에서 특정 거리에서 발견된 세포를 계산합니다.

분석 탭에서 필터를 선택하여 필터를 만듭니다. 예를 들어, 구 가장자리로부터의 거리가 100미크론 미만인 데이터만 표시합니다. 원시 데이터를 내보내려면 파일 탭에서 내보내기를 선택한 다음 데이터를 쉼표로 구분된 텍스트 또는 탭으로 제한된 텍스트로 저장합니다.

이 데이터는 추가 분석을 위해 스프레드시트 프로그램에서 열 수 있습니다. C에서 생성된 세포 스페 8 1 16 1. Fuji 시스템으로 형질도입된 인간 흑색종 세포를 고정하고 절단했습니다.

세포주기의 SG 2 M 단계에서 세포를 표시하는 AZA 녹색과 G 1 단계에서 세포를 표시하는 Berra orange에 대한 컨포칼 이미징을 수행했습니다. 이러한 이미지가 오버레이되면 괴사 코어와 같은 주요 특징이 예상대로 관찰될 수 있습니다. 적색 G 1 정지 세포는이 괴사 코어에 더 가깝게 우세한 반면, 적색 및 녹색 증식 세포는 스테로이드의 바깥 쪽 가장자리를 향해 구배 방식으로 증가하거나 산소와 영양분에 대한 접근이 가장 큽니다.

반자동 이미지 분석 후 fucci 세포 마스크와 S 스페로이드 윤곽을 정의할 수 있습니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 S 스페로이드의 내부 또는 외부 영역에 있는 적색 및 녹색 세포를 정량화했습니다. 이 분석은 G 단상 정지 세포가 내부 영역에서 풍부하게 유지되는 반면 증식하는 세포는 스테로이드 가장자리에 더 가깝게 우세하다는 것을 보여주었습니다.

일단 숙달되면, 이 기술은 1 2 주, 스테로이드 성장, 화상 진찰 및 분석을 포함하는 기간에 끝날 수 있습니다. 이러한 절차에 따라 rads를 콜라겐 매트릭스에 이식한 다음 TimeLapse 현미경을 통해 이미지화할 수 있습니다. 그런 다음 단백질 또는 RNA 분석을 받을 수 있으며, 이는 스테로이드의 위치와 산소 및 영양소에 대한 접근이 암세포 표현형을 변화시킬 수 있는지 여부와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.