Imaging- 및 유동 세포 계측법 기반의 셀 위치의 분석 및 3D 흑색 종 회전 타원체의 세포주기

이 방법의 전반적인 목표는 2D 세포 배양과 비교하여, 다세포 스테로이드 내 세포들의 세포 주기 상태와 스테로이드 내 위치에 따라 세포를 식별, 특성화 및 분리하는 것입니다. 3D OID 모델은 종양 구조와 미세환경을 모방하여 체내 암 생물학을 재현합니다. 구체(spheroids)를 유세포 분석 및 이미징 기술과 결합함으로써, 이 방법은 종양 미세환경이 약물 민감도, 세포 이동성 및 증식을 어떻게 변화시키는지와 같은 암 연구 분야의 핵심 질문들에 답할 수 있습니다.

이 방법의 주요 장점은 세포 주기를 실시간으로 시각화할 수 있으며, 특정 스테로이드 영역에서 살아있는 세포를 정제할 수 있다는 점입니다. 실험 절차는 우리 실험실의 연구 보조원인 A sharp가 수행합니다. 100 mL의 Hank's balanced salt solution(HBSS)에 1.5% agarose를 넣고 3~5분 동안 전자레인지로 가열하여 3D 스테로이드 형성 준비를 시작합니다. agarose가 완전히 용해되도록 플라스크를 간헐적으로 흔들어 줍니다. 그 후, 평평한 바닥의 96-well 조직 배양 플레이트의 각 웰에 agarose 용액 100 µL를 즉시 피펫팅하여 넣습니다. agarose가 응고될 수 있도록 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, FCI 컨스트럭트를 발현하는 80% 합류도(confluence)의 흑색종 세포 배양물을 세포 배양 인큐베이터에서 꺼냅니다. 세포를 10 mL의 HBSS로 세척합니다. 0.05% EDTA 1.5 mL를 첨가한 후, 세포를 37 °C에서 약 2분 동안 배양합니다.

세포가 분리되면 10 mL의 세포 배양 배지에 현탁합니다. 헤모사이토미터와 도립 현미경을 사용하여 세포 수를 수동으로 측정하고, 세포 배양 배지에서 mL당 25,000 cells가 되도록 희석합니다. 그 후, 96-well plate의 각 웰 위에 세포 현탁액 200 µL를 피펫으로 분주합니다.

세포 스페로이드를 형성하기 위해 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 약 3일 동안 배양합니다. 배양 후, Forex 대물렌즈와 위상차 필터를 장착한 도립 현미경으로 스페로이드를 촬영합니다. 섹셔닝 및 이미징을 위해 준비된 세포 스페로이드는 조밀하고 대략적인 구형의 세포 응집체 형태로 나타나야 합니다.

1 mL 피펫을 사용하여 이들을 팰컨 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 스테로이드가 원추형 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다. 다음으로, 흡입을 통해 배지를 제거하고, 10% 중성 완충 포르말린에서 실온으로 최소 2시간 동안 배양하여 스페로이드를 고정합니다.

세포의 절편 제작 및 이미징 후, SP는 4°C의 HBSS에서 수일 동안 보관할 수 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어를 실행하고 정량 분석 전용 설정을 선택하십시오. 그런 다음 새 라이브러리를 생성하고, 원시 데이터 파일을 라이브러리로 드래그하여 스페로이드 공초점 이미지 파일을 가져오십시오.

다음으로, 측정(measurements) 탭으로 이동하여 프로토콜 창에 명령어를 올바른 순서대로 드래그 앤 드롭하여 이미지 분석 프로토콜을 구성합니다. 녹색 채널에서 객체를 찾으려면 찾기(finding) 섹션에서 객체 찾기(find objects) 명령어를 프로토콜 창으로 드래그 앤 드롭한 후 적절한 채널을 선택합니다. 처리(processing) 항목 아래에 있는 열기(open) 명령어를 추가하고, 이어서 세포를 분리하기 위해 별도의 접촉 객체(touching objects) 명령어를 추가합니다.

마지막으로, 필터링 섹션에서 크기에 따라 객체를 추가하거나 제외합니다. 50 µm 미만의 객체를 제외하도록 설정하여 작은 비세포성 객체를 제거하십시오. 그런 다음, 새로운 객체 찾기(find objects) 명령을 프로토콜 창으로 드래그 앤 드롭합니다.

동일한 단계를 따라 레드 채널을 선택하고 이후의 모든 명령을 적용합니다. 객체가 탐지되면, '채널 숨기기(hide channel)' 또는 '채널 표시(show channel)' 명령을 사용하여 빨간색 및 녹색 객체가 각각 빨간색 및 녹색 핵에 해당하는지 시각적으로 확인하십시오. 필요한 경우, '측정(measurements)'을 클릭한 후 '피드백 옵션(feedback options)'을 선택하여 객체 마스크의 모양을 수정하십시오.

이제 초기 S기 세포에 해당하는 노란색 객체를 찾으려면, 결합(combining) 섹션에 있는 교집합(intersect) 명령을 사용하여 '빨간색 객체와 초록색 객체의 교집합(intersect red objects with green objects)'을 선택하십시오. 마찬가지로, 크기가 50 µm 미만인 객체는 제외합니다. G1기 세포를 식별하려면, 결합(combining) 섹션에 있는 차집합(subtract) 명령을 사용하여 '빨간색 객체에서 노란색 객체 제외(subtract yellow object from red objects)'를 선택하여 순수하게 빨간색인 객체만 찾으십시오.

마찬가지로, 녹색 객체에서 황색 객체를 빼서 SG two 및 MPH 상 세포에 해당하는 전용 녹색 객체만을 식별하고, 전용 적색 객체와 전용 녹색 객체 모두에 대해 이를 수행합니다. 필터링 섹션의 필터 집단 명령을 적용하여 형상 계수(shape factor)가 0.25보다 큰 값을 설정함으로써 필요에 따라 비세포 객체를 제거합니다. 그런 다음 S 구형 외곽선을 찾습니다.

녹색 또는 적색 채널의 찾기 섹션에서 객체 찾기 명령을 사용합니다. 처리 섹션의 닫기 명령을 사용하여 개별 세포들을 하나의 객체로 결합합니다. 그런 다음 객체 내 구멍 채우기 명령을 추가하여 구형의 구멍을 채웁니다.

다음으로, 미세 필터를 사용하여 Sphero 객체에서 노이즈를 제거하십시오. 30,000 µm보다 작은 객체를 제거하기 위해 '크기별 객체 제외(exclude objects by size)'를 선택하여 구형 윤곽선 찾기를 완료하십시오. 모든 객체가 정의되면, 관련 섹션에서 '거리 측정(measure distances)'을 추가하여 각 OID에서 S 구형 윤곽선 가장자리까지의 거리를 결정하십시오.

노란색, 빨간색 단독 및 초록색 단독 집단 각각에 대해 이 과정을 수행하십시오. 세포에서 가장 가까운 S 구형체 가장자리까지의 최소 거리를 시각화하려면, 측정(measurements) 탭을 열고 피드백 옵션(feedback options)을 선택한 후 관계(relationships)를 선택하십시오. 그런 다음 거리 표시(show distances)를 선택하십시오.

마지막으로, 프로토콜에 의해 생성된 데이터를 저장하기 위해 프로토콜을 저장합니다. 측정 섹션에서 측정 수행 항목을 선택하십시오. 그 후 데이터를 해석하기 위해 측정 항목을 선택하고, 측정 섹션의 분석 탭으로 이동하여 분석 메뉴에서 분석(Analyze)을 선택하여 스테로이드 가장자리로부터 특정 거리에서 발견된 세포의 수를 측정합니다.

분석 탭에서 필터를 선택하여 필터를 생성하십시오. 예를 들어, 구체 가장자리로부터의 거리가 100 microns 미만인 데이터만 표시하도록 설정합니다. 원본 데이터를 내보내려면 파일 탭에서 내보내기를 선택한 다음, 데이터를 쉼표로 구분된 텍스트 또는 탭으로 구분된 텍스트로 저장하십시오.

이 데이터는 추가 분석을 위해 스프레드시트 프로그램에서 열 수 있습니다. C 8 1 16 1에서 생성된 세포 구체입니다. Fuji 시스템으로 형질전환된 인간 흑색종 세포를 고정하고 절편으로 만들었습니다.

세포 주기 중 G2 M기에 있는 세포를 표지하는 AZA green과 G1기에 있는 세포를 표지하는 Berra orange에 대해 공초점 이미징을 수행하였습니다. 이 이미지들을 중첩시키면 예상대로 괴사성 중심부(necrotic core)와 같은 주요 특징들을 관찰할 수 있습니다. 적색의 G1기 정지 세포들이 이 괴사성 중심부 근처에 주로 분포하며, 산소와 영양소에 대한 접근성이 가장 높은 스테로이드 외부 가장자리로 갈수록 적색 및 녹색의 증식 세포들이 구배 방식으로 증가합니다.

반자동 이미지 분석 후, fucci 세포 마스크와 S 구체 외곽선을 정의할 수 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 S 구체의 내부 또는 외부 영역에 있는 적색 및 녹색 세포를 정량화했습니다. 이 분석 결과, G1기 정지 세포는 내부 영역에 풍부한 반면, 증식 세포는 구체 가장자리에 더 가까이 분포하는 것으로 나타났습니다.

이 기술을 숙달하면 스테로이드 배양, 이미징 및 분석을 포함하여 1~2주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에 rads를 콜라겐 매트릭스에 이식하고 타임랩스(TimeLapse) 현미경으로 이미징할 수 있습니다. 그 후 단백질 또는 RNA 분석을 수행할 수 있으며, 이를 통해 스테로이드 내의 위치와 산소 및 영양분에 대한 접근성이 암세포 표현형을 변화시킬 수 있는지와 같은 질문에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.