Name: Imaging- 및 유동 세포 계측법 기반의 셀 위치의 분석 및 3D 흑색 종 회전 타원체의 세포주기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 3D 흑색종 스페로이드에서 FUCCI와 이미징 및 유동 세포 계측법을 이용한 세포주기 분석 방법을. 이 기술은 실시간 세포주기 가시화 및 특정 영역 세포 분리를 가능하게 하여 암 미세환경 연구에 활용됩니다.

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기술 지원을 해주신 Ms. Danae Sharp와 Ms. Sheena Daignault에게 감사드립니다. FUCCI 구조를 제공해 주신 일본 와코시 RIKEN의 Atsushi Miyawaki 박사님께, 뛰어난 기술 지원을 제공해 주신 Centenary Institute의 Imaging and Flow Cytometry Facility에 세포주를 제공해 주신 필라델피아 Wistar Institute의 Meenhard Herlyn 박사님과 Patricia Brafford 씨께 감사드립니다. Volocity 소프트웨어 기술 지원에 대해 Chris Johnson 씨와 Andrew Barlow 박사에게 감사드립니다. N.K.H.는 호주 흑색종 및 피부암 연구소(Melanoma and Skin Cancer Research Institute)의 카메론 펠로우(Cameron Fellow)입니다. K.A.B.는 뉴사우스웨일즈 암 연구소(Cancer Institute New South Wales)의 펠로우입니다(13/ECF/1-39). W.W.는 뉴사우스웨일즈 암 연구소(Cancer Institute New South Wales)의 펠로우입니다(11/CDF/3-39). 이 작업은 프로젝트 보조금 RG 09-08 및 RG 13-06(뉴사우스웨일즈 암 위원회), 570778 및 1051996(우선 순위 기반 협력 암 연구 계획/암 오스트레일리아/큐어 암 오스트레일리아 재단), 08/RFG/1-27(뉴사우스웨일즈 암 연구소) 및 APP1003637 및 APP1084893(국립 보건 및 의료 연구 위원회)의 지원을 받았습니다.

1. FUCCI 형질 도입 및 세포 배양 <ol><li> FUCCI 전달 <ol><li> 안정적으로 FUCCI을 표현 세포 라인을 만들기 이전에 7 설명한 바와 같이 렌티 바이러스 공동 전달을 사용 mKO2-hCdt1 (30-120) 및 MAG-hGem (1-100) (15)를 구성한다. 참고 : FUCCI 시스템은 현재 상업적으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 단일 셀 정렬하여 밝은 형광과 서브 클론을 생성합니다. 96 웰 플레이트에 형광 활성화 세포 선별에 의한 AG 및 KO (노란색) 모두 긍정적 정렬 단셀은 앞서 설명 7,16. </li></ol></li><li> 흑색 종 세포 배양 <ol><li> 문화 C8161 인간의 흑색 종 세포는 이전에 7,17을 설명했다. </li></ol></li></ol> 2. 3D 회전 타원체의 형성 (로 이전 3,9 설명) <ol><li> 아가로 오스 플레이트 준비 <ol><li> 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) 또는 인산염 buffere 100 ml의 1.5 % 아가로 오스 (또는 귀금속 한천)를 용해소용돌이와 3 ~ 5 분 동안 전자 레인지에 끓는로 D 식염수 (PBS). 아가로 오스가 완전히 용해되어 있는지 확인합니다. </li><li> 즉시 멀티 채널 피펫을 사용하여 바닥이 평평한 96 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 아가 용액 100 μL를 분배. 주 : 아가로 오스, 단시간 후에 팁에 고화 수 이상의 아가 플레이트를 만드는 경우에이 문제는 팁 플레이트 사이에 변경해야 극복. </li><li> 적어도 1 시간 동안 아가 강화하기 위해 평평한 표면에 96 웰 플레이트를 남겨주세요. </li></ol></li><li> 아가로 오스 위에 셀 준비 및 오버레이 <ol><li> T75 플라스크에 약 80 %의 포화 상태로 세포를 성장. HBSS 10 mL로 씻는다. </li><li> 정상 배지 10ml에 0.05 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 및 재현 탁 1.5 mL를 사용하여 세포를 분리. </li><li> 혈구 (18) 또는 다른 자동화 된 계산 방법을 사용하여 세포를 카운트. </li><li> 규범에 25,000 세포 / ml의 최종 농도로 세포를 재현 탁알 매체. </li><li> 웰 당 5,000 세포 수를 최종 세포 현탁액 200 μl를 웰과 아가 오버레이. </li><li> 세포 배양 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ℃)으로 돌아 판 위에 약 3일 스페 로이드를 형성 하였다. 참고 : 구형을 형성하는 데 걸리는 시간은 다른 세포주 사이에서 다양하다. 일부 세포주는 모두이 방법을 사용하여 타원체를 형성하지 않는다. </li><li> 4X 목적 및 위상차 필터를 사용하여 반전 현미경 이미지 회전 타원체 형태. 성공적으로 타원체 컴팩트, 대략 구형 세포 집합체를 만들어, 잘 당 하나의 구형이 있어야 형성 세포주. 참고 : 선택 사항 : 타원체가 형성되면, 그들은 성장과 침략 3,7,17의 추가 분석을 위해 콜라겐 또는 다른 매트릭스에 이식 할 수 있습니다. 콜라겐이 spher 충분히 용해 될 때까지 37 ℃에서 2 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 500 μL로 처리, 콜라겐에서 타원체를 제거하려면OID를 미디어 (약 30 분)에 무료로 제공합니다. 부드럽게 1 ML의 피펫을 사용하여 타원체를 제거합니다. </li><li> 절편의 경우 / 영상 (콜라겐에서 분리 또는 아가로 오스 3-5 일 동안 성장 중) 10 % 중성 포르말린에 수정 타원체 (주의 : 포르말린이 연기 찬장에 사용되어야한다) 실온에서 적어도 2 시간 동안 (RT)를 4 ° C에서, 또는 밤새 (O / N). 스페 로이드는 수일 동안 4 ℃에서 HBSS에 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 회전 타원체 Vibratome 단면 <ol><li> 마이크로파에서 500 ㎖의 유리 병에 HBSS 100ml에 저 융점 아가 로스 5 g을 용해. 소용돌이와 중간 열 설정을 사용합니다. 주의 : 압력이 해제 될 수 있도록 상기 용액을 비등 때 뚜껑을 느슨하게 유지. 뜨거운 유리 병을 처리 할 때 화상으로부터 손을 보호하기 위해 보호 내열 장갑을 사용합니다. </li><li> 아가로 오스가 조금 식을 때까지 기다리십시오 - 그래서 병은 손을 굽기없이 접촉 할 수있다. </li><li> approxima 부어콜터 카운터 컵 또는 이와 유사한 플라스틱 금형의 하부에서 아가 로스의 2ml를 tely. 즉시 액체 가능한 가장 작은 볼륨 1 ML의 피펫을 사용하여 (섹션 2.2.8 참조) 고정 된 회전 타원체를 대기음. 아가로 오스에 회전 타원체를 추가합니다. (10 개까지)은 몇 타원체 컵당 첨가 할 수있다. </li><li> 아가로 오스 2 ㎖ 이상으로 회전 타원체를 커버. 두 번째 레이어가 추가되기 전에 아가로 오스 경화를 방지하기 위해 신속하게이 작업을 수행합니다. </li><li> 아가로 오스는 적어도 3 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 경화 할 수 있습니다. 이 때 컵 2-3 4 ° C에서 짧은 시간 동안 저장 될 수있다에 HBSS ml의 탈수를 방지하기 위해 입혔다. </li><li> 컵에서 아가로 오스 제거합니다. 그것은 vibratome 금속 블록에 적합하고, 회전 타원체는 아가의 상단 부근되도록 타원체 함유 아가 트림. 타원체는 아가로 오스 내부 작은 흰색 개체로 볼 수 있습니다. 슈퍼 블록에 아가로 오스를 붙입니다. </li><li> 증류수로 vibratome를 입력하고 vibratome의 블록을 탑재합니다. 설정vibratome는 저속 (설정 2) 높은 진동 (8 설정)를 사용하여 100 μm의 섹션을 잘라. 16 °로 절단 날의 각도를 설정합니다. , vibratome 켜 vibratome 라이트를 켜고 100 μm의 구형 부분이 절단 될 때까지 아가로 오스의 상단에서 부분을 잘라. 24 웰 플레이트에 HBSS로 절단 회전 타원체 섹션을 배치합니다. </li><li> 이미지 분석을위한 중간 섹션을 선택합니다. 핀셋을 사용하여 슬라이드에 섹션 평면을 전송하여 슬라이드에 마운트 부분. 진공 그리스와 10 ML의 주사기 배럴 채우기; 슬라이드의 가장자리를 실행 실장 용지를 방지 커버 슬립 아래 부분을 밀봉 돕기 위하여 부의 가장자리 진공 그리스의 얇은 라인을 추가한다. 설치 매체와 coverslip에와 절을 커버. 매니큐어와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 스토어 이미징 전에 4 ° C에서 슬라이드. </li></ol> 4. 공 초점 이미지 인식 <ol><li> 10X를 사용하여 중간 FUCCI 타원체 부의 Z 슬라이스 화상을또는 20X 목적은 앞서 7을 설명했다. 중첩 또는 크로스 토크가 Kusabira Orange2과 Azami 그린 사이에 발생해야합니다. 다중 회전 타원체 부분 사이에 영상을 비교 분석하면, 레이저 파워 등의 설정 샘플 간의 동일한 유지. </li></ol> 흐름 정렬 5. 헥스 염료 확산 분석 <ol><li> 15 ML 튜브 라이브 타원체 (아가 로스 파종 후 3~5일)를 전송합니다. 타원체 중력이 튜브 바닥에 침전하자. 여러 타원체는 튜브 당 염색 할 수있다. 약 20 타원체 유세포 위해 충분한 세포 수를 얻기 위해 필요하다. </li><li> 초과 매체를 제거하고 정상 매체에 희석하여 10 μm의 훽스트 (Hoechst) 1 ㎖를 추가합니다. 약 1 시간 동안 37 ° C에서 배양 한 타원체. 배양하는 동안 한 번 또는 두 번 회전 타원체를 재현 탁하는 부드러운 긋기를 사용합니다. 주의 : 항온 처리 시간은 훽스트 염료 타원체 침투 얼마나 변경하도록 변경 될 수있다. 이에 따라 달라집니다회전 타원체의 크기, 밀도 및 세포주. 일부 대형 / 조밀 한 회전 타원체를 들어 100 %보다 최대 염료 침투가있을 수 있습니다. </li><li> 중력 침강을 사용하여 HBSS 5 ㎖로 부드럽게 회전 타원체를 씻으십시오. <ol><li> 옵션 : 염료의 침투 영상의 경우 : 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 적어도 2 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린과 타원체를 수정합니다. , vibratome 섹션을 준비 위의 3 단계와 4 단계에 설명 된대로 공 초점에 슬라이드 및 이미지를 탑재합니다. </li></ol></li><li> 이격 타원체 휴식 매 10 분 플릭으로 약 30 분 동안 37 ℃에서 0.05 % 트립신 / EDTA 1 ㎖와 함께, 구 상체를 Trypsinize 계측법을 플로우 셀을 제조 하였다. 참고 : 회전 타원체는 단일 세포 현탁액에 들어갈 어려운 조건이 최적화 될 필요가있다. 이 과정 후 C8161 사일 된 타원체의 생존 능력은 약 95 %이다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 근적외선 라이브 / 죽은 얼룩 얼룩 세포. 다음 1로 고정 HBSS로 세척약 30 분 동안 10 % 중성 완충 포르말린 용액. 세포 유동 분석 전에 몇 일 동안 39 ° C에서 HBSS에 저장 될 수있다. </li></ol> 헥스 스테인드 FUCCI 타원체 6. 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 확인 셀은 셀 스트레이너를 통해 전달하여 함께 응집되어 있지 않습니다. 훽스트 1-5 × 106 세포 / ml의 농도 (5 % 소 태아 혈청 PBS) 빙냉 FACS 세척에 FUCCI의 타원체를 염색 재현 탁. 라운드 5 ml의 바닥 튜브 샘플 200 μl를 전송합니다. </li><li> 6.1에 기술 된 바와 같이 다음과 단색 제어 샘플 준비 : 미 염색 흑색 종 세포; 점착성 흑색 종 세포를 1 시간 동안 10 μM로 염색 훽스트; Azami 녹색은 흑색 종 세포를 발현; 그리고 오렌지 Kusabira은 흑색 종 세포를 발현. 참고 : 단일 색상 컨트롤이 몇 주 또는 몇 달 동안 4 ° C에서 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 세척 포르말린에 고정 외과에 저장 될 수있다. </li><li> 실행 단일 세포 현탁액 오이전에 적절한 레이저와 단일 색상 / 흠 컨트롤 분석기 세포 계측법 NA 흐름은 7,16을 설명했다. </li><li> 다음과 같이 외부 회전 타원체 세포 대 내부를 분석하는 등 FlowJo 같은 상용 세포 계측법 소프트웨어를 사용 : <ol><li> 앞으로 조금 라이트 사이드 흩어져 빛 (SSC) 대 (FSC)의 주요 세포 인구에 게이팅에 의해 이물질을 제거합니다. </li><li> FSC 대 FSC (지역) (높이)를 사용하여 단일 세포에 게이팅으로는 이중 제거 </li><li> 라이브 / 죽은 낮은 인구에 게이팅하여 살아있는 세포에 대한 게이트. </li><li> 훽스트 (Hoechst)에게 &quot;외부&quot;세포와 같은 훽스트 염색 접착 세포에서 긍정적 인 신호를 기초로 게이트 높은 세포를, 정의합니다. </li><li> &quot;내부&quot;세포로서, 유엔 묻은 컨트롤로부터의 신호에 기초하여 게이트 훽스트 낮거나 음성 세포를 정의합니다. </li><li> 내부 및 외부 집단에 대한 게이팅 후, 세포는 더 FUCCI의 녹색, 빨간색 (G1), 노란색 (초 S), (S / G2 / M) 또는 음 (초기 G1)에 대한 문이 될 수 있습니다. 참고 : C를단일 색상 컨트롤을 사용하여 ompensation 제대로 FUCCI, 빨강, 노랑, 녹색 및 부정적인 집단을 정의해야 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 분석 및 최적화 훽스트 침투 초점 현미경을 통해 확인되면, 이전에 생균 하위 집단의 추가 분석을 7,16 바와 같은 플로우 셀 소터에 고정하지 않고 세포를 실행. </li></ol> FUCCI 회전 타원체 섹션 7. 이미지 분석 <ol><li> 오픈 소프트웨어 예. Volocity는 정량 만 구성을 선택합니다. </li><li> 새 라이브러리를 작성합니다. 라이브러리에 공 초점에서 원시 데이터 파일을 드래그하여 소프트웨어에 FUCCI의 회전 타원체 공 초점 이미지 파일을 가져옵니다. 또한, 파일&gt; 가져 오기 명령을 사용합니다. </li><li> 이미지 분석 프로토콜을 구축하기 위해 측정 탭으로 이동합니다. 이 프로토콜은 끌어 프로토콜 창에서 다음과 같이 올바른 순서로 적절한 명령을 놓는 방법으로 내장되어 있습니다. </li><li> OBJ 찾기ECTS 녹색 채널 : 찾기는 프로토콜 창에 ( &#39;찾기&#39;에 있음) 명령 개체를 드래그 ( &#39;처리&#39;에 있음) 열기 명령을 protocol.Add 찾기 객체에서 올바른 채널, 다음, 별도의 감동 개체를 선택 명령 ( &#39;처리&#39;에서 발견 -이 세포를 분리합니다). 크기 &lt;50 μm의에 의해 개체 제외 ( &#39;필터링&#39;에서 발견을 -이 작은 비 세포 개체를 제외한다). 주 : 찾기 임계 개방 반복 수를 변수 개체와 같은 개체의 크기는 분리 할 대상물 마스크 이미지와 일치 될 때까지 제외하는 물체의 크기를 수동으로 최적화되어야한다. </li><li> 빨강 채널에서 개체를 찾기 : 빨강 채널에 대한 위의 물체를 발견 반복합니다. 녹색과 빨간색 프로토콜은 별도로 조정해야 할 수도 있습니다. 참고 : 핵 G2에있는로 인해, 녹색 핵 종종 약간 크다. </li><li> 발견 된 개체 정확한 확인 : 빨간색 확인하고 녹색 개체가 일치껐다가 켜 프로토콜에 의해 발견 된 빨간색과 녹색 마스크를 표시하는 동안 (숨기거나 표시 채널 명령을 사용하여) 녹색과 적색 채널의 이미지에서 빨간색과 녹색 핵. 피드백 옵션 (측정&gt; 피드백 옵션) 객체 마스크의 모양을 수정하는 데 사용될 수있다. </li><li> 노란색 물체 (초기 S 단계 세포)를 찾기 : 노란색 세포를 발견 ( &#39;결합&#39;에 있음) 명령 녹색 세포 빨간색 교차을 추가 할 수 있습니다. 어떤 작은 비 세포 개체를 제외 ( &#39;필터링&#39;에있는 &lt;50 μm의) 크기에 따라 개체를 제외합니다. </li><li> (G1 단계 세포)를 독점적으로 빨간색 물체를 찾기 : ( &#39;결합&#39;에 있음) 적혈구의 노란색 세포를 독점적으로 빨간색 핵을 찾을 빼기. 만든 작은 비 세포 개체를 제거하는 ( &#39;필터링&#39;에 있음) 크기 &lt;50 μm의에 의해 객체를 제외합니다. </li><li> 독점적으로 녹색 객체 (S / G2 / M 단계에서 세포를) 찾기 : 독점적으로 녹색 찾기 위해 녹색 채널에 대해 반복합니다. 아니TE : 여전히 남아있는 비 셀룰러 물체가있는 경우, 필터 인구 명령만을 보유하는 ( &#39;필터&#39;에 위치한) 전용 녹색 또는 적색 독점 프로토콜에 부가 될 수있다 0.25보다 큰 형상 계수와 개체. 이 비 원형 개체를 제거합니다. </li><li> 회전 타원체 개요 찾기 : 찾기를 사용하여 회전 타원체의 개요를 찾기 (회전 타원체의 가장자리 주위에 더 많은 세포를 가지고 중) 녹색 또는 빨간색 채널 ( &#39;찾기&#39;에 있음) 명령을 객체. 훨씬 낮은 임계 값 (찾기에있는 변수를 객체)는 각각의 세포에 비해 회전 타원체의 개요를 찾는 데 사용되어야합니다. <ol><li> 다음 개체에서 노이즈를 제거하는 ( &#39;필터링&#39;에 있음) 미세 필터를 사용하여, 다음 ( &#39;처리&#39;에 있음) 객체에 구멍을 채우기 ( &#39;처리&#39;에 있음) 객체에 가입 닫기 명령을 사용하십시오. 마지막으로, 작은 개체 (회전 타원체의 크기에 따라) &lt;30,000 μm의를 제거하는 크기 객체를 제외합니다. 노트이 프로토콜은 타원체 개요가 정확까지 수동으로 최적화 될 필요가있을 것이다. 사용할 필요가 있지만,이 보통 덜 정확한 구형 부, 및 ( &#39;결합&#39;에 있음) 반전 명령이다 - 시야 화상이 사용될 수도있다. </li></ol></li><li> 로부터되어야하는 최소 거리를 시각화 outline.To 타원체의 가장자리 셀 중심으로부터 황색 독점적 녹색 및 독점적 적색 개체군에서 ( &#39;관련된&#39;에서 발견) 측정 거리 : 타원체 윤곽에 핵의 거리를 측정 가장 가까운 회전 타원체의 가장자리에 셀은 피드백 옵션 (측정&gt; 피드백 옵션&gt; 관계)의 관계 탭에 표시 거리를 켭니다. </li><li> 프로토콜을 저장합니다. 이 프로토콜은 측정을 사용하여 다른 이미지에 다시 적용 할 수있다&gt; 프로토콜 명령을 복원합니다. </li><li> 측정 항목 만들기 (측정&gt; 측정 항목을 확인합니다). 데이터 분석을 이용하여 분석 될 수있다기능. <ol><li> 측정 항목의 분석 탭으로 이동합니다. 분석 메뉴로 이동 (분석&gt; 분석) 및 회전 타원체 에지 (녹색 또는 빨간색, 노란색) 셀 중심, 카운트로 요약 인구에 의해 조직의 최소 거리를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 에지로부터 일정 거리에서 발견 세포 수를 계수 필터 (분석&gt; 필터)를 생성한다. 도 2의 최소 거리에 대한 필터 (예를 들어 최소 거리 (80)는 &quot;외부&quot;모집단을 준다보다 적은) 훽스트 침투에 기초한다. 또한, 추가 분석을 위해 스프레드 시트로 내보내기 원시 데이터를. </li></ol></li></ol>

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</ol>

PerkinElmer는 출판 비용을 기부했습니다.

반 - 자동화 영상 분석은 내측 회전 타원체 G1 구속 영역을 식별하고, 외층 증식. 이 방법은 광학 부재를 이용하여 실시간 회전 타원체에 사용할 수도 있고, 고정 된 회전 타원체 부분에서, 서로 다른 영역에서의 세포주기하지만 (면역 통해) 마커의 발현, 세포 사멸 또는 세포 형태뿐만 아니라 변화를 식별하기. 다른 구형 영역 내의 세포 운동성은 정량화 될 수있다 - 셀 추적 이미지 분석 단계와 함께 라이브 촛점 시간 경과 화상이 추가되는 경우. 이미지 분석에 중요한 높은 품질의 Z- 조각 공 초점 이미지가 더 높은 해상도의 이미지는 세포보다 쉽게​​ 식별 할 수 있도록, 얻을 수 있다는 것입니다. 이미지 분석 한 제한은 핵이 너무 조밀 경우 제대로 모든 셀을 찾을 수 없다는 점, 또는 적색 및 녹색 강도가 너무 많은 편차가 존재하는 경우. (초기 G1)에 FUCCI 음성 세포,이 이미지 분석 방법 만 빨간색 (G1)에서 발견 할 수없는노란색 (초 S 상)과 녹색 (S / G2 / M). 여기에 설명 된 이미지 기반의 분석 방법...

다세포 차원 타원체는 그러나 그들이 많은 고형암에 대한 체외 모델로 일반적인 사용에 온 것이 최근이다, 수십 년 동안 종양 모델로 알려져있다. 그들은 점점 복잡, 고가이며 시간 소모적 인 비보 모델에서와 간단한 저비용 차원 단층 모델 1-6 사이의 중간으로 높은 처리량 약물 발견 화면에 사용하고있다. 2D 문화 연구는 종종 생체 내에서 복제 할 수 없습니다. 많은 종류의 암의 회전 타원체 모델은 성장 특성, 약물 감수성, 약물 침투, 세포 - 세포 상호 작용, 고형 종양 6-11 생체 내에서 볼 산소 및 영양분과 괴사 현상의 제한된 유용성을 모방 할 수있다. 스페 로이드는 회전 타원체 (7)의 주변부 괴사 코어, 코어를 둘러싸는 대기 또는 G1 체포 영역 및 세포 증식을 개발한다. 이들 영역의 개발세포 밀도, 증식 속도 및 회전 타원체 (12)의 크기에 따라 달라질 수있다. 그러나, 이들 서로 다른 서브 - 지역에서 보이는 세포 이질성은 암 치료 용 저항 (13, 14)에 기여할 수 있음을 가정하고있다. 따라서, 이들 영역에서 세포를 분석하는 기능은 별도 이해 종양 약물 반응에 중요하다. 세포주기 (15)의 다른 단계에서 열화 Cdt1 및 geminin 형광 태그 - 녹색 (AG Azami 그린) - 형광 유비퀴틴 세포주기 표시기 (FUCCI) 시스템은 적색 (KO Kusabira 오렌지)에 기초한다. 따라서 세포 핵은 초 S 노란색, G1 빨간색과 S / G2 / M 단계에서 녹색 나타납니다. 우리는 여기에 두 개의 상보적인 방법을 기술 모두 셀 G1 체포 센터 혹은 외측 proliferatin에 상주하는지 여부를 결정하기 위해 이미징 소프트웨어 또는 분석 계측법 염료 확산 유동의 사용과 함께, 세포주기를 식별 FUCCI를 사용g 링과 회전 타원체의 에지로부터 각 셀의 거리. 또는 / 및 표적 치료의 존재하에 장시간 G1 체포에 남아있게하고, 재 수 이들 방법은 우리가 회전 타원체의 중심에 저산소 영역에서 그 흑색 종 세포를 보여 이전 공보, 개발되었다 보다 유리한 조건이 발생할 때 7 세포주기를 입력한다.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 저융점</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>고귀한 아가르 분할용&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5431</td> 스<td>페로이드 제작</td></tr><tr><td>용 아가로스</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>스페로이드 제조용</td></tr><tr><td>0.05% 트립신/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10% 포르말린</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>주의 : 유해하고 부식성이 있습니다. 개인 보호 장비를 사용하십시오, 하십시오 &nbsp; 숨을 쉬지 않습니다 (연기 찬장에서 열려).</td></tr><tr><td>IR Life</td><td>Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>vibratome</td><td>Technical Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>쿨쳐 컵</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SIE936</td><td>스페로이드 혈구계 절편용 금형</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>96-well 조직 배양 플레이트</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해</td>효소 <td>시그마</td><td>C5138&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>컨 포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>flowjo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>유세포 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>진공 그리스</td><td>시그마</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디어</td><td>벡터 Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI (commercial constructs)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>Transient transfection only</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &#956; m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>둥근 바닥 5ml 튜브 (멸균)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>둥근 바닥 5ml 튜브 (비 멸균)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging- 및 유동 세포 계측법 기반의 셀 위치의 분석 및 3d 흑색 종 회전 타원체의 세포주기

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

3차원(3D) 종양 스페로이드는 기존의 2차원(2D) 세포 배양에 비해 생체 내 종양 미세환경의 보다 정확한 모델로 암 연구에 활용됩니다. 스페로이드 모델은 세포-세포 상호 작용, 저산소증 및 영양 결핍, 약물 침투의 영향을 모방할 수 있습니다. 이 모델의 한 가지 특징은 G1 정지 세포의 고리로 둘러싸인 괴사 코어의 발달이며, 스페로이드의 바깥 층에 증식하는 세포가 있습니다. 암 분야에서 흥미로운 것은 스페로이드의 다양한 영역이 약물 요법과 유전적 또는 환경적 조작에 어떻게 반응하는지입니다. 여기에서는 흑색종 스페로이드 내부의 위치와 관련하여 세포의 세포주기 상태를 특성화하기 위해 상용 소프트웨어를 사용한 세포 분석 및 이미지 분석과 함께 형광 유비퀴틴화 세포 주기 지표(FUCCI) 시스템의 사용에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 시간이 지남에 따라 다양한 조건에서 종양 스페로이드의 다른 하위 영역에서 세포주기 상태, 유전자/단백질 발현 또는 세포 생존력의 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

종양 구 상체를 제조하는 몇 가지 방법이 프로토콜은 세포가 아가 또는 아가로 오스 3,7,9에 배양 비 - 부착 성장 법을 사용있다. (1) 한천 3 일후 C8161 흑색 타원체의 일례를 도시한다. C8161의 타원체 (500)의 직경이 일반 크기의 타원체 형성 - 600 μm의 후 3 일 (= 565, SD = 19, N = 3을 의미). 타원체를 형성 할 다른 흑색 종 세포 라인은 다음과 같습니다 : WM793는, WM983C는, WM983B는, WM164는, 1205lu (이 셀 라인을 형성 타원체가 불규칙하고 19 밀도가 낮은 있습니다). 3D 타원체 모델 내의 개별 세포의 세포주기를 시각화하기 위해서, C8161 흑색 종 세포 FUCCI 시스템 7,15 형질 도입 하였다. 때문에 타원체의 큰 크기 (최대 아가로 오스 3 일 후에 직경 1mm 및 C8...

형광 유비퀴틴화 세포 주기 지표(FUCCI)와 이미지 분석 또는 유세포 분석을 사용하여 3D 스페로이드의 내부 G1 정지 및 외부 증식 영역에서 세포를 식별하고 분리하는 두 가지 상호 보완적인 방법을 설명합니다.

Imaging- 및 유동 세포 계측법 기반의 셀 위치의 분석 및 3D 흑색 종 회전 타원체의 세포주기

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

이 방법의 전반적인 목표는 2D 세포 배양과 비교하여, 다세포 스테로이드 내 세포들의 세포 주기 상태와 스테로이드 내 위치에 따라 세포를 식별, 특성화 및 분리하는 것입니다. 3D OID 모델은 종양 구조와 미세환경을 모방하여 체내 암 생물학을 재현합니다. 구체(spheroids)를 유세포 분석 및 이미징 기술과 결합함으로써, 이 방법은 종양 미세환경이 약물 민감도, 세포 이동성 및 증식을 어떻게 변화시키는지와 같은 암 연구 분야의 핵심 질문들에 답할 수 있습니다.이 방법의 주요 장점은 세포 주기를 실시간으로 시각화할 수 있으며, 특정 스테로이드 영역에서 살아있는 세포를 정제할 수 있다는 점입니다. 실험 절차는 우리 실험실의 연구 보조원인 A sharp가 수행합니다. 100 mL의 Hank's balanced salt solution(HBSS)에 1.5% agarose를 넣고 3~5분 동안 전자레인지로 가열하여 3D 스테로이드 형성 준비를 시작합니다. agarose가 완전히 용해되도록 플라스크를 간헐적으로 흔들어 줍니다. 그 후, 평평한 바닥의 96-well 조직 배양 플레이트의 각 웰에 agarose 용액 100 µL를 즉시 피펫팅하여 넣습니다. agarose가 응고될 수 있도록 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.다음으로, FCI 컨스트럭트를 발현하는 80% 합류도(confluence)의 흑색종 세포 배양물을 세포 배양 인큐베이터에서 꺼냅니다. 세포를 10 mL의 HBSS로 세척합니다. 0.05% EDTA 1.5 mL를 첨가한 후, 세포를 37 °C에서 약 2분 동안 배양합니다.세포가 분리되면 10 mL의 세포 배양 배지에 현탁합니다. 헤모사이토미터와 도립 현미경을 사용하여 세포 수를 수동으로 측정하고, 세포 배양 배지에서 mL당 25,000 cells가 되도록 희석합니다. 그 후, 96-well plate의 각 웰 위에 세포 현탁액 200 µL를 피펫으로 분주합니다.세포 스페로이드를 형성하기 위해 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 약 3일 동안 배양합니다. 배양 후, Forex 대물렌즈와 위상차 필터를 장착한 도립 현미경으로 스페로이드를 촬영합니다. 섹셔닝 및 이미징을 위해 준비된 세포 스페로이드는 조밀하고 대략적인 구형의 세포 응집체 형태로 나타나야 합니다.1 mL 피펫을 사용하여 이들을 팰컨 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 스테로이드가 원추형 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다. 다음으로, 흡입을 통해 배지를 제거하고, 10% 중성 완충 포르말린에서 실온으로 최소 2시간 동안 배양하여 스페로이드를 고정합니다.세포의 절편 제작 및 이미징 후, SP는 4°C의 HBSS에서 수일 동안 보관할 수 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어를 실행하고 정량 분석 전용 설정을 선택하십시오. 그런 다음 새 라이브러리를 생성하고, 원시 데이터 파일을 라이브러리로 드래그하여 스페로이드 공초점 이미지 파일을 가져오십시오.다음으로, 측정(measurements) 탭으로 이동하여 프로토콜 창에 명령어를 올바른 순서대로 드래그 앤 드롭하여 이미지 분석 프로토콜을 구성합니다. 녹색 채널에서 객체를 찾으려면 찾기(finding) 섹션에서 객체 찾기(find objects) 명령어를 프로토콜 창으로 드래그 앤 드롭한 후 적절한 채널을 선택합니다. 처리(processing) 항목 아래에 있는 열기(open) 명령어를 추가하고, 이어서 세포를 분리하기 위해 별도의 접촉 객체(touching objects) 명령어를 추가합니다.마지막으로, 필터링 섹션에서 크기에 따라 객체를 추가하거나 제외합니다. 50 µm 미만의 객체를 제외하도록 설정하여 작은 비세포성 객체를 제거하십시오. 그런 다음, 새로운 객체 찾기(find objects) 명령을 프로토콜 창으로 드래그 앤 드롭합니다.동일한 단계를 따라 레드 채널을 선택하고 이후의 모든 명령을 적용합니다. 객체가 탐지되면, '채널 숨기기(hide channel)' 또는 '채널 표시(show channel)' 명령을 사용하여 빨간색 및 녹색 객체가 각각 빨간색 및 녹색 핵에 해당하는지 시각적으로 확인하십시오. 필요한 경우, '측정(measurements)'을 클릭한 후 '피드백 옵션(feedback options)'을 선택하여 객체 마스크의 모양을 수정하십시오.이제 초기 S기 세포에 해당하는 노란색 객체를 찾으려면, 결합(combining) 섹션에 있는 교집합(intersect) 명령을 사용하여 '빨간색 객체와 초록색 객체의 교집합(intersect red objects with green objects)'을 선택하십시오. 마찬가지로, 크기가 50 µm 미만인 객체는 제외합니다. G1기 세포를 식별하려면, 결합(combining) 섹션에 있는 차집합(subtract) 명령을 사용하여 '빨간색 객체에서 노란색 객체 제외(subtract yellow object from red objects)'를 선택하여 순수하게 빨간색인 객체만 찾으십시오.마찬가지로, 녹색 객체에서 황색 객체를 빼서 SG two 및 MPH 상 세포에 해당하는 전용 녹색 객체만을 식별하고, 전용 적색 객체와 전용 녹색 객체 모두에 대해 이를 수행합니다. 필터링 섹션의 필터 집단 명령을 적용하여 형상 계수(shape factor)가 0.25보다 큰 값을 설정함으로써 필요에 따라 비세포 객체를 제거합니다. 그런 다음 S 구형 외곽선을 찾습니다.녹색 또는 적색 채널의 찾기 섹션에서 객체 찾기 명령을 사용합니다. 처리 섹션의 닫기 명령을 사용하여 개별 세포들을 하나의 객체로 결합합니다. 그런 다음 객체 내 구멍 채우기 명령을 추가하여 구형의 구멍을 채웁니다.다음으로, 미세 필터를 사용하여 Sphero 객체에서 노이즈를 제거하십시오. 30,000 µm보다 작은 객체를 제거하기 위해 '크기별 객체 제외(exclude objects by size)'를 선택하여 구형 윤곽선 찾기를 완료하십시오. 모든 객체가 정의되면, 관련 섹션에서 '거리 측정(measure distances)'을 추가하여 각 OID에서 S 구형 윤곽선 가장자리까지의 거리를 결정하십시오.노란색, 빨간색 단독 및 초록색 단독 집단 각각에 대해 이 과정을 수행하십시오. 세포에서 가장 가까운 S 구형체 가장자리까지의 최소 거리를 시각화하려면, 측정(measurements) 탭을 열고 피드백 옵션(feedback options)을 선택한 후 관계(relationships)를 선택하십시오. 그런 다음 거리 표시(show distances)를 선택하십시오.마지막으로, 프로토콜에 의해 생성된 데이터를 저장하기 위해 프로토콜을 저장합니다. 측정 섹션에서 측정 수행 항목을 선택하십시오. 그 후 데이터를 해석하기 위해 측정 항목을 선택하고, 측정 섹션의 분석 탭으로 이동하여 분석 메뉴에서 분석(Analyze)을 선택하여 스테로이드 가장자리로부터 특정 거리에서 발견된 세포의 수를 측정합니다.분석 탭에서 필터를 선택하여 필터를 생성하십시오. 예를 들어, 구체 가장자리로부터의 거리가 100 microns 미만인 데이터만 표시하도록 설정합니다. 원본 데이터를 내보내려면 파일 탭에서 내보내기를 선택한 다음, 데이터를 쉼표로 구분된 텍스트 또는 탭으로 구분된 텍스트로 저장하십시오.이 데이터는 추가 분석을 위해 스프레드시트 프로그램에서 열 수 있습니다. C 8 1 16 1에서 생성된 세포 구체입니다. Fuji 시스템으로 형질전환된 인간 흑색종 세포를 고정하고 절편으로 만들었습니다.세포 주기 중 G2 M기에 있는 세포를 표지하는 AZA green과 G1기에 있는 세포를 표지하는 Berra orange에 대해 공초점 이미징을 수행하였습니다. 이 이미지들을 중첩시키면 예상대로 괴사성 중심부(necrotic core)와 같은 주요 특징들을 관찰할 수 있습니다. 적색의 G1기 정지 세포들이 이 괴사성 중심부 근처에 주로 분포하며, 산소와 영양소에 대한 접근성이 가장 높은 스테로이드 외부 가장자리로 갈수록 적색 및 녹색의 증식 세포들이 구배 방식으로 증가합니다.반자동 이미지 분석 후, fucci 세포 마스크와 S 구체 외곽선을 정의할 수 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 S 구체의 내부 또는 외부 영역에 있는 적색 및 녹색 세포를 정량화했습니다. 이 분석 결과, G1기 정지 세포는 내부 영역에 풍부한 반면, 증식 세포는 구체 가장자리에 더 가까이 분포하는 것으로 나타났습니다.이 기술을 숙달하면 스테로이드 배양, 이미징 및 분석을 포함하여 1~2주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에 rads를 콜라겐 매트릭스에 이식하고 타임랩스(TimeLapse) 현미경으로 이미징할 수 있습니다. 그 후 단백질 또는 RNA 분석을 수행할 수 있으며, 이를 통해 스테로이드 내의 위치와 산소 및 영양분에 대한 접근성이 암세포 표현형을 변화시킬 수 있는지와 같은 질문에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

여기, 우리이 두 아키텍처는 3D organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델을 생성 하는 프로토콜을 제시 하 고 다세포 복잡 한 기관/종양에 vivo에 의 하지만 같은 시간에 수용 체계적인 실험 내정간섭입니다.

3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

종양 세포와 기질 섬유아세포의 이질적 상호작용에 기초한 새로운 3차원 스페로이드 모델이 확립된다. 여기에서, 우리는 spheroids의 대형을 구상하기 위하여 종양 세포 및 기질 섬유아세포, 시간 경과 화상 진찰 및 공초점 현미경 검사법의 공동 배양제시합니다. 이 3차원 모델은 종양-기질 상호 작용을 연구하고 암 치료제를 테스트하는 적절한 플랫폼을 제공합니다.

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

여기에 제시된 스페로이드 이미징 장치의 제조를 위한 프로토콜이 있습니다. 이 장치는 암 세포 스페로이드의 동적 또는 세로 형광 이미징을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 또한 암세포 침입의 분석을 위한 간단한 화상 처리 절차를 제공합니다.

3D 스페로이드 모델에서 암세포 침입의 시간 해결 형광 화상 진찰 및 분석

종양 구상체는 종양 세포-미세환경 상호작용 및 치료 반응을 평가하기 위해 점점 더 활용되고 있다. 본 프로토콜은 신속한 광학 클리어링을 사용하여 3D 종양 구상체의 반고처리량 이미징을 위한 견고하지만 간단한 방법을 기술한다.

종양 구상체의 반 높은 처리량 분석을 위한 신속한 광학 클리어링

여기에서는 3차원(3D) 콜라겐 I 매트릭스에서 1차 인간 단핵구 유래 대식세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 조사하기 위한 프로토콜을 제시하며, 미세환경의 용해성 및 물리적 특성이 세포 침입에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

배우세요 3D 흑색종 스페로이드에서 FUCCI와 이미징 및 유동 세포 계측법을 이용한 세포주기 분석 방법을. 이 기술은 실시간 세포주기 가시화 및 특정 영역 세포 분리를 가능하게 하여 암 미세환경 연구에 활용됩니다.

Imaging- 및 유동 세포 계측법 기반의 셀 위치의 분석 및 3D 흑색 종 회전 타원체의 세포주기

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