마이크로 웨이브 조사를 사용하여 잠재적 인 기생충 치료제로 백본 순환 펩타이드 라이브러리 개발

이 절차의 전반적인 목표는 새로운 항기생충 치료제를 위한 마이크로파 방사선 조사를 사용하여 구조적 다양성을 가진 집중된 backbone cyclic peptidomimetic 라이브러리를 개발하는 것입니다. 이 방법은 단백질-단백질 상호 작용을 특이적으로 표적으로 하는 새로운 도구를 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 원하는 아미노산 2.5ml, 활성제 1mL 및 활성제 베이스 0.5ml를 폴리프로필렌 카트리지에 추가합니다.

카트리지를 자동 마이크로파 합성기에 넣고 커플링 반응이 300와트 및 섭씨 25도에서 75초 동안 진행되도록 합니다. 반응이 완료되면 실온에서 120초 동안 7ml의 N, N-디메틸포름아미드 또는 DMF로 수지를 세척합니다. 이전 단계를 5회 반복한 후 0.1몰 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)과 함께 DMF에 20% 피페리딘 7ml를 폴리프로필렌 카트리지에 넣고 45와트 및 섭씨 75도에서 30초 동안 배양합니다.

완료되면 반응 혼합물을 배출합니다. 다음으로, 0.1몰 HOBt의 DMF에 20% 피페리딘 7ml를 폴리프로필렌 카트리지에 넣고 45와트 및 섭씨 75도에서 180초 동안 배양합니다. 반응 혼합물을 배출한 후 실온에서 120초 동안 7ml의 DMF로 수지를 세척합니다.

그런 다음 7ml의 디클로로메탄(DCM)으로 수지를 실온에서 120초 동안 세척합니다. 무수물 커플링의 경우 실온에서 120초 동안 7ml의 1-메틸-2-피롤리디논 또는 NMP로 수지를 세척합니다. 완료되면 반응 혼합물을 배출합니다.

이전 단계를 세 번 반복한 후 50ml 폴리프로필렌 튜브에 5ml의 NMP에 해당 무수물 10당량을 용해합니다. 그런 다음 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 1개와 N-디이소프로필에틸아민(DIEA) 10당량을 용액에 추가합니다. 이 혼합물을 수지에 넣고 25와트 및 섭씨 75도에서 300초 동안 배양합니다.

NMP로 수지를 세척한 후 DMF 7ml로 실온에서 120초 동안 세척합니다. 이 시점에서 수지를 캡 플러그와 스톱콕이 장착된 폴리프로필렌 카트리지로 옮깁니다. 수지를 DCM으로 세척한 후 수지 1g당 폴리프로필렌 카트리지에 15% 트리플루오로아세트산, 5% 트리이소프로필실란 및 94% DCM의 혼합물 15-25밀리리터를 추가합니다.

폴리프로필렌 카트리지를 셰이커에 놓고 실온에서 5분 동안 흔듭니다. 그런 다음 진공 청소기를 적용하여 폴리프로필렌 카트리지에서 용액을 배출합니다. 이전 단계를 세 번 반복한 후 실온에서 120초 동안 7ml의 DCM으로 수지를 세척합니다.

이러한 단계는 여러 수지의 트리틸 보호 그룹이 DCM-트리플루오로아세트산 용액에서 부분적으로 절단된 것으로 밝혀졌기 때문에 매우 중요합니다. methyltrityl 그룹을 제거하는 것은 여러 번 세척해야 하는 느린 과정입니다. 50 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에 5 밀리리터의 디 브로 모메탄에 Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate 5 당량을 용해시킵니다.

그런 다음 용액에 DIEA 10개를 추가합니다. 혼합물을 DCM으로 헹궈낸 수지에 넣고 25와트 및 섭씨 75도에서 300초 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 120초 동안 7ml의 DCM으로 수지를 세척합니다.

DCM으로 두 번 세척한 후 수지를 폴리프로필렌 카트리지에 옮기고 디에틸 에테르로 두 번 세척합니다. 수산화칼륨을 통해 실온의 진공 건조기에서 수지를 최소 3시간 동안 건조시킵니다. 다음으로, 수지 1g당 미리 냉각된 트리플루오로아세트산 절단 칵테일 10ml를 추가합니다.

폴리프로필렌 카트리지를 셰이커에 놓고 실온에서 3시간 동안 흔듭니다. 그런 다음 수지를 50ml 폴리프로필렌 튜브에 여과하여 절단 용액을 수집합니다. 튜브에 35ml의 차가운 디에틸 에테르를 추가합니다.

섭씨 4도에서 1, 207회 g에서 5분 동안 원심분리기. 그런 다음 에테르 층을 디캔팅합니다. Kaiser 테스트의 경우 16.5mg의 시안화칼륨을 증류수 25ml에 용해시켜 용액 A를 준비합니다.

용액 1ml를 페리딘 49ml로 희석합니다. 다음으로, 닌히드린 1g을 에탄올 20ml에 용해시켜 용액 B를 준비합니다. 40g의 페놀을 20ml의 에탄올에 용해시켜 용액 C를 준비합니다.

용액이 준비된 후 수지에서 몇 개의 비드를 시험관으로 옮깁니다. 튜브에 각 용액을 3방울 떨어뜨리고 섞습니다. 마지막으로 가열 블록의 시험관을 섭씨 110도에서 5분 동안 가열합니다.

백본 고리형 펩티드의 합성은 FMOC, t-부틸 프로토콜에 따라 고체 지지체에서 자동화된 마이크로파 합성기를 사용하여 수행되었습니다. 생성물은 질량 분석법으로 분석되었으며 순도는 HPLC를 사용하여 결정되었습니다. 생물학적 스크리닝은 펩타이드 pL1이 인간에서 가장 심각한 리슈마니아증인 내장 리슈마니아증을 일으키는 기생충인 리슈마니아도노바니에 대해 활성임을 보여주었습니다.

펩타이드 pL1은 대조군 치료제에 비해 기생충 생존율을 75% 감소시켰습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 수행된다면 3일에서 5일 안에 끝낼 수 있다. 개발 후 이 기술은 다양한 분야의 연구자들이 기초 연구 및 치료에서 약리학적 조절자로서 펩타이드를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 단백질-단백질 상호 작용을 구체적으로 표적으로 삼기 위해 구조적 다양성을 가진 집중적인 펩티도미메틱스 라이브러리를 개발하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 트리플루오로아세트산으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오., 환기가 잘 되는 후드에서 작업하는 동안 보안경, 실험실 가운 및 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.