분할 및 풀 합성 펩타이드 급 아미드 도서관의 특성

이 절차의 전반적인 목표는 펩타이드 3차 아미드 또는 PTA 단위를 포함하는 조합 라이브러리를 합성하는 방법을 보여주는 것입니다. 이것은 먼저 천연 아미노산에서 PTA 서브 모노머를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 고체 지지체에서 펩타이드 링커 영역을 합성하는 것입니다.

다음으로, PTA와 펩타이드 소단위체를 포함하는 조합 라이브러리가 합성됩니다. 마지막 단계는 합성의 품질을 보장하기 위해 합성된 라이브러리를 특성화하는 것입니다. 궁극적으로, 확인 제한 PTA 서브유닛을 포함하는 조합 라이브러리가 합성되고 이러한 라이브러리는 단백질 리간드를 제공하고 신약 발견으로 이어지기 위한 고처리량 스크리닝에 사용될 수 있습니다.

따라서 이 기사의 주제인 화학은 우리가 이전에 작업했던 일부 펩타이드 및 기타 물질보다 훨씬 더 단단한 분자를 찾기 위해 개발되었습니다. 아이디어는 더 단단한 분자의 라이브러리를 식별하면 훨씬 더 높은 친화성을 가진 단백질 표적에 결합할 것이라는 것이며, 우리는 이것이 앞으로 나아가는 약물 또는 흥미로운 프로브 분자를 개발하려고 시도하는 데 매우 중요하다고 생각했습니다. 온도와 타이밍 제어가 성공적인 합성에 정말 중요하기 때문에 합성을 배우기 어렵기 때문에 이 PTA 아차수 합성의 시각적 시연은 정말 중요합니다.

먼저 8.9g의 다이네와 11.9g의 브롬화칼륨을 마그네틱 교반 막대가 있는 500ml 3넥 라운드 바닥 플라스크에 추가합니다. 그런 다음 미리 준비한 30% 브롬화수소 용액 100ml를 플라스크에 추가합니다. 플라스크를 섭씨 10도의 에틸렌 글리콜에 넣은 후 플라스크 바닥에서 긴 바늘을 통해 드라이 아이스 목욕 거품 아르곤을 10분 동안 가열합니다.

300 RPM에서 마그네틱 교반 막대로 용액을 교반했습니다. 그런 다음 미리 준비된 아질산나트륨 용액을 3개의 목, 둥근 바닥 플라스크에 부착된 압력 균등 적하 깔때기에 추가하고 격막으로 밀봉합니다. 낙하 깔때기의 밸브를 천천히 열어 아질산나트륨 용액이 플라스크로 떨어지도록 합니다.

밸브를 제어하여 점적 속도를 초당 약 2방울로 조정합니다. 아질산나트륨 첨가가 완료된 후 용액을 3시간 더 저어주어 온도가 섭씨 영하 10도에서 실온으로 예열되도록 합니다. 용액의 색이 너무 어두우면 진공 청소기를 적용하여 반응 중에 생성된 과도한 질소 산화물과 브롬을 제거하십시오.

용액이 추출 깔때기로 옮겨지면 35ml의 다틸 에테르로 제품을 세 번 추출합니다. 유기상을 결합하고 포화 소금물로 세척한 후 플라스크에 넣고 황산나트륨에서 6시간 동안 건조시킵니다. 황산나트륨을 여과한 후 진공 상태에서 용매를 증발시켜 투명하거나 옅은 노란색 오일을 생성합니다.

실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 조제품을 동위원소 표지를 위해 3:1 헥산 에틸 아세테이트로 정제하고, 50ml 폴리에틸렌 튜브에 300mg의 L 알라닌을 10ml의 중수소수와 함께 용해시킵니다. cos 기질로 알파 케토글루타레이트 10mg을 첨가한 후 튜브를 섭씨 37도로 예열합니다. 완료되면 1몰 나트륨 듀트 산화물 용액과 pH 테스트 스트립을 사용하여 pH를 8.5 - 8.7로 조정합니다.

다음으로, 용액에 0.1mg의 알라닌 트랜스아미나제를 첨가합니다. 튜브를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 10-30RPM으로 가볍게 흔들면서 밤새 배양합니다. 이 시점에서 12 밀리리터 주사기 반응기에서 3 시간 동안 12 밀리리터 주사기 반응기에서 3 시간 동안 90 미크론 1g, 10 그램을 램 링커로 겔 비드로 팽창시키고 반응기에서 디메틸 포름 아미드를 배출하고 10 밀리리터의 20 % 파이 페린 디메틸 포름 아미드 용액을 첨가하여 링커 중앙의 링크에서 FOC 그룹을 보호합니다.

20% 페퍼다인 용액으로 구슬을 30분 동안 흔든 후 디메틸 포마 고기로 5번 씻어 페퍼다인을 모두 제거합니다. 다음으로, 주사기에서 몇 개의 구슬을 제거하고 염소 테스트로 테스트합니다. 2 몰의 브로모 아세트산 디메틸 포름 아미드 용액 2 밀리리터를 구슬에 넣고 부드럽게 흔듭니다.

그런 다음 2 몰 diop 프로필 카르보 디아민 디메틸 포름 아미드 용액 2 밀리리터를 비드에 첨가합니다. 플런저로 주사기를 밀봉한 후 셰이커에서 구슬을 10분 동안 흔듭니다. 비드가 디메틸 포름 아미드로 철저히 세척되면 이전에 준비된 1 몰 메톡시 에틸 디메틸 포름 아미드 용액 2 밀리리터를 첨가합니다.

구슬을 흔들고 디메틸포름아미드로 5번 씻은 후 염소 테스트로 몇 개의 구슬을 확인합니다. 그런 다음 이전에 사용한 주사기에 10ml의 일대일 디클로랄 메탄 디메틸포름아미드 용액을 추가합니다. 끝이 잘린 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 모든 1g 비드를 5ml 주사기 반응기 3개로 균등하게 분할합니다.

3개의 주사기를 클로로 메탄으로 3회 세척한 후 R과 S 라벨이 붙은 주사기를 무수 tet 하이드로 푸린으로 3회 세척하고 B 표지 주사기를 디메틸포름아미드로 3회 세척합니다. 브로모 프로판 NOIC acid의 트리스틴 결합을 위해 약 200mg의 트리스틴을 흄 후드의 바이알에 첨가하십시오. 바이알의 뚜껑을 닫으면 바이알에 들어 있는 트리스틴의 양을 계량합니다.

그런 다음 바이알에 적당량의 무수 테트라 하이드로 페란을 첨가하여 밀리리터당 20밀리그램의 Tri 포스겐 테트라 하이드로 페란 용액을 만듭니다. 브로 모 산 트리 포스겐 혼합물을 제조하려면 각 바이알에 개별적으로 2 개의 작은 바이알에 89 마이크로 리터의 R 2 브로 모 프로판 NOIC 산 및 S 2 개의 브로모 프로판 NOIC 산 D 4 개를 첨가하고 5 밀리리터의 트리스틴 테트라 하이드로 푸란 용액을 첨가한다. 바이알을 밀봉한 후 섭씨 20도의 냉동고에 20분 동안 넣습니다.

그 동안에, 1, 125 마이크로 리터의 2 대 1 테트라 하이드로 푸란 디 이소 프로필 아민 용액을 주사기 r 및 s에 첨가하십시오. 별도로, 356 마이크로 리터의 2 4 6 트리메틸 퓨린을 냉각된 브로모산 포스겐 혼합물을 포함하는 각 바이알에 추가하여 흰색 침전물을 생성합니다. 즉시 해당 현탁액을 ified beads에 직접 적용한 다음 shaker에 올려 120RPM 미만으로 2시간 동안 흔듭니다.

디 이소 프로필 카르보 디아민과 브로 모 아세트산 커플 링의 경우, 주사기 B.에 2 몰 브로 모 아세트산 디메틸 포름 아미드 용액 5 밀리리터를 첨가 한 후 동일한 주사기에 2 몰 디 프로필 카르보 디아민 디메틸 포름 아미드 용액 5 밀리리터를 첨가하고 주사기 r 및 s와 동일한 셰이커에서이 주사기 B를 따라 부드럽게 흔든다. 그런 다음 디클로로 메탄과 디메틸포름아미드로 주사기를 철저히 세척한 후 2시간 동안 주사기를 흔듭니다. 주사기 R, s 및 B의 모든 비드를 하나의 12ml 주사기 반응기에 모읍니다.

비드를 디메틸포름아미드로 5회 세척한 후 10ml의 일대일 디클로로 메탄 디메틸포름아미드 용액을 주사기에 추가합니다. 발산을 위해 잘린 피펫 팁이 있는 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 모든 비드를 7개의 개별 2밀리리터 주사기로 균등하게 분할하고, 이전에 준비된 7개의 몰 아민 용액 5밀리리터를 해당 주사기에 추가합니다. 7개의 주사기를 모두 섭씨 60도의 인큐베이터에서 밤새 흔들어 배양 후 배양합니다.

5번 절단해야 하는 구슬을 디클로랄 메탄으로 씻습니다. 구슬을 15분 동안 흔들고 디 클로로 메탄으로 다시 씻은 후 주사기에서 디 클로로 메탄을 배출합니다. 그런 다음 각 개별 비드를 96웰 플레이트로 옮깁니다.

광학 현미경과 팁이 잘린 피펫을 사용하여 96웰 플레이트를 커버 슬립으로 덮고 섭씨 20도의 음의 냉동고에 15분 동안 넣습니다. 플레이트를 냉동실에서 꺼낸 후 이전에 준비된 냉각된 일대일 TFA DI 클로로 메탄 용액 20마이크로리터를 비드가 포함된 각 웰에 추가합니다. 커버 슬립을 교체하고 96 벽판을 섭씨 20도의 음의 냉동고에 있는 셰이커에 다시 놓습니다.

20분 동안 흔든 후 냉동실에서 96 벽판을 제거하고 커버 슬립을 떼어냅니다. 각 우물에 공기를 불어 넣어 디 클로로 메탄을 불어 건조시킵니다. 50%TFA DI CHLORO 메탄 용액을 사용하여 실온에서 절단하면 상당한 분해가 관찰됩니다.

피크 593 및 484는 각각 링커 및 PTA 트리머에 해당하며, 이는 전체 분자가 비드에서 성공적으로 합성되었지만 절단 중에 분해되었음을 보여줍니다. 상기와 같이 저온 조건에서 절단하면 TFA에 의한 분해의 양이 크게 억제됩니다. 분열 메커니즘은 이전 문헌에서 설명되었으며 Ms.MS 에 의해 서열분석될 수 있는 올레인 중간 PTA 분자를 통과하는 것으로 여겨지며, 단편화 패턴은 펩티드 및 펩티드와 유사합니다.

S 2 개의 브로 모 전극자 산 D 4로 합성 된 PTA 분자는 일반적으로 MS 및 msm에서 더 넓은 피크를 제공합니다. S 2 bromo propan, NOIC 산 D 3와 같은 불완전한 내구 제품의 존재 때문에 Ms.Spectra는 연속 절차 도중 R 키랄 센터의 존재의 표시로 사용될 수 있었다, PTA 분자는 또한 펩티드 펩티드 보다는 더 많은 ated 부가물을 형성하는 경향이 있다. 따라서 저나트륨 물 및 플라스틱 장치가 선호됩니다.

또 다른 잠재적인 부산물은 아민화 중 브롬 제거로 형성된 아크릴아마이드입니다. 아크릴아마이드가 형성되면 서열이 종료됩니다. 이것은 용액을 줄이기 위해 1차 아민 농도를 1몰로 낮추면 해결할 수 있습니다.

Basicity 좋은 크기의 라이브러리를 마스터하면 제대로 수행되면 2 일 안에 준비 할 수 있습니다. 이제 이 화학이 완전히 개발되고 합성이 매우 효과적이므로 다른 연구자들이 이 강력한 기술을 채택하여 약물 개발 및 프로브 개발을 위한 구조적으로 제한된 펩타이드 모방체를 만들 수 있기를 바랍니다.