분할 및 풀 합성 펩타이드 급 아미드 도서관의 특성

본 실험의 전반적인 목적은 펩타이드 3차 아미드 또는 PTA 단위를 포함하는 조합 라이브러리를 합성하는 방법을 제시하는 것입니다. 이는 먼저 천연 아미노산으로부터 PTA 서브 모노머를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 고체 지지체 상에서 펩타이드 링커 영역을 합성하는 것입니다.

다음으로, PTA 및 펩타이드 서브유닛을 포함하는 조합 라이브러리를 합성합니다. 마지막 단계는 합성된 라이브러리를 특성화하여 합성 품질을 확인하는 것입니다. 최종적으로, 입체 구조가 제한된 PTA 서브유닛을 포함하는 조합 라이브러리가 합성되며, 이러한 라이브러리는 고처리량 스크리닝에 사용되어 단백질 리간드를 제공하고 신약 발견으로 이어질 수 있습니다.

본 논문의 주제가 되는 화학 기술은 이전에 연구했던 펩타이드 및 기타 물질보다 훨씬 더 강직한 분자를 찾으려는 시도에서 개발되었습니다. 더 강직한 분자 라이브러리를 발굴하면 단백질 표적에 훨씬 더 높은 친화력으로 결합할 수 있다는 아이디어였으며, 이는 향후 약물을 개발하거나 흥미로운 프로브 분자를 만드는 데 매우 중요하다고 생각했습니다. PTA 서브오더 합성의 시각적 시연은 매우 결정적인데, 온도와 타이밍 조절이 성공적인 합성에 매우 중요하므로 합성법을 익히기가 어렵기 때문입니다.

먼저, 마그네틱 스터 바가 들어 있는 500 milliliter 3구 라운드 바텀 플라스크에 dine 8.9 grams와 브로민화 칼륨 11.9 grams를 넣습니다. 그런 다음, 이전에 준비한 30% 브로민화 수소 용액 100 milliliters를 플라스크에 추가합니다. 플라스크를 -10 °C의 에틸렌 글리콜-드라이아이스 배스에 넣은 후, 긴 바늘을 통해 플라스크 바닥부터 아르곤 가스를 10분 동안 버블링합니다.

마그네틱 stir bar를 사용하여 용액을 300 RPM으로 교반합니다. 그 후, 미리 준비한 아질산나트륨 용액을 3구 라운드 바텀 플라스크에 연결된 압력 평형 적하 깔때기에 넣고 세프텀으로 밀봉합니다. 적하 깔때기의 밸브를 천천히 열어 아질산나트륨 용액이 플라스크 안으로 한 방울씩 떨어지게 합니다.

밸브를 조절하여 적하 속도가 초당 약 2방울이 되도록 맞춥니다. 아질산나트륨 첨가가 완료되면, 용액을 3시간 동안 더 교반하며 온도가 -10 °C에서 실온까지 올라가도록 둡니다. 용액의 색이 너무 진할 경우, 진공을 가해 반응 중에 생성된 과잉 질소 산화물과 생성되었을 가능성이 있는 브롬을 제거합니다.

용액을 분액 깔때기에 옮긴 후, 35밀리리터의 에틸 에테르로 생성물을 3회 추출합니다. 유기층을 합치고 포화 식염수로 세척한 다음, 이를 플라스크에 수집하고 황산나트륨으로 6시간 동안 건조합니다. 황산나트륨을 여과한 후, 진공 상태에서 용매를 증발시켜 투명하거나 옅은 노란색의 오일을 얻습니다.

헥산과 에틸아세테이트를 3:1 비율로 혼합한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 조생성물을 정제하십시오. 동위원소 표지를 위해 50 mL 폴리에틸렌 튜브에 L-alanine 300 mg을 중수 10 mL에 녹입니다. 보조 기질로 alpha-ketoglutarate 10 mg을 첨가한 후, 튜브를 37 °C로 가온합니다. 완료되면 1 M 나트륨 중산화물 용액과 pH 시험지를 사용하여 pH를 8.5에서 8.7로 조절하십시오.

다음으로, 용액에 0.1 milligrams의 alanine transaminase를 첨가합니다. 튜브를 37 degrees Celsius 인큐베이터에 넣고 10 to 30 RPM의 약한 교반 상태에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 시점에 12 milliliter 시린지 리액터에서 10 milliliters의 dimethylformamide로 Ram 링커가 포함된 90 micron, 10 gel 비드 1 gram을 약한 교반 하에 3시간 동안 팽윤시킵니다. 리액터에서 dimethylformamide를 배출하고 10 milliliters의 20%pi Perine dimethylformamide 용액을 첨가하여 링커의 FOC 그룹을 탈보호합니다.

20% Pepperdine 용액과 함께 비즈를 30분 동안 흔들어 섞은 후, 모든 Pepperdine을 제거하기 위해 dimethyl formamide로 다섯 번 세척합니다. 다음으로, 시린지에서 비즈를 몇 개 꺼내어 chloral 테스트로 확인합니다. 2 M bromo acetic acid dimethylformamide 용액 2 mL를 비즈에 첨가하고 부드럽게 흔들어 줍니다.

그 다음 비드에 2 M diop propyl carbo diamine dimethylformamide 용액 2 mL를 추가합니다. 플런저로 시린지를 밀봉한 후, 쉐이커에서 비드를 10분 동안 흔들어 줍니다. 비드를 dimethylformamide로 충분히 세척한 후, 미리 준비한 1 M methoxy ethyl dimethylformamide 용액 2 mL를 추가합니다.

비드를 흔들어 준 후 dimethylformamide로 5회 세척하고, 일부 비드를 chloral 테스트로 확인합니다. 그 다음, 이전에 사용한 시린지에 1:1 di chloral methane 및 dimethylformamide 혼합 용액 10 milliliters를 넣습니다. 끝을 자른 1000 microliter 피펫을 사용하여 모든 1 gram 비드를 3개의 5 milliliters 시린지 반응기에 균등하게 나누어 담습니다.

세 개의 주사기를 클로로메탄으로 3회 세척한 후, r 및 s라고 표시된 주사기는 무수 테트라하이드로푸란으로 3회 세척하고, B라고 표시된 주사기는 디메틸포름아미드로 3회 세척하십시오. bromo propan NOIC acid의 tristine 커플링을 위해, 흄 후드 내의 바이알에 tristine 약 200 milligrams를 넣으십시오. 바이알의 캡을 닫은 후, 바이알에 들어 있는 tristine의 양을 측정하십시오.

그런 다음, 20 mg/mL Tri phosgene tetra hydro ferran 용액을 만들기 위해 적절한 양의 무수 tetra hydro ferran을 바이알에 첨가합니다. bromo acids tri phosgene 혼합물을 준비하려면, R two Bromo propan NOIC acid와 S two Bromo propan NOIC acid D four를 각각 89 µL씩 두 개의 작은 바이알에 따로 넣고, 각 바이알에 tristine tetra hydro furan 용액 5 mL를 첨가합니다. 바이알을 밀봉한 후, -20 °C 냉동고에 20분 동안 보관합니다.

그동안 1,125 µL의 2:1 tetra hydro furan di isopropyl amine 용액을 시린지 r과 s에 추가합니다. 별도로, 냉각된 bromo acids phosgene 혼합물이 들어 있는 각 바이알에 356 µL의 2 4 6 trimethyl purine을 추가하여 흰색 침전물을 형성시킵니다. 해당 현탁액을 즉시 ified 비드에 직접 적용한 다음, 쉐이커에 넣고 120 RPM으로 2시간 동안 흔들어 줍니다.

bromo acetic acid를 di isopropyl carbo diamine과 결합시키기 위해, 2 M bromo acetic acid dimethylformamide 용액 5 mL를 시린지 B에 넣습니다. 흔들어 섞은 후, 2 M di propyl carbo diamine dimethylformamide 용액 5 mL를 동일한 시린지에 넣고 가볍게 흔든 다음, 시린지 B를 시린지 R 및 S와 동일한 쉐이커 위에 놓습니다. 이어서 시린지를 di chloro methane과 dimethylformamide로 철저히 세척한 후 2시간 동안 흔들어 줍니다. 시린지 R, S, B에 들어있는 모든 비드를 하나의 12 mL 시린지 리액터에 모읍니다.

비즈를 dimethylformamide로 5회 세척한 후, 1:1 dichloromethane dimethylformamide 용액 10 milliliters를 시린지에 넣습니다. 배출을 위해 끝을 자른 1000 microliter 피펫을 사용하여 모든 비즈를 7개의 개별 2 milliliter 시린지에 균등하게 나눕니다. 미리 준비한 2 molar amine 용액 5 milliliters를 각각의 해당 시린지에 추가합니다. 배양 후, 7개의 시린지 모두를 60 degree Celsius 인큐베이터에서 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다.

절단이 필요한 비드를 디클로로메탄으로 5회 세척하십시오. 비드를 15분 동안 흔들어 준 후 다시 디클로로메탄으로 세척하고, 시린지에서 디클로로메탄을 배출하십시오. 그런 다음 각 개별 비드를 96웰 플레이트로 옮기십시오.

광학 현미경과 팁 끝을 자른 피펫을 사용하여 96웰 플레이트를 커버슬립으로 덮고 -20 °C 냉동고에 15분 동안 보관합니다. 플레이트를 냉동고에서 꺼낸 후, 비드가 들어 있는 각 웰에 미리 준비하여 냉각시킨 1:1 TFA/디클로로메탄 용액 20 µL를 첨가합니다. 커버슬립을 다시 덮고 96웰 플레이트를 쉐이커 위에 올려 -20 °C 냉동고에 다시 넣습니다.

20분 동안 흔들어 섞은 후, 96웰 플레이트를 냉동고에서 꺼내 커버 슬립을 벗겨냅니다. 각 웰 위에 공기를 불어 넣어 디클로로메탄을 완전히 말립니다. 50% TFA 디클로로메탄 용액을 사용하여 실온에서 절단할 경우, 상당한 분해가 관찰됩니다.

피크 593과 484는 각각 링커와 PTA 삼량체에 해당하며, 이는 전체 분자가 비드 상에서 성공적으로 합성되었으나 절단 과정에서 분해되었음을 보여줍니다. 위에서 설명한 것과 같이 저온 조건에서 절단했을 때, TFA로 인한 분해 양이 크게 억제됩니다. 절단 메커니즘은 이전 문헌에 기술되어 있으며, 올레인 중간체를 통해 진행되는 것으로 알려져 있습니다. PTA 분자는 Ms/MS로 서열 분석이 가능하며, 파편화 패턴은 펩타이드와 유사합니다.

S-2-브로모프로피온산 D-4로 합성된 PTA 분자는 일반적으로 MS 및 MSM에서 더 넓은 피크를 나타냅니다. 이는 S-2-브로모프로판, NOIC 산 D-3와 같은 불완전한 반응 생성물이 존재하기 때문이며, 이는 시퀀싱 과정 중 R 키랄 중심의 존재를 나타내는 지표로 활용될 수 있습니다. 또한 PTA 분자는 펩타이드-펩타이드보다 더 많은 알칼리 부가물을 형성하는 경향이 있습니다. 따라서 나트륨 함량이 낮은 물과 플라스틱 기구를 사용하는 것이 권장됩니다.

또 다른 잠재적 부산물은 아미노화 과정 중 브롬 제거로 인해 형성되는 아크릴아미드입니다. 아크릴아미드가 형성되면 서열 합성이 중단됩니다. 이는 용액의 농도를 낮추기 위해 1차 아민 농도를 1 M로 낮춤으로써 해결할 수 있습니다.

기초적인 내용을 숙달한다면, 적절히 수행했을 때 이틀 만에 충분한 크기의 라이브러리를 준비할 수 있습니다. 이제 이 화학적 방법이 완전히 개발되었고 합성이 매우 효율적이므로, 다른 연구자분들도 이 강력한 기술을 도입하여 약물 개발 및 프로브 개발을 위한 구조적으로 제한된 펩타이드 모방체(peptide mimetics)를 제작하시기를 바랍니다.