더블 형광 결합 현장에서 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

이 실험의 전반적인 목표는 이중 형광 제자리 혼성화(in situ hybridization)에 이어 면역염색(immunostaining)을 사용하여 뇌 절편에서 세 가지 다른 유전자의 발현을 동시에 검출하는 것입니다. 이 방법은 어떤 세포 유형이 내 관심 유전자를 발현하는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 세포 유형에 대한 발현을 국소화할 수 있기 위해 관심 유전자에 대한 좋은 항체가 필요하지 않다는 것입니다.

이 절차를 요약하자면, 첫날에는 고정된 조직 절편을 절단하고 하룻밤 사이에 서로 다른 두 개의 RNA 프로브와 혼성화합니다. 둘째 날에는 FITC 표지 프로브를 표적으로 하는 항체로 절편을 밤새 배양합니다. 이 항체는 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)와 결합되며, 이는 3일째에 형광 티라마이드(Tyramide)의 첨가를 촉매합니다.

그런 다음 알칼리성 인산가수분해효소 접합 항체를 사용하여 DIG 표지 프로브를 표적으로 합니다. 4일째에 이 효소는 Fast Red 용액으로 배양할 때 형광 침전물 형성을 촉매합니다. 그런 다음 절편을 관심 단백질을 표적으로 하는 1차 항체로 밤새 배양합니다.

마지막으로, 5일차에 이 단백질을 형광단 접합 2차 항체로 시각화합니다. 이 절차를 시작하려면 RNA 중합효소 프로모터가 있는 플라스미드에서 관심 유전자의 cDNA 염기서열을 포함하는 DNA 클론을 선택합니다. 다음으로, DNA 클론을 성장시키고, 소규모 플라스미드 정제 키트로 플라스미드를 추출하고, T7 및 SP6 범용 프라이머로 염기서열분석을 수행합니다.

10-20 마이크로그램의 플라스미드 DNA를 cDNA의 센스 가닥의 5 프라임 말단에서 절단하는 제한 효소로 소화합니다. 섭씨 37도에서 1.5시간 동안 배양합니다. 그런 다음 아가로스 겔에 작은 부분 표본을 실행하여 플라스미드가 완전히 선형화되었는지 확인합니다.

선형화된 플라스미드를 정제하려면 3몰 아세트산나트륨 부피의 1/10, 10밀리몰 트리스-HCl 평형 페놀 1부피, 클로로포름 이소아밀 알코올 1부피를 추가합니다. 16, 실내 온도에 1 분 동안 000 GS에 분리기를 설치하고, 위 수성 단계를 추출하십시오. 그런 다음 클로로포름 IAA 1부피를 첨가합니다.

16, 1 분 동안 000 GS에 그것을 원심 분리하고, 위 수성 단계를 추출하십시오. 이 단계를 다시 한 번 반복합니다. 그런 다음 에탄올 2량을 넣고 섭씨 영하 20도에서 1시간 또는 하룻밤 동안 유지한다.

그 후, 16, 000 GS에서 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리기. 상등액을 버리고 펠릿을 70% 차가운 에탄올로 세척합니다. 그런 다음 2.5 마이크로 리터 당 1 마이크로 그램의 cDNA 농도로 TE에 다시 현탁시킵니다.

두 프로브를 합성하려면 먼저 적절한 RNA 중합효소를 선택합니다. 그런 다음 체외 전사 반응을 준비하고 DEPC 처리된 물로 최종 부피를 최대 20마이크로리터까지 가져옵니다. 섭씨 37도에서 1.5시간 동안 배양합니다.

그런 다음 1%아가로스 겔에 1마이크로리터의 전사 반응을 실행하여 반응이 효과가 있는지 확인합니다. 겔은 선형 템플릿과 프로브의 밝은 띠를 보여줘야 합니다. 이 절차에서는 저온 유지 장치에서 15마이크로미터 두께의 냉동 조직 부분을 절단합니다.

단면을 현미경 슬라이드에 모으고 조직이 슬라이드에 부착되도록 슬라이드를 1시간 동안 건조시킵니다. 이 절차가 잘 작동하기 위한 가장 중요한 요소는 섹션의 품질입니다. 이것은 부분적으로는 관류가 잘 되고 고정된 조직을 갖는 것에 달려 있으며, 부분적으로는 RNase 오염이 없는 편평한 절편을 얻기 위한 절편 기술에 달려 있습니다.

그런 다음 섭씨 65도로 예열된 혼성화 완충액에 두 프로브를 희석하고 잘 혼합합니다. 각 슬라이드에 300마이크로리터의 혼성화 혼합물을 바르고 오븐에서 구운 커버 슬립으로 덮습니다. 그 후, 가습 챔버에서 섭씨 65도의 슬라이드를 밤새 배양합니다.

다음 날, 슬라이드를 미리 예열된 세척 버퍼가 들어 있는 Coplin 용기에 옮기고 섭씨 65도에서 30분 동안 두 번 세탁합니다. 그 후, 실온에서 MABT 세척액으로 슬라이드를 10분 동안 3회 세척합니다. 이 단계에서는 소수성 펜을 사용하여 조직 단면 주위에 원을 그립니다.

그런 다음 가습 챔버에서 ISH 차단 버퍼를 사용하여 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 양고추냉이 과산화된 공액 항 fitc 항체로 슬라이드를 밤새 배양합니다. 그런 다음 PBST가 들어 있는 코플린 병에 슬라이드를 넣습니다.

PBST에서 매번 10분 동안 세 번 세척하고 매번 새 PBST로 교체하십시오. 그 후, 슬라이드에 형광 티로마이드를 첨가하고 온화한 실에서 10분 동안 그대로 두십시오. 슬라이드를 코플린 병에 넣고 PBST에서 10분 동안 3회 세척합니다.

그 후, 실온에서 1시간 동안 ISH 차단 버퍼로 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 알칼리성 인산가수분해효소 접합 항발굴 항체를 사용하여 밤새 슬라이드를 배양합니다. 그 후, 매번 10분씩 MABT로 3회 씻으십시오.

다음으로, 실온에서 pH 8.2에서 0.1 몰 HCL로 슬라이드를 5분 동안 두 번 세척합니다. 빠른 적색 용액을 여과하고 가습된 챔버에서 빠른 적색 용액으로 섭씨 37도의 슬라이드를 배양합니다. 최적 발달을 위한 시간이 다양하므로 형광 현미경으로 슬라이드를 정기적으로 확인하여 침전물의 형성을 모니터링하십시오.

그런 다음 PBST로 10분씩 3회 씻는다. 면역조직화학을 수행하려면 IHC 차단 버퍼가 있는 슬라이드를 가습된 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 1차 항체 용액의 슬라이드를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, PBST로 슬라이드를 10분 동안 3회 세척합니다. 2차 항체 용액에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBST로 10분씩 3회 씻습니다.

그 후, 실온에서 슬라이드를 부분적으로 건조시키고 형광 장착 매체로 장착합니다. 컨포칼 현미경에서 이미징하기 전에 슬라이드를 건조시킨 상태로 두십시오. 여기에 표시된 이미지는 Aspa 및 Mbp에 대한 ISH의 대표적인 이미지이며, 그 다음에는 후크 염색과 결합된 OLIG2에 대한 면역 염색

Aspa는 피질과 말뭉치(corpus callosum)의 일부 MBP 양성 OLIG2 양성 세포에서 발현되었습니다. 일부 Mbp 양성 OLIG2 양성 세포는 Aspa를 발현하지 않습니다. 이 절차를 수행하는 동안 슬라이스와 모든 용액에 RNase 오염이 없도록 유지하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 N-시트린 억제 및 면역조직화학에 의한 유전자 발현 패턴을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 서로 다른 기원과 발달 단계의 다양한 조직에 적용할 수 있습니다.