Name: 더블 형광 결합 현장에서 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 조직에서 더블 형광 현장 하이브리드화와 면역염색을 결합하여 세 가지 유전자 발현을 동시에 검출하는 방법입니다. 이 기술은 특정 항체가 없어도 유전자 발현을 세포 유형별로 정확히 규명할 수 있습니다.

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저자의 실험실에서의 연구는 영국 생명공학 및 생명과학 연구 위원회(BB/J006602/1 및 BB/L003236/1), 웰컴 트러스트(WT100269MA) 및 유럽 연구 위원회(ERC, "아이디어" 프로그램 293544)의 지원을 받았습니다. SJ는 EMBO 장기 펠로우십의 지원을 받았습니다. 저자는 스티븐 그랜트(Stephen Grant)의 기술 지원에 감사를 표합니다.

윤리 정책 : 마우스 사육 및 처리는 동물 (과학적인 절차) 영국 및 그 개정 규정 2012 년 법 1986 준수, 영국 홈 오피스 규정 및 UCL 윤리위원회의 지침에 따라 있습니다. 참고 : 모든 솔루션은 디 에틸 피로 카보네이트 (DEPC)로해야한다 - 잔류의 RNase를 파괴 처리 된 물. 모든 DEPC의 구체 후 사라진 DEPC를 저하 오토 클레이브 때까지 DEPC 처리의 경우, DEPC (리터 당 1 ml)에 추가 격렬하게 흔들어. 1. RNA 프로브 합성 <ol><li> 주의 : 포름 아미드를 취급 할 때, 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하고 안전 캐비닛을 사용합니다. 혼성화 버퍼를 준비 : DEPC 처리 한 50 % (v / v)의 탈 포름 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5 200 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA, 10과 탈 이온수를 5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 5 mM의 나 2 HPO 4 0.01 ㎎ / ㎖ 효모의 tRNA, 1 × 덴 하르트의 soluti에서 10 % / V 덱스 트란 설페이트 w </li><li> RNA 폴리머 라제 프로모터를 가진 플​​라스미드 관심의 유전자의 cDNA 서열을 포함하는 DNA 클론을 선택한다. 이 예를 들어, ASPA을위한 T7 및 SP6 RNA 중합 효소 프로모터 (보충 그림 1)과을 pCMV-SPORT6 클론, IRAVp968C0654D (젠 뱅크 accessionBC024934)를 사용합니다. </li><li> 템플릿으로 선형화 된 플라스미드 DNA를 준비합니다. <ol><li> 는 DNA의 복제를 성장 T7 및 SP6 범용 프라이머와 제조 업체의 프로토콜과 순서에 따라 소규모 플라스미드 정제 키트와 플라스미드를 추출합니다. </li><li> cDNA에의 센스 가닥의 5 &#39;말단에서 절단하는 제한 효소로 1,020 μg의 플라스미드 DNA를 소화. 이 예를 들어,을 pCMV-SPORT6- ASPA 플라스미드를 소화 100 단위 샐 I를 사용합니다. 37 오 ℃에서 1.5 시간 동안 품어 </li><li> 플라스미드가 완전히 선형화되어 있는지 확인하는 아가 로스 젤에 작은 나누어지는을 실행합니다. </li></ol></li><li> 정화페놀 - 클로로포름을 사용하여 선형화 된 플라스미드. <ol><li> 3 M 아세트산 나트륨 1/10 부피, 10 mM 트리스 염산 (PH 8.0)의 하나의 볼륨 추가 - 평형화 페놀 및 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (IAA)의 하나의 볼륨 (24 : 1). </li><li> (- 25 ° C, RT 20) 및 추출 상 수상을 실온에서 1 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 분 동안 16,000 XG에 클로로포름 / IAA, 원심 분리기의 하나의 볼륨을 추가하고 위 수상의 압축을 풉니 다. </li><li> 단계를 반복 1.4.3. </li><li> 에탄올 2 볼륨을 추가하고 1 시간 또는 O / N -20 ℃로 둡니다. </li><li> 10 분 동안 4 ° C에서 16,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. </li><li> 70 % 차가운 에탄올로 펠렛을 씻고 TE 2.5 μL 당 approximatively 1 μg의 cDNA를 (10 mM 트리스 - 염산, 1 mM의 EDTA의 pH 7.5)에 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li><li> 두 개의 프로브, 디곡시 제닌 (DIG) 표지 하나 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC)와 다른 합성. <ol><li> 안티 SE 있도록 적절한 RNA 폴리머 라제를 선택(대상의 mRNA와 상보) NSE 프로브. 이 예 ASPA 프로브를 만들기 위해 T7의 RNA 폴리머 라제를 사용한다. </li><li> 시험 관내 전사 반응을 준비 : 1 선형화 된 DNA의 μg의 4.0 μl를 5 × 전사 버퍼, 100 mM의 DTT의 6.0 μL, 10 배 DIG 또는 FITC RNA 라벨 믹스 포함 된 dNTP 2.0 μL, 1 μL RNA 분해 효소 억제제, 20 추가 - (40) RNA 중합 단위; DEPC 처리 된 물 20 μL에 최종 볼륨을 구성합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 37 ℃로 품어. </li></ol></li><li> 1.0 % 아가로 오스 겔상에서 전사 반응 Run1로 μL 반응이 작동되었는지를 확인한다. 겔은 선형 템플릿과 프로브의 밝은 밴드를 표시해야합니다. </li><li> 하이브리드 버퍼 100 μL에 볼륨을 확인하고 -80 ° C에서 10 μL 씩 저장합니다. </li></ol> 2. 관류, 고정 및 조직 컬렉션 <ol><li> 주의 : (PFA) 파라 포름 알데히드를 처리 할 때 모두 고체 및수성은, PPE를 착용하고 안전 캐비닛을 사용합니다. 열 (55 ° C)를 이용하여 PFA로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (V / W) 4 % 포름 알데히드를 용해시켜 용액을 제조 하였다. 여과지와 포름 알데히드 용액을 필터. </li><li> 증류수에 자당 (/ V W) 20 %를 용해하여 자당 솔루션을 준비하고 0.1 % (v / v)의 DEPC 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 느슨한 뚜껑 후 오토 클레이브에 실온에서 O / N를 남겨주세요. </li><li> 펜토 바비 말단의 복강 내 주사 (50 ㎎ / ㎏)하여 마우스를 마취시키다. 발가락 핀치함으로써 마취 깊이를 평가하고 움츠림 반사가없는 깊은 마취를 나타낸다. </li><li> 마우스가 깊은 마취되면, 흉곽 아래에 절개를하고 양쪽의 갈비뼈를 절단, 심장을 노출 들어 올립니다. </li><li> 심장의 좌심실로 25 G 바늘을 삽입합니다. 심장의 우심방에있는 작은 절개를합니다. </li><li> 20 ml의 PBS로 동물 다음 40 ml의 포름 알데히드 용액을 관류. P30 세 이상마우스, 12 ㎖ / 분의 재관류 속도를 사용하지만 어린 동물 낮은 비율 용도 (7 - 10 ㎖ / 분). </li><li> 뇌를 해부하다. <ol><li> 귀에서 컷 후방을하여 수술 가위로 마우스 머리를 절단. 피부에 꼬리 정중선 절개를하고 두개골에서 피부를 제거 rostrally 작동합니다. </li><li> 꼬리 부분에서 시작, 중간 선을 따라 두개골의 상단을 통해 아이리스 가위로 눈 사이에 잘​​라. 뼈 플레이트의 한면마다 기울 족집게로를 끼워 두정엽과 전두엽 뼈 플레이트를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 핀셋 앞쪽 부분에서 위쪽으로 머리를 기울 시신경 및 기타 두개골 신경을 잘라. 부드럽게 두개골에서 뇌를 들어 올립니다. </li></ol></li><li> 마우스 관상 뇌 매트릭스에 두뇌를 놓습니다. 깃털 면도날 3 약 4mm 조각으로 뇌를 슬라이스. </li><li> 4 % PFA 솔루션에 슬라이스를 전송하고 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 전송 뇌조각-DEPC 처리 20 %에게 자당 용액을 4 ℃에서 O / N을 배양하기 </li><li> 마른 cryomould에 각각의 뇌 조각을 배치, 최적의 절삭 온도 OCT () 매체를 둘러싸고 드라이 아이스에 고정. -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 3. 냉동 절편 <ol><li> 그라 이오 스탯에 냉동 조직의 15 μm의 섹션을 잘라 현미경 슬라이드에 섹션을 수집합니다. 필요한 경우, DEPC 처리 된 PBS로 섹션을 적시고 미세 페인트 브러시로 평평. </li><li> 조직 슬라이드에 부착되도록 약 1 시간 동안 건조 슬라이드를 둡니다. </li></ol> 4. 하이브리드 <ol><li> 65 ° C의 세척 완충액 준비 : 150 mM의 염화나트륨을, 15 mM의 나트륨 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1X 식염수 시트르산 나트륨), 50 % (V / V) 포름 아마이드, 0.1 % (v / v)의 Tween- 20. </li><li> 100 mM의 말레 산, 150 mM의 NaCl을, 0.1 % (v / v)의 트윈 20, pH가 7.5 : MABT 버퍼를 준비합니다. </li><li> DIG 표지 및 FITC - 라벨 씨 (두 개의 프로브를 희석d)에 하이브리드 버퍼에 1 / 1,000 65 ° C로 미리 예열 잘 섞는다. </li><li> 각 슬라이드, coverslipwith 오븐에서 구운 (200 O를 C) 커버 슬립에 하이브리드 혼합물의 약 300 μl를 적용하고 가습 챔버에서 65 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 미리 예열 세척 버퍼를 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 전송합니다. 세척 버퍼와 65 ° C에서 두 번 30 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> RT에서 10 분 동안 MABT로 3 회 슬라이드를 씻으십시오. </li></ol> FITC 프로브의 5 시각화 <ol><li> ISH 블로킹 버퍼를 준비한다 MABT을 2 % 차단 시약, 10 % 열 - 불 활성화 된 혈청 양. </li><li> 옵션 : 필요한 항체 용액의 부피를 감소하기 위해 슬라이드의 조직 섹션 주위 원을 그리 소수성 펜을 사용한다. </li><li> ISH는 가습 챔버에서 버퍼를 차단하여 실온에서 1 시간 동안 슬라이드를 품어. </li><li> 고추 냉이 퍼 옥시 다제 4 ° C (POD)에서 슬라이드 O / N을 품어 - 공액D 항 FITC 항체는 1/500 (v / v)로 ISH에 차단 버퍼를 희석. </li><li> 0.1 % (v / v)의 트윈 20 (PBST)와 PBS를 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 놓습니다. 때마다 PBST에서 10 분간 3 회 세척하고 신선한 PBST로 교체합니다. </li><li> 즉시 사용하기 전에 증폭 희석제로 100 배 희석하여 형광 tyramide을 준비합니다. 이 예를 들어, FITC-tyramide를 사용합니다. </li><li> 슬라이드에이를 추가하고 실온에서 10 분 동안 둡니다. </li><li> 코 플린 항아리에 슬라이드를 놓고 10 분 동안 PBST로 3 회 씻는다. </li></ol> 발굴 프로브 6. 시각화 <ol><li> 0.1 M 트리스 염산의 pH 8.2을 준비합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 ISH 차단 버퍼와 슬라이드를 품어. </li><li> 알칼리 포스파타제 (AP)와 4 ° C에서 슬라이드 O / N을 품어 희석 1 / 1,500 (v / v)로 ISH에 차단 버퍼 항 DIG 항체를 π 공역 계. </li><li> 10 분 3 회 MABT로 씻으십시오. </li><li> RT에서 5 분 동안 0.1 M 트리스 - 염산 pH를 8.2로 두 번 씻으십시오. </li><li>즉시 사용하기 전에, 0.1 M 트리스 산도 8.2의 정제를 용해하여 빠른 레드 용액을 제조. 0.22 μm의 필터를 통해 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 가습 실에서 빠른 레드 용액으로 37 ° C에서 슬라이드를 품어. 최적의 발전을위한 시간 변화에 따라, 침전물의 형성을 모니터링하는 형광 현미경 슬라이드를 정기적으로 확인한다. 3 시간 - 예를 들어,이 후, 반응을 중지. </li><li> 10 분 3 회 PBST로 세척. </li></ol> 7. 면역 조직 화학 <ol><li> IHC 차단 버퍼를 준비 : 10 % PBST에 (차 항체 호스트에 다른 종의) (v / v)의 혈청을. </li><li> IHC는 습한 챔버에서 RT에서 1 시간 동안 블로킹 완충액으로 슬라이드 부화. </li><li> 차 항체를 준비 : (주 항체 호스트에 다른 종의) 5 % 혈청 PBST에 적절한 희석에 차 항체를 희석. 예를 들어, 1/400 (v / v)로 희석의 토끼 항 - Olig2 항체를 사용한다. </li><li>4 ° CO / N의 차 항체 용액에 품어. </li><li> 10 분 3 회 PBST로 세척. </li><li> 차 항체를 준비 :이 예를 들어 0.1 % (v / v)의 훽스트 33258. (다른 차 항체 호스트 종) 5 % PBST에 적절한 희석 (v / v)의 혈청을 형광 접합 된 이차 항체를 희석 1 / 1,000 (v / v)로 희석 차 항체 Alexa647 당나귀 항 - 토끼를 사용합니다. </li><li> 1 시간 동안 RT에서 이차 항체 용액에서 인큐베이션. </li><li> 10 분 3 회 PBST로 세척. </li></ol> 8. 실장 <ol><li> 부분적으로 실온에서 슬라이드를 건조하고, 형광 설치 매체를 탑재합니다. 빠른 레드 570 nm의, FITC에 대한 488 nm의, Olig2의 immunolabelling에 대한 647 nm의 훽스트 350 나노 미터 : 10 배에서 공 초점 현미경 다음, 20X 다음 여기 파장과 4 개의 채널을 사용하여 63X 목표를 이미지를 건조하고 슬라이드를 남겨주세요 . </li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 면역 염색 한 다음 현장 하이브리드의 이중 RNA에 대한 단계별 절차를 제공합니다. 우리는 ASPA 여러 뇌 영역에서 성숙한 희소 돌기 아교 세포에서 발현되는 것을 확인하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 이러한 다단 과정은 감도 영향을 미칠 수 있으므로 피해야한다 함정 많은 가능성이있다. 먼저, 전사 반응을위한 모든 솔루션 및 저장 버퍼의 RNase 부담 할 필요가있다. 둘째, cDNA를 템플릿의 선택은 중요하며 우리는 길이 약 1킬로바이트 템플릿을 선호합니다. 그것은 페놀 / 클로로포름 추출과 cDNA를 템플릿 정리 할 필요가 시험 관내 전사 전에 재를 침전. 또한, 프로브의 전사를 최적화 할 필요; 프로브가 충분한 양으로 생성되지 않은 경우, ISH의 품질을 감소시킬 것이다. 프로브의 품질을 아가 로스 겔에 검사에 의해 확인 될 수 있고, 양질 것템플릿 대역 (도 2)와 비...

중추 신경계 (CNS)에서 가장 풍부한 세포 인 아교 세포, 희소 돌기 아교 세포 (CNS의 myelinating 세포), 올리고 덴드로 사이트 전구체 (또한, &quot;NG2 세포&quot;라고도 OPS), 성상 세포 및 미세 아교 세포를 포함한다. 신경 질환 1 아교 세포의 잠재적 역할의 기능에 관심이 증가하고있다. 예를 들어, Canavan 질환 (CD)는 일반적으로 나이 2,3 10 년 전에 사망에 이르는 초기 해면상 leukodystrophy과 뉴런의 진보적 인 손실과 초기 단계에서 시작하는 유전 신경 퇴행성 질환이다. 리드 Aspartoacyclase (ASPA) 유전자의 돌연변이가 크게 CD에 ASPA 활동 (4)를 감소하기 위해이 확인되었다. ASPA는 N-acetylaspartate (NAA)의 탈 아세틸 화를 촉매 작용하는 효소, 높은 뇌에서 농축 분자 생성 아세테이트 및 아스파 5-7이다. 많은 CD 환자 인해 ASPA 교류 부족 NAA 높은 수준을 보여tivity. 일부 연구 NAA 파생 아세테이트 개발 과정에서 지방산 / 뇌 지질의 주요 원인이 될 수 있고 -3,5,6- 세분화 할 NAA의 실패로 인한 개발 기간 동안 수초 합성을 감소에서 CD가 발생할 수 있음을 추측. ASPA는 주로 뇌의 신장, 간, 흰색 만에 발견하고, CD에 ASPA의 중요한 역할을 주어 뇌에서이 효소의 세포 발현은 여러 실험실에 의해 연구되고있다. 뇌의 ASPA의 효소 활성을 조사하여 이전 연구는 두뇌 개발하는 동안 ASPA 활동의 증가가 수초 8 ~ 10 시간 과정 평행 한 것으로 나타났습니다. 세포 수준에서 효소 활동뿐만 아니라 현장 하이브리드 (ISH) 및 면역 조직 화학 (IHC)의 분석은 ASPA는 주로 뇌에 있지만 뉴런 또는 성상 세포 11-16에서 희소 돌기 아교 세포로 표현하는 것이 좋습니다 분석. 몇몇 연구는 발견 ASPA는 수도중추 신경계 (12, 14)의 미세 아교 세포에서 발현 될 수있다. OPS에서 ASPA 식에 지금까지 데이터는 제한되어 있습니다. 신경 세포, 성상 세포, OPS, 새로 형성된 희소 돌기 아교 세포, myelinating 희소 돌기 아교 세포, 미세 아교 세포, 내피 세포 및 혈관 주위 세포를 포함하는 마우스 대뇌 피질의 다른 세포 유형의 전 사체는 RNA 시퀀싱 (17)에 의해 분석 하였다 최근의 연구에 따르면, ASPA는 독점적으로 희소 돌기 아교 세포로 표현된다 , 희소 돌기 아교 세포를 myelinating에서 특히 (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). 뇌의 ASPA 발현 패턴이 연구에도 불구하고, 불확실성이 남아있다. 다른 기술은 유전자 발현 패턴을 연구하는데 사용될 수있다. IHC는 조직 절편의 유전자 발현 기능성 제품 (즉, 단백질)을 검출하기위한 일반적으로 사용되는 방법이다. 해당 응용 프로그램과 특이성이 될 t만큼의 큰 유틸리티에도 불구하고,이 기술은 한계가있다필요한 항체의 가용성 특이 O. 대조적으로, ISH는 mRNA의 수준에서 어떤 유전자의 발현을 표시 할 수 있다는 이점을 갖는다. 그러나, 특정한 세포 유형으로 유전자 발현을 지역화 위하여 동시에 여러 개의 프로브를 사용하는 것이 기술적으로 어려울 수있다. 이 글에서, 우리는 단백질의 형광 immunolabelling와 현장 하이브리드 이중 형광 RNA를 결합하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 마우스 뇌 ASPA의 발현 패턴을 조사하는 기술이 세트를 사용 해왔다. 이 방법은 공 촛점 현미경을 사용하여 유전자 발현의 정확한 연구를 허용한다.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>ISH 차단 완충액용</td><td>탈이온화 포름아미드</td><td>Sigma</td><td>F9037</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 무수</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 이수화물</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>효모 tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt의 솔루션</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 설페이트</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA 클론</td><td>출처 : 생명 과학</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>평형 페놀</td><td>시그마</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>이소 아밀 알코올</td><td>알드리치</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR 국제</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합 효소</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>전사 버퍼</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP 믹스</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히</td><td>드 시그마</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Fisher 과학</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>디 에틸 피로 카보네이</td>트 <td>시그마</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25 게이지 바늘</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Cole-Parmer Instrument Co., Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>홍채 가위</td><td>, Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2 핀셋</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/microtome</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>시그마</td><td>S4641</td><td>for 65 &deg; C 세척 버퍼</td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>차단 시약</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 양 혈청</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>소수성 펜</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&alpha;-FITC POD 결합 항체</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&trade; 플러스 플루오레세인 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&alpha;-DIG AP-conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Fast red tablets</td><td>Roche</td><td>11496549001.22</td><td></td></tr> <tr><td>&micro; M 필터</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Olig2 토끼 개미</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647-conjugated &alpha;-rabbit antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 confocal 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 immunolabelling와 하이브리드

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

뇌 세포 등 뉴런, 아스트로 사이트, 올리고 덴드로 사이트, 희소 돌기 아교 세포 전구체와 미세 아교 세포의 종류에 유전자 발현의 검출은, 면역 특이 일차 또는 이차 항체의 부족에 의해 방해 될 수있다. 여기에서는 제 유전자에 의해 코드되는 단백질에 대해 지시 높은 특이성 항체로 면역 염색 한 다음 두 개의 유전자 특이 적 프로브 계내 혼성화 더블 형광을 사용하여 같은 뇌 섹션 세 가지 유전자의 발현을 검출하는 프로토콜을 기술한다. Aspartoacyclase (ASPA) 유전자의 돌연변이가 드문 인간의 백질 질환으로 이어질 수 - Canavan 질환은 - 희소 돌기 아교 세포 및 미세 아교 세포에 있지만 성상 세포 및 신경 세포에서 발현되는 것으로 생각된다. 그러나, 뇌에서 ASPA의 정확한 발현 패턴이 확립되어야한다. 이 프로토콜은 ASPA 성숙 희소 돌기 아교 세포 (a)의 부분 집합으로 표현되어 있는지 결정하기 위해 우리를 허용 한ND는 일반적으로 유전자 발현 연구 패턴의 넓은 범위에 적용될 수있다.

이 문서에서는 마우스의 뇌 부분에서 immunolabelling 다음에 이중 형광 ISH하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 간단한 설명은 첫 번째 단계는 ASPA 및 MBP (마이 엘린 기초 단백질)에 대한 특이 프로브를 합성 하였다도 1에 도시되어있다. 프로브가 합성되었다는 것을 확인하려면, 각 반응의 작은 나누어은 아가로 오스 겔에서 실행되었다. 희미한 선형 주형 및 RNA 프로브 다량 (도 2)을 볼 수있다. Olig2의 immunolabelling 및 훽스트 (Hoechst) 핵 염색 한 다음 ASPA와 MBP에 대한 이중 형광 ISH는, 마우스의 뇌 부분에서 수행되었다. 우리는 공 초점 레이저 주사 현미경 뇌 섹션을 스캔하고, 뇌에서의 유전자 발현 신호의 분포를 나타 내기 위해 함께 이미지를 스티칭. ASPA ...

특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

본 실험의 전반적인 목표는 이중 형광 인시튜 하이브리다이제이션(double fluorescence in situ hybridization)과 이후의 면역염색법을 사용하여 뇌 절편 내 세 가지 서로 다른 유전자의 발현을 동시에 검출하는 것입니다. 이 방법은 '내 관심 유전자를 어떤 세포 유형이 발현하는가?'와 같이 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 유전자의 발현 위치를 특정 세포 유형으로 국소화하기 위해 해당 유전자에 대한 우수한 항체가 반드시 필요하지 않다는 점입니다.이 절차를 요약하면, 첫째 날에는 고정된 조직 절편을 절단하고 두 종류의 서로 다른 표지 RNA 프로브와 함께 밤새 하이브리드화합니다. 둘째 날에는 FITC 표지 프로브를 표적으로 하는 항체와 함께 절편을 밤새 배양합니다. 이 항체는 horseradish peroxidase와 결합되어 있으며, 셋째 날에 형광 Tyramide의 첨가를 촉매합니다.그 다음, DIG가 표지된 프로브를 표적으로 하기 위해 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase)가 접합된 항체를 사용합니다. 4일 차에, 이 효소는 Fast Red 용액과 함께 배양될 때 형광 침전물 형성을 촉매합니다. 그 후, 절편을 표적 단백질에 특이적인 1차 항체와 함께 밤새 배양합니다.마지막으로, 5일째에 형광체 결합 2차 항체를 사용하여 이 단백질을 시각화합니다. 이 절차를 시작하려면, RNA 폴리머라제 프로모터가 포함된 플라스미드 내에 관심 유전자의 cDNA 서열이 포함된 DNA 클론을 선택하십시오. 다음으로, 해당 DNA 클론을 배양하고, 소규모 플라스미드 정제 키트로 플라스미드를 추출한 후, T7 및 SP6 범용 프라이머를 사용하여 서열을 분석합니다.cDNA 센스 가닥의 5' 말단을 절단하는 제한 효소로 10~20 µg의 플라스미드 DNA를 소화시킵니다. 37 °C에서 1.5시간 동안 배양합니다. 그 다음, 소량의 시료를 아가로스 겔에서 전기영동하여 플라스미드가 완전히 선형화되었는지 확인합니다.선형화된 플라스미드를 정제하려면, 3 M sodium acetate를 부피의 1/10만큼 추가하고, 10 mM Tris-HCl로 평형을 맞춘 phenol 1부피와 chloroform isoamyl alcohol 1부피를 추가합니다. 상온에서 16,000 Gs로 1분간 원심분리한 후 상층의 수용액 층을 추출합니다. 그런 다음 chloroform IAA 1부피를 추가합니다.16,000 Gs에서 1분간 원심분리한 후 상층의 수용액 층을 추출합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 그 다음, 에탄올을 2배 부피로 첨가하고 -20 °C에서 1시간 또는 하룻밤 동안 보관합니다.그 후, 4°C에서 16,000 Gs로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고, 펠릿을 70% 차가운 에탄올로 세척합니다. 그런 다음 2.5 µL당 1 µg의 cDNA 농도로 TE에 다시 현탁합니다.두 가지 프로브를 합성하려면, 먼저 적절한 RNA polymerase를 선택하십시오. 그런 다음, 시험관 내 전사(in vitro transcription) 반응액을 준비하고, DEPC 처리된 물을 사용하여 최종 부피를 20 µL로 맞춥니다. 37 °C에서 1.5시간 동안 배양하십시오.그 후, 전사 반응이 제대로 이루어졌는지 확인하기 위해 전사 반응물 1 µL를 1% agarose 겔에서 전기영동합니다. 겔 상에서는 선형 템플릿과 프로브의 밝은 밴드가 나타나야 합니다. 이 과정에서, 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 냉동 조직을 15 µm 두께로 절편합니다.절편들을 현미경 슬라이드 위에 올리고, 조직이 슬라이드에 잘 부착되도록 한 시간 동안 건조시킵니다. 이 과정이 성공적으로 수행되기 위한 가장 중요한 요인은 절편의 품질입니다. 이는 부분적으로는 충분히 관류 및 고정된 조직을 사용하는 것에 달려 있으며, 다른 부분으로는 RNase 오염이 없고 평평한 절편을 얻기 위한 절편 제작 기술에 달려 있습니다.그런 다음, 65 °C로 예열한 하이브리다이제이션 버퍼에 두 프로브를 희석하고 잘 섞습니다. 각 슬라이드에 하이브리다이제이션 혼합물 300 µL를 도포하고, 오븐에서 구운 커버슬립으로 덮습니다. 이어서 슬라이드를 가습 챔버 내 65 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 슬라이드를 미리 데워둔 세척 버퍼가 담긴 Coplin jar로 옮기고, 65 °C에서 30분 동안 두 번 세척합니다. 그 후, 상온에서 MABT 세척 용액으로 10분 동안 세 번 세척합니다. 이 단계에서 소수성 펜을 사용하여 조직 절편 주위에 원을 그립니다.그 다음, 습윤 챔버에서 ISH 블로킹 버퍼와 함께 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이어서, horseradish peroxidized 결합 anti-fitc 항체와 함께 슬라이드를 4 degrees Celcius에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음, PBST가 들어 있는 coplin jar에 슬라이드를 넣습니다.PBST로 10분씩 3회 세척하며, 매회 새로운 PBST로 교체합니다. 그 후, 슬라이드에 형광 tiromide를 첨가하고 실온에서 10분 동안 방치합니다. 슬라이드를 코플린 자(coplin jar)에 넣고 PBST로 10분씩 3회 세척합니다.이어서, 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 ISH 블로킹 버퍼로 배양합니다. 그다음, 알칼리성 인산분해효소가 접합된 anti-dig 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 슬라이드를 배양합니다. 그 후, MABT로 10분씩 3회 세척합니다.다음으로, 실온에서 5분 동안 pH 8.2의 0.1 molar tris HCL로 슬라이드를 두 번 세척합니다. fast red 용액을 여과한 후, 가습 챔버 내에서 fast red 용액과 함께 슬라이드를 37 degrees Celcius에서 배양합니다. 최적의 발색 시간은 달라질 수 있으므로, 형광 현미경으로 슬라이드를 정기적으로 확인하여 침전물 형성을 모니터링하십시오.그런 다음, PBST로 10분씩 3회 세척합니다. 면역조직화학 염색을 수행하려면, 습윤 챔버 내의 실온에서 IHC 블로킹 버퍼와 함께 슬라이드를 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체 용액에 슬라이드를 넣어 배양합니다.다음 날, 슬라이드를 PBST로 10분 동안 세 번 세척합니다. 상온에서 2차 항체 용액에 한 시간 동안 반응시킵니다. 그 후, PBST로 10분씩 세 번 세척합니다.그 후, 슬라이드를 실온에서 부분적으로 건조시킨 다음 형광 마운팅 매질로 마운팅합니다. 공초점 현미경으로 이미징하기 전까지 슬라이드를 건조시킵니다. 여기에는 Aspa 및 Mbp에 대한 ISH 대표 이미지와, 후크 염색(hook-staining)과 결합된 OLIG2 면역 염색 결과가 나타나 있습니다.Aspa는 피질과 뇌량의 일부 MBP 양성 OLIG2 양성 세포에서 발현되었습니다. 일부 Mbp 양성 OLIG2 양성 세포는 Aspa를 발현하지 않습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 슬라이스와 모든 용액이 RNase 오염으로부터 자유로운 상태로 유지하는 것이 중요합니다.본 영상을 시청한 후에는 N-citrine 억제 및 면역조직화학법을 통해 유전자 발현 패턴을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 다양한 기원과 발달 단계의 여러 조직에 맞게 조정하여 적용할 수 있습니다.

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 아닌 방사성을...

더블 형광 현장에서</em신선한 두뇌 섹션> 하이브 리다이 제이션

마우스 조직에서 데이터 수집을 최대화하기 위해 다양한 기술의 조합이 제공됩니다.

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

출처: Jolly, S., et.al. 이중 형광 In situ hybridization과 면역 라벨링을 결합하여 마우스 뇌 섹션에서 3개의 유전자 발현을 검출합니다. J. Vis. 특급 (2016). 이 비디오는 이중 형광 in situ hybridization을 사용하여 마우스 뇌 섹션에서 두 RNA 표적의 발현을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 사용하여 RNA를 순차적으로 검출한 다음 효소 신호 증폭을 통해 감도를 향상시키는 것을 포함합니다. 그 결과 생성된 형광은 조직 내 표적 RNA의 공동 국소화 분석을 가능하게 합니다.

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections(쥐 뇌 절편에서 유전자 발현을 검출하기 위한 이중 형광 혼성화)

출처: Baleriola, J., et. al., Detection of Axonally localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization(고해상도 현장 혼성화를 사용한 뇌 절편에서 축삭 국소화 mRNA 검출).  J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 형광 현장 혼성화 및 항체 염색을 사용하여 고정 마우스 해마 절편의 콜린성 축삭 내에서 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 콜린성 뉴런에서 프로브 태그가 지정된 mRNA와 콜린 아세틸전이효소의 공간적 국소화를 보여줍니다.

Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization

이 입문 수준 프로토콜은 미세아교세포와 신경 요소에 대한 마커를 예로 들어 설치류 뇌의 면역조직화학적 염색을 완료하는 데 필요한 시약, 장비 및 기술을 설명합니다.

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

이 프로토콜은 마우스 뇌 조직에서 말초 골수성 세포 침투뿐만 아니라 미세 교졸 밀도, 분포 및 형태학의 분석 뿐만 아니라 IBA1 및 TMEM19의 면역 형광 유행성 화에 대한 단계별 워크플로우를 설명합니다.

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.

성인 마우스 뇌에서 유도성 형광 표지 줄기 세포의 계보 추적

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

배우세요 마우스 뇌 조직에서 더블 형광 현장 하이브리드화와 면역염색을 결합하여 세 가지 유전자 발현을 동시에 검출하는 방법입니다. 이 기술은 특정 항체가 없어도 유전자 발현을 세포 유형별로 정확히 규명할 수 있습니다.

더블 형광 결합

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